CN116041697B 一种用于核酸递送的树枝状大分子化合物、组合物及其制备方法与应用 （山东大学）

一种用于核酸递送的树枝状大分子化合物、本发明提供一种用于核酸递送的树枝状大明树枝状大分子化合物的制备步骤和操作步骤治疗剂(如治疗性核酸)的基于树枝状大分子的2所述乙二胺核聚酰胺胺型0代树枝状大分子具有如下所示结构：2环氧十二烷或1，2环氧十四烷；所述丙烯酸酯为丙烯酸十二烷基酯或丙烯酸十四烷基所述脂质组分为结构脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质的组合；所述结构脂质选自35.根据权利要求4所述基于树枝状大分子的脂质纳米颗粒组合物的制备方法，其特征在涡旋条件下，将混合液滴入至pH为5_6的醋酸钠缓冲溶液中得到树枝状大分子化合物溶液；混合液中，树枝状大分子化合物的浓度为80_120mg/mL；醋酸钠缓冲溶液的浓度为4[0004]现有技术中已有关于树枝状大分子应用于生物医学的报道。如，中国专利文献[0005]针对现有技术存在的不足，本发明提供一种用于核酸递送的树枝状大分子化合56[0020]上述用于核酸递送的树枝状大分子化合物在具有预防性或治疗性的核酸递送载[0022]根据本发明优选的，所述具有预防性或治疗性的核酸选自信使RNA(mRNA)、微小[0024]根据本发明优选的，所述树枝状大分子化合物选自式I或式II中的一种或两种以[0026]根据本发明优选的，所述基于树枝状大分子的脂质纳米颗粒组合物的粒径为[0038]优选的，树枝状大分子化合物溶液中，7[0042]上述用于核酸递送的树枝状大分子化合物或基于树枝状大分子的脂质纳米颗粒[0044]上述用于核酸递送的树枝状大分子化合物或基于树枝状大分子的脂质纳米颗粒8状大分子化合物按实施例6的方法制备脂质纳米颗粒组合物，并递送EGFPsiRNA到Hela_[0054]6、本发明基于树枝状大分子的脂质纳米颗粒组合物(DLNP)通过靶向递送核酸到稳定性。本发明脂质组分及和树枝状大分子化合物的配比关系对于转染效果具有一定影[0055]图1为树枝状大分子乙二胺核_聚酰胺_胺型0代树枝状大分子(PAMAM_G0)的1H_9标为ζ_电位。[0069]图15为实施例6中脂质纳米颗粒组合物与HeLa_GFP细胞共培养后，细胞中EGFP的[0070]图16为实施例6中脂质纳米颗粒组合物与HeLa_GFP细胞共培养后，细胞中EGFP的[0071]图17为实施例7中脂质纳米颗粒组合物与HeLa细胞共培养后，细胞中EGFP的基因[0072]图18为实施例7中脂质纳米颗粒组合物与HeLa细胞共培养后，细胞中EGFP的荧光[0073]图19为实施例8中尾静脉注射PAMAM_G0_O14/siRNA、PAMAM_G0_O14[0076]图22为实施例9中静脉注射G0_O12/mLuc、G0_O14/mLuc、G0_A12/mLuc和G0_A14/[0079]图25为实施例11中静脉注射用荧光分子DIR标记的G0_O12/mRNA、G0_O14/mRNA4h[0080]图26为实施例11中静脉注射用荧光分子DIR标记的G0_A12/mRNA、G0_A14/mRNA4h[0081]图27为实施例11中静脉注射用荧光分子DIR标记的G0_O12/mRNA、G0_O14/mRNA、[0082]图28为实施例12中治疗后小鼠肝脏组织中Col1a1mRNA的表达。纵坐标为肝脏中[0083]图29为实施例13中尾静脉注射G0_O14/mhEPO6h后，通过ELISA实验定量血清中[0092]产物PAMAM_G0_On的1H_NMR谱图如图2_图6所示，同时还表征了化合物PAMAM_G0，[0095]将树枝状大分子化合物(实施例1或实施例2制备的树枝状大分子化合物中的一[0096]将上述得到的组合物于马尔文公司的Zetasizernano仪器上使用标准检测方法进知树枝状大分子化合物和脂质组分的组合物的水合粒径均在80_250nm之间。除了G0_O6的大分子化合物和脂质组分的组合物更容易通过静电作用[0099]将树枝状大分子化合物(实施例1或实施例2制备的树枝状大分子化合物中的一[0100]增强绿色荧光蛋白特异性siRNA(Enhancedgreenfluorescentprotein[0101]将上述树枝状大分子化合物和脂质组分的组合物和siRNA溶液混合均匀(树枝状Zetasizernano仪器上使用标准检测方法对上述基于树枝状大分子的脂质纳米颗粒组合物[0103]本实施例所制备得到的基于树枝状大分子的脂质纳米颗粒组合物粒径检测结果[0104]由图可知基于树枝状大分子的脂质纳米颗粒组合物(DLNP)的水合粒径均在120_[0107]将树枝状大分子化合物(实施例1或实施例2制备的树枝状大分子化合物中的一[0108]增强绿色荧光蛋白特异性mRNA(Enhancedgreenfluorescentprotein[0109]将上述树枝状大分子化合物和脂质组分的组合物和mRNA溶液混合均匀(树枝状大Zetasizernano仪器上使用标准检测方法对上述基于树枝状大分子的脂质纳米颗粒组合物[0111]本实施例所制备得到的基于树枝状大分子的脂质纳米颗粒组合物粒径检测结果[0112]由图可知基于树枝状大分子的脂质纳米颗粒组合物(DLNP)的水合粒径均在90_280nm之间。