番茄组织培养愈伤组织诱导研究

番茄组织培养愈伤组织诱导研究CALLUSINDUCTIONINTOMATOTISSUECULTUREQUAN

目录摘要 1关键词 1TOC\o"1-3"\h\u1前言 番茄组织培养愈伤组织诱导研究学生：文嘉伟指导老师：刘清波(湖南农业大学生物科学技术学院，长沙410128)摘要：本实验以番茄种子为外植体，以优化番茄离体培养再生体系，减少褐变等问题发生为主要任务。利用无菌番茄苗下胚轴和子叶开展组织培养诱导愈伤组织试验，为番茄遗传转化提供基础。结果表明，在番茄子叶诱导中，添加2.0mg/L的6-BA与0.4mg/L的NAA激素的MS培养基为最适培养基。在番茄下胚轴愈伤组织诱导中，以添加2.0mg/L的6-BA与0.2mg/L的NAA激素的MS培养基为最适培养基。关键词：番茄，愈伤组织诱导，消毒，激素配比CallusInductioninTomatoTissueCultureStudent:WenJiaweiInstructor:LiuQingbo(CollegeofBiologicalScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128)Abstract:Thisexperimentwilltakeoptimizingtomatoseeds,optimizingtomatoplantregenerationsystemandreducingbrowningasthemaintasks.Therefore,thisstudyplanstocarryouttissueculturetestsonhypocotylsandcotyledonsoftomatoandconstructtomatoplantregenerationsystemtoprovidebasisforgenetictransformationoftomato.Intheinductionoftomatocotyledons,MSmediumsupplementedwith2.0mg/Lof6-BAand0.4mg/LofNAAhormonewastheoptimalmedium.Incallusinductionoftomatostemsegments,MSmediumsupplementedwith2.0mg/Lof6-BAand0.2mg/LofNAAhormonewastheoptimalmedium.Keywords:tomato,callusinduction,disinfection,hormoneratio1前言1.1番茄简介番茄（Lycopersiconesculentum），又名西红柿。茄科番茄属一年生或多年生草本植物，包括有限生长型、半有限生长型和无限生长型。原产南美洲，现全世界广泛栽培。果实营养丰富，具特殊风味，可以生食、煮食、加工番茄酱、汁或整果罐藏。番茄体高0.6-2米，全体生粘质腺毛，有强烈气味，茎为半直立性或半蔓性，易倒伏，高0.7～1.0m或1.0～1.3m不等，叶羽状复叶或羽状深裂，花序总梗长2-5厘米，常3-7朵花，花萼辐状，花冠辐状，浆果扁球状或近球状，肉质而多汁液，种子黄色，花果期夏秋季。番茄的根系发达，分布广而深，发根力强，茎部易生不定根，移栽容易，亦可行扦插繁殖。最早生长于南美洲，因为色彩娇艳，人们对它十分警惕，视为“狐狸的果实”，又称狼桃，只供观赏，不敢品尝。而今它却是人们日常生活中不可缺少的美味佳品，它不但能补充大量人体需要的元素，同时也可以制作沙拉供人们品尝。番茄喜温，不喜冷凉，生长适温为20℃～25℃，在低于10℃时，大多数的番茄品种的生长发育受阻生长变缓，在低于5℃的环境下，可表现出明显的冷害症状如黄化、萎蔫、局部坏死、叶片数减少或者生长完全停止等现象[1,2]。1.2番茄体内营养成分及功能研究番茄植物果实体内富含有胡萝卜素、维生素、番茄红素、芦丁、蛋白质以及钙等营养物质[3-5]。其中番茄红素有着独特且极其重要的抗氧化能力，能够清除我们人体内的部分自由基，保护细胞，使得我们体内的脱氧核糖核酸不易受到破坏，进而可以阻止细胞癌变的进程，可以有效的减少胰腺癌、喉癌、乳腺癌、前列腺癌、口腔癌、直肠癌等癌症的发病危险。维生素、叶黄素等营养物质可以有效的预防夜盲症、白内障等眼科疾病，可以帮助我们保护眼睛，改善视力。芦丁对预防高血压，保护血管健康有着不可忽视的作用。番茄体内含有的铬元素能够有效的控制血糖，而且其本身含糖量低，糖尿病患者可以常吃番茄来改善身体。钙质、维生素K等营养保健成分可以帮助身体保健骨骼。此外，在番茄体内还存在着能够有助于缓解炎症所引起的疼痛的生物类黄酮等消炎成分，可以作为药物之外的辅助性食材为病人提供帮助。1.3番茄的市场价值番茄它本身口感粉糯、汁水酸甜、生津开胃、风味上佳，且做法多样，生吃烹饪都极佳，因此深受人们喜爱，在现代人们的日常饮食中占据着极其重要的作用。