番茄MADS-box基因 SlMBP3和SlMBP22的分子特征与表达分析

番茄MADS-box基因SlMBP3和SlMBP22的分子特征与表达分析摘要：MADS-box基因家族是一类转录调控因子，它在植物生长发育的各个阶段中发挥着重要作用。本实验以茄科植物番茄（SolanumLycopersicum）为实验材料,选取MADS-box基因家族中D类基因SlMBP3和SlMBP22基因进行研究。利用生物信息学的手段对其分子特征进行分析，结果显示，SlMBP3基因与SlMBP22基因都包含MADS-box基因的特征结构域：MADS_MEF2_like结构域和K-box结构域；通过番茄基因信息软件Genevestigator预测这两个基因在番茄中的表达模式，并通过实时定量PCR（qRT-PCR）实验进行验证，进而推测它们在番茄生长发育过程中的作用。实验发现，SlMBP3基因与SlMBP22基因仅心皮、果实中的表达，推测该基因可以调控心皮和胚珠的形成。关键词：番茄；MADS-box基因；D类基因；分子特征；表达模式

MolecularCharacteristicsandExpressionAnalysisofTomatoMADS-boxgenesSlMBP3andSlMBP22Abstract:The

MADS-box

gene

family

is

a

transcriptional

regulator

that

plays

an

important

role

in

various

stages

of

plant

growth

and

development.

In

this

experiment,

tomato

(Solanum

Lycopersicum)

from

Solanum

family

was

used

as

the

experimental

material,

and

class

D

genes

SlMBP3

and

SlMBP22

from

the

MADS-box

gene

family

were

selected

for

study.

The

molecular

characteristics

were

analyzed

by

means

of

bioinformatics,

and

the

results

showed

that

both

SlMBP3

and

SlMBP22

genes

contained

the

characteristic

domains

of

MADS_MEF2_like

and

k-box

genes.

Through

tomato

genetic

information

software

Genevestigator

predicted

the

two

gene

expression

patterns

in

the

tomato,

and

through

the

real-time

quantitative

PCR

(qRT

-

PCR)

experimental

verification,

to

assume

their

roles

in

the

process

of

tomato

growth

and

development.

It

was

found

that

SlMBP3

and

SlMBP22

genes

were

only

expressed

in

carpels

and

fruits,

suggesting

that

this

gene

could

regulate

the

formation

of

carpels

and

ovules.Keywords:Tomato;mads-boxgene;classDgene;molecularcharacteristics;expressionpattern