mRNA分子带负电，但树枝状大分子化合物和脂质组分的组合物与之结合后，DLNP的ζ_电位还是正的，这可能是因为树枝状大分子化合物和脂质组分的组合物和两种[0116]增强绿色荧光蛋白特异性siRNA(Enhancedgreenfluorescentprotein[0117]将上述树枝状大分子化合物和脂质组分的组合物和siRNA溶液混合均匀(树枝状的醋酸钠缓冲液稀释5倍，得到基于载体样品的脂质纳米颗粒组合物(简称G0_On/siRNA或颗粒组合物(加入量约为50μL/mL细胞溶液)，在此条件下(37℃)进行转染48h。测试体外[0121]通过细胞中EGFP基因沉默的多少来评价siRNA的体外递送效率，不同递送载体的体外siRNA递送效率测试结果见图15及荧光[0122]图15表明G0_O14、G0_A14和G0_A12递送siRNA的沉默效果明显优于市售阳性对照试剂RNAiMAX。从图16中也可以看出加入G0_O14/siRNA、G0_A14/siRNA和G0_A12/siRNA的上所述，本发明合成的树枝状大分子PAMAM_G0_On和PAMAM_G0_An可以作为siRNA的递送载[0126]增强绿色荧光蛋白mRNA(EnhancedgreenfluorescentproteinmRNA,mEGFP)溶[0127]将上述树枝状大分子化合物和脂质组分的组合物和mRNA溶液混合均匀(树枝状大外mRNA递送效率测试结果见图17及荧光定量结果如效率明显优于市售阳性对照试剂RNAiMAX。从图18中可以看出加入G0_O12/mRNA、G0_O14/大分子PAMAM_G0_On和PAMAM_G0_An可以作为mRNA的递送载体且能达到优异的[0136]将肽基脯氨酰异构酶BsiRNA(peptidylprolylisomeraseBsiRNA，siPPIB)或[0139]选取8周龄的雌性C57小鼠，每只小鼠通过尾静脉取肝脏组织，从中提取RNA，将RNA逆转录成DNA，再通过实时荧光定量PCR仪(RealtimequantitativePCR,RT_qPCR)对细胞中GAPDH的基因沉默效[0141]从图19中可以看出注射PAMAM_G0_O14/siRNA48小时后，与注射PAMAM_G0_O14/siNC组的小鼠相比，注射不同剂量的PAMAM_G0_O14/siPPIB组小鼠体内PPIB基因表达明显[0144]将实施例1或2制备的载体样品(PAMAM_G0_O12、PAMAM_G0_O14、PAMAM_G0_A12或脏的荧光强度表达量从PAMAM_G0_O12到PAMAM_G0_O14和PAMAM_G0_A12到PAMAM_G0_A14都呈现递增的趋势，所以说树枝状大分子所修饰的链长对mRNA体内转染效果有着一定的影光分子DIR进行标记)分别溶于乙醇中，再按照比例(PAMAM_G0_O14、胆固醇、DOPE、DMG_[0154]增强绿色荧光蛋白特异性siRNA(Enhancedgreenfluorescentprotein[0157]选取8周龄的雌性C57小鼠，每只小鼠通过尾静脉G0_O14的脂质纳米颗粒组合物(注射的siRNA的剂量为0.6mg/kg)到小鼠体内；给药4小时后，解剖取器官(剖取的器官分别是心脏heart、肝脏liv[0161]将实施例1或2制备的载体样品(PAMAM_G0_O12、PAMAM_G0_O14、PAMAM_G0_A12或[0170]将前胶原蛋白α1(I)siRNA(procollagena1(I)siRNA，siCol1a1)或无序siRNA[0174]选取8周龄的雌性C57小鼠，每只小鼠通过尾静脉图28中可以看出相比于注射G0_O14/siNC组的小鼠，注射G0_O14/siCol1a1组的小鼠体内Col1a1基因表达明显降低，说明本发明所述的树枝状大分子具有优异的siRNA体内转染效[0179]将人促红细胞生成素(hEPO)mRNA溶解在无酶水中，得到浓度为1mg/mL的mRNA溶[0182]选取8周龄的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠通过尾静脉注射体积为0.2mL的基于鼠进行眼球取血，分离血清。通过酶联免疫吸附实验(Enzyme_linkedimmunosorbentassay,ELISA)对血清中hEPO蛋白质