番茄MADS-box基因SlMBP3和SlMBP22的分子特征与表达分析1.前言1.1MADS-box基因家族概述 1.1.1MADS-box基因的命名MADS-box基因家族是一类序列高度保守的基因家族，其编码的蛋白质可以与特定的DNA序列特异性结合，促进或者抑制目的基因的转录表达，广泛分布于真核生物中。MADS-box基因家族最先发现了4个转录因子，分别为MCM1（酿酒酵母代谢调节因子）[1]、AGAMOUS（拟南芥花器官形成决定因子）[2]、DEFICIENNS（金鱼草花器官发育决定因子）[3]、SRF（人血清应答因子）[4]，这几个转录因子的N端都包含一段由50-60个氨基酸残基组成的保守结构域，因此各取其首字母将包含该保守结构域的基因命名为MADS-box基因，该保守结构域称为MADS结构域。1.1.2MADS-box基因家族分类及结构MADS-box蛋白分为TypeⅠ型与TypeⅡ型，其中TypeⅠ型只含有一个高度保守的SRF-likeMADS结构域，其在植物中的功能尚不清楚；TypeⅡ型又分为MIKC型与MEF2-like型MADS，其中MIKC型MADS-box蛋白主要存在于植物中。根据I结构域的不同，MIKC型MADS-box蛋白又可分为MIKCC型与MIKC*型，后者的功能尚不清楚，前者在植物的整个生长发育过程中起着非常重要的作用，可以调控开花时间、决定花分生组织和花器官特征以及调控根、叶、胚珠及果实的发育[5]。1.1.3MADS-box基因在花发育过程中的功能对于高等植物来说，花发育阶段是其生长发育过程中的重要阶段，是花器官发育的过程。双子叶植物的花主要由萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊（心皮）四部分组成，称为花的四轮结构。关于花发育调控的模型研究一直处于不断发展中，在研究模式生物拟南芥（Arabidopsisthaliana）与金鱼草（Antirrhinummajus）的过程中，Coeny与Meyerowitz提出了花发育的“ABC模型”假说[6]，即花器官发育是由A、B、C三类基因决定的。随着研究的深入，又相继发现了很多MADS-box基因，ABC模型无法解释的现象。Angenent等在矮牵牛（Petuniahybrida）中发现的FBP7基因与FBP11基因能够起到调控胎座和胚珠发育的作用，当这两个基因发生突变时，心皮状结构会取代胚珠。他认为这是一种不同于A、B、C类基因的新基因，并将这类基因归为D类基因[7]。在此基础上，形成了花发育的ABCD模型。后来又在拟南芥中发现SEP类基因能在不同花器官中控制花器官的发育，将其归为E类基因，如SEP1、SEP2、SEP3、SEP4基因等[8]，进而将ABCD模型发展为ABCDE模型。1.2本课题研究的意义目前，在高等植物中已经发现了大量的MADS-box蛋白，其对植物生长发育的调控也有了一定的进展，但主要的研究对象仍集中在模式生物拟南芥和水稻（Oryzasativa）上，对于果蔬植物中MADS-box蛋白的调控作用研究相对较少，而番茄作为果蔬植物的模式生物，其全基因组序列的测序完成为研究特定基因的功能提供支持。据现有研究，番茄中已筛选出了131个MADS-box基因，其中包含有15个可能的花器官特征基因[9]，本课题选择了其中的两个D类MADS-box基因SlMBP3与SlMBP22作为研究对象，利用在线生物学数据库对其进行分子特征分析，得出两个基因都具有Ⅱ型MADS-box基因家族的MADS_MEF2_like和K-box特征结构域；通过Genevestigator基因信息平台以及定量PCR实验进行表达模式预测分析，发现SlMBP3基因在心皮和果实中高量表达，进而推测SlMBP3基因可能参与调控心皮和胚珠的形成。本次试验针对D类MADS-box基因SlMBP3与SlMBP22进行分析研究，一定程度上丰富了番茄D类基因信息，为后续的研究提供一种新的途径。2.材料与方法2.1实验材料2.1.1植物材料本实验室培育的普通番茄AC++品系2.1.2试剂Trizol、液氮、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC处理水、琼脂糖凝胶电泳试剂、Oligo（dT）18（10µM）、Rnase-freeddH2O、5×M-MLVBuffer、dNTP混合物（10mM）、M-MLV逆转录酶、2×GoTaqqPCRMasterMix、引物混合物（10µM）、cDNA2.2实验仪器1.5mL离心管、研钵、移液管、电泳仪、移液枪、电泳仪、紫外分光光度计、电泳仪、PCR仪、荧光定量PCR仪、海尔4°C冰箱、海尔-80°C冰箱2.3SlMBP3基因与SlMBP22基因分子特征分析本实验通过各种生物信息学在线数据库对已知序列信息的SlMBP3基因与SlMBP22基因的分子特征进行分析。如在SGN数据库中查询序列注释信息，BLAST数据库中进行序列比对分析；ORFfinder中预测基因开放阅读框；ConservedDomains数据库查询基因保守结构域；SequenceAnalysis中查询基因组背景；ExPASy数据库分析基因的理化性质。具体分析方法见下表1：2.4SlMBP3基因与SlMBP22基因表达模式预测Affymetrix数据库（/technology/mip_technology.affx）中输入基因核苷酸序列查询基因同源探针号，将查找到的同源探针号输入番茄基因芯片平台Genevestigator的Affymetrix番茄基因组微阵列平台搜索，从而对基因的表达模式进行分析。2.5SlMBP3基因与SlMBP22基因实时定量PCR分析2.5.1植物材料收集选取实验室培育的生长环境相同普通番茄，摘取处于同一生长时期的新鲜萼片、花瓣、雄蕊和心皮作为实验材料，立即加入液氮，置于-80°C冰箱中冷冻保存。2.5.2实验方法（1）RNA的抽提及质检①将适量的萼片、花瓣、雄蕊、心皮分别置于预冷的研钵中，加入1mLTrizol试剂，边加入液氮边研磨，后静置5min。②将研磨后的混合液体倒入1.5mL的离心管中，使用移液枪加入200

µL氯仿，剧烈震荡混匀后室温下静置5min。4°C条件下12000r/min离心15min。③吸取无色的上清液移至另一个1.5mL的离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻混匀后静置10min。4°C条件下12000r/min离心10min,弃去上清液。④加入1000µL体积分数为75%的乙醇洗涤沉淀。4°C条件下12000r/min离心15min，室温下干燥。⑤加入适量DEPC处理水至沉淀完全溶解，进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分析测定。（2）cDNA的合成①以1.0

µgRNA为模板，在0.2mL的PCR管中配置反应溶液：②将PCR管置于PCR仪中，72°C预变性5min。将PCR管取出，冰浴5min。③变性结束后，加下列试剂混匀后加入PCR反应管中：④将PCR管置于PCR仪中进行反应，42°C保温60min。⑤72°C条件下灭火M-MLV反转录酶10min，-20°C保存备用。（3）SlMBP3基因与SlMBP22基因引物设计研究表明，在番茄的不同组织中，CAC基因都稳定表达[10]，因此，可将CAC基因作为内参基因。通过PrimerPremier5软件设计SlMBP3基因与SlMBP22基因的定量引物，引物序列如下：（4）实时荧光定量PCR分析①配制PCR反应体系②设置PCR仪荧光定量PCR循环程序：其中变性、退火、延伸3个过程循环40次，之后在72°C条件下延伸2min，结束后4°C保存。3.结果与分析3.1SlMBP3基因分子特征分析根据已知的SlMBP3基因的核苷酸序列以及氨基酸序列，通过各种生物学数据库及在线分析网站分析该基因的分子特征（见表2）。分析结果显示，SlMBP3基因（101249093/Solyc06g064840）位于6号染色体上，包含11个外显子，编码237个氨基酸，开放阅读框长度为714nt|237aa。经理化性质分析结果表明，SlMBP3基因编码的不稳定蛋白质，不稳定指数为58.96，分子量为27469.61Da，理论等电点（pI）为9.25。其中，有带负电荷的氨基酸残基(天冬氨酸+谷氨酸)总数为28个，占总氨基酸数量的11.8%，带正电荷的氨基酸残基(精氨酸+赖氨酸)总数为36个，占总氨基酸数量的15.2%。脂溶性指数为84.01，亲水性平均值(GRAVY)为-0.684。通过NCBI数据库ConservedDomainsSearch功能（CD-Search）搜索得到SlMBP3基因的保守结构域图（见图1），可以发现SlMBP3基因有两个MADS结构域，即MADS_MEF2_like和K-box。其中MADS_MEF2_like位于261-479bp区域，K-box位于501-773bp区域。图1SlMBP3基因的保守结构域Figure1ConserveddomainoftheSlMBP3gene图2SlMBP22基因的保守结构域Figure2ConserveddomainoftheSlMB22gene3.2SlMBP22基因分子特征分析根据已知的SlMBP22基因的核苷酸序列以及氨基酸序列，通过各种生物学数据库及在线分析网站分析该基因的分子特征（见表2）。根据分析结果，SlMBP22基因（101257917/Solyc11g005120）位于11号染色体上，包含8个外显子，编码238个氨基酸，开放阅读框长度为717nt|238aa。理化性质表明，SlMBP22基因编码的蛋白质属于不稳定蛋白质，其不稳定指数为52.34，分子量为27791.62Da，理论等电点(pI)为6.47，其中，带负电荷的氨基酸残基(天冬氨酸+谷氨酸)总数为33个，占总氨基酸数量的13.9%，带正电荷的氨基酸残基(精氨酸+赖氨酸)总数为31个，占总氨基酸数量的13%。脂溶性指数为77.06，亲水性平均值(GRAVY)为-0.785。采用同3.1同样的方法，得出SlMBP22基因的保守结构域图（见图2），发现SlMBP22基因与SlMBP3基因有相同的结构域，K-box结构域位于146-379bp，K-box结构域位于407-649bp区域。表1SlMBP3基因与SlMBP22基因分子特征分析方法Table1molecular

characteristics

analysis

methods

of

SlMBP3

gene

and

SlMBP22

gene3.3SlMBP3基因表达模式分析将从Affymetrix数据库中搜索得到的SlMBP3基因的同源探针LesAffx.37115.1.S1_at输入番茄基因信息平台Genevestigator中，利用其中的CONDITION

TOOL得到其表达谱数据图（A图为Anatomy图，B图为Development图），Anatomy图中显示SlMBP3基因在心皮和果实中表达量极高，Development图中显示番茄各生长阶段SlMBP3基因在果期表达水平最高，花期次之，苗期表达水平最低。AB图3番茄花器官特征基因SlMBP3基因的表达谱数据图Figure3ExpressionDataofTomatogeneSlMBP3expressionprofile通过qRT-PCR技术对番茄D类MADS-box基因SlMBP3表达水平进行验证。根据其表达模式图（图5）可发现，SlMBP3基因仅在雄蕊和心皮中特异性表达，且表达量在心皮中显著高于在雄蕊中，该结果表明SlMBP3基因可能调控心皮的发育。图5SlMBP3基因的表达模式图图6SlMBP22基因的表达模式图Figure5ExpressionpatternofSlMBP3Figure6ExpressionpatternofSlMBP22genegene3.4SlMBP22基因表达模式分析Affymetrix数据库尚未公布SlMBP22基因的探针信息，因此，仅通过qRT-PCR技术分析其表达水平。表达模式图（图6）显示，SlMBP22基因仅在雄蕊和心皮中特异性表达，且表达量在心皮中显著高于在雄蕊中，结果表明SlMBP22基因可能调控心皮的发育。4.结论与讨论番茄，别称西红柿，属于茄科番茄属草本植物，原产于南美洲，现已在全球广泛栽培。目前，对于高等植物MADS-box基因的研究多集中于模式植物、粮食作物以及水果中，对于果蔬植物的研究较少。而随着番茄全基因组序列的测序完成，番茄已经成为果蔬植物中的模式植物被最早研究。但是，对于番茄MADS-box基因的研究多针对C类基因，对于D类基因的信息了解的相对较少。

本次研究对番茄的D类MADS-box基因SlMBP3与SlMBP22的分子特征以及SlMBP3基因的表达模式进行分析。分子特征分析结果显示，这两种基因MADS-box基因家族所特有的MADS_MEF2_like结构域和K-box结构域；Genevestigator软件分析结果显示，SlMBP3基因的表达量在番茄各组织中存在明显差异，在心皮与果实中高量表达，且表达量在果期高于花期，通过实时荧光定量PCR实验验证结果与其预测分析相符；SlMBP22基因的实时荧光定量PCR结果表明其在心皮中表达量极高。推测这两个基因皆参与了心皮与胚珠的发育调控，在番茄的生殖阶段起到重要作用。综上所述，D类MADS-box基因参与高等植物心皮和胚珠的形成这一结论在番茄中仍旧适用。胚珠是植物子房内着生的卵形结构，在生长发育后期会形成种子，研究胚珠的发育具有十分重要的意义。从进化起源来看，胚珠是高等植物花的内部器官，可以看作花的第五轮器官[11]。Pinyopich等以拟南芥为实验材料，发现其AG类基因STK、SHP1、SHP2与AG基因共同调控胚珠的发育[12]，SHP1与SHP2共同控制雌蕊与胚珠的形成[13]；风信子（Hyacinthusorientalis）中的HoMADS1基因调控心皮和胚珠的发育，HoMADS1过度表达会形成完整的胚珠[14]；百合（Liliumbrownli）中的LMADS2基因与EgMADS1基因在胚珠中都高量表达，且EgMADS1基因仅在胚珠中表达[15]；水稻中的OsMADS13基因与矮牵牛的FBP7基因和FBP11基因序列同源性很高，在水稻胚珠与种子的发育过程中起到了重要作用[16];冉国栋从无核葡萄的cDNA文库中克隆得到一个D类MADS-box基因VvMADS3，无核葡萄胚珠败育前后胚珠中该基因表达量差异较大，推测该基因与胚珠的败育有关[17];草原龙胆（Eustomagrandiflorum）中的克隆出EgMADS1基因仅在雌蕊和胚珠中有表达，且与矮牵牛中的FBP7基因与FBP11基因有很高的同源性，推测EgMADS1基因在草原龙胆中起到D类基因的作用[18]。综上所述，D类MADS-box基因参与调节高等植物心皮和胚珠的形成过程。

本次研究针对番茄D类MADS-box基因SlMBP3与SlMBP22进行研究,但由于SlMBP22基因的探针尚未公布，对于SlMBP22基因的表达水平并未进行，仅是利用qRT-PCR技术序列同源性比对证明其与SlMBP3基因同为番茄D类MADS-box基因，推测其也参与了番茄的心皮以及胚珠的发育。因此，继续研究番茄基因的详细信息是接下来继续研究的主要方向之一。

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M.,

Borges

A.

A.,

Borges-Perez

A.,

et

al.

Selection

of

internal

control

genes

for

quantitative

real-time

RT-PCR

studies

during

tomato

development

process