因此番茄被认定具有很高的经济价值以及广泛的市场前景[6]。而在近些年，随着养生概念的不断兴起，人们对于绿色且美味的食材需求不断走高，而番茄作为已发展并分布于世界不同地区，全世界年产量最高的30种农作物之一的食材，价格也在不断轻微波动中持续稳定的上涨。在市场方面有着很好的前景。1.4番茄组织培养研究现状在植物组织培养过程中，国内外关于这方面的研究已有很多，而研究表明，受到番茄基因型，外植体类型以及农杆菌侵染浓度及时间，和培养条件等因素的影响，研究结果也不尽相同[7,8,9,10,11]。植物外植体包括子叶、下胚轴及子叶柄等，而且实验中选择用下胚轴与子叶作为外植体的占多数。在不同的再生体系中，不同种类外植体的再生率也各不相同。大量的研究表明，番茄子叶的接种部位子叶中部效果最佳，而子叶柄和下胚轴次之。张建民表明，番茄的茎段再生效率比子叶要强，茎段是子叶的3到4倍[12]。苏彩霞等表明，相同的培养条件下同一品种的子叶与下胚轴在不定芽与愈伤组织的诱导上差异显著，子叶更加适合番茄再生体系建立和转化体系的研究[13]。外植体通过激素的诱导启动脱分化功能从而形成愈伤，进而继续分化直至长成健康的植株。在研究过程中发现，尽管已建成了高效的再生体系，但是在植物材料接受农杆菌侵染或经过各种程序的基因操作之后，不管植物抗性多么好、品种多么优良，它们的再生率都会大打折扣。同种植物的同组织培养在筛选的各种激素配方下效果也各不相同，使用多种激素比单独使用一种激素的番茄再生效率高。叶志彪等认为，在番茄诱导不定芽时，玉米素比6-BA和激动素的效果好，认为子叶诱导不定芽最佳培养基是MS+IAA1.0mg/L+ZT1.0mg/L，而MS+IAA0.5mg/L+ZT1.0mg/L效果较差[14]。马杰发现子叶的最佳浓度配比为NAA0.1mg/L+6-BA2.0mg/L，茎段的最适宜激素配比为NAA0.1mg/L+6-BA2.0mg/L[15]。罗素兰实验表明，诱导子叶愈伤的最适配方为NAA0.05mg/L+6-BA3.0mg/L[16]。Micro-Tom是近些年来对番茄研究中广泛使用的试材，它是一种番茄突变体，保留了普通番茄作为模式植物的基本特征，但植株矮小、生命周期较短、可以高密度种植。因此，已被广泛应用于番茄功能基因组学的研究[17]。而现代的许多关于番茄组织培养的成果都是来源于对这一试材的不断研究。El-Bakry利用含有不同浓度的6-苄基腺嘌呤（6-BA）和3-吲哚乙酸（IAA）的MS培养基，对10个不同番茄品种子叶的再生频率进行了观察，当6-BA和IAA的浓度为4.0mg/L和0.2mg/L时，5个品种的诱导率可达100%，Supermarmande诱导率最低，只有66.7%[18]。陈丽萍等的研究也发现细胞分裂素ZT的不定芽诱导效果明显优于6-BA和激动素（KT），KT诱导效果最差，生长素IAA的不定芽诱导效果优于吲哚丁酸（IBA）和萘乙酸（NAA）[19]。Bhatia和Ashwath系统研究了光周期对番茄再生的影响，结果表明光周期对番茄再生没有显著影响，最大芽再生率出现在日光照16h（60%），24h光照和24h黑暗条件下芽诱导率分别是40%和47%[20]。而且Gresshoff和Doy发现番茄花药培养中，不管光照条件如何，只要提供适当的培养基，花药形成的愈伤组织都能分化[21]。陈火英等用不同浓度NAA、IAA、IBA、二氯苯氧乙酸（2,4-D）进行生根培养试验，发现番茄的内源生长素浓度较高，添加生长素对不定芽发根有一定的作用，若不添加生长素也极易发根[22]。而国外研究发现，寒冷和渗透胁迫之间有着密切的关系，脯氨酸在植物体内对渗透调节极为重要，其随着积累量的增高，抵御逆境的水平就越高。脯氨酸脱氢酶(ProDH)是脯氨酸降解的关键酶[23,24]。在组织培养过程中，我们常常会遇到一些很难根治的问题，如污染、褐化、黄化、玻璃化等，这都会使得试验无法进行下去，需要推翻重来以至于要多次实验，甚至可能会导致整个试验的失败，功亏一篑，给科研和生产造成极大的损失。通过查阅相关资料我们可以得知，外植体的褐化是番茄组织培养中常见的现象。它是由于组织中的酚类物质经氧化后产生棕褐色的醌类物质造成的，这类物质可抑制细胞中其它酶的活性，影响细胞的正常代谢严重时可导致组织的死亡。郭艳茹等研究表明，褐变的产生是由植物品种、外植体年龄、外植体损伤程度和温度光照及培养基成分等引起的[25]。一般材料过小或者过老，褐变更严重，此外分化程度较高的真叶和大苗齡的子叶较易发生褐变。因此，通常7天到9天苗龄的番茄子叶最合适。外植体的受损程度会直接导致褐变，伤口越大褐化越严重，所以伤口应尽可能平齐，减少暴露在空气中的时间。黄化是组培苗部分出现黄化、整株失绿、斑驳的现象。诸多因素导致黄化，例如母液中铁元素比例偏低、激素配比不均衡、培养瓶通气不足、光照不足、pH变化过及培养基中添加头抱霉素类抗生素等[26]。培养时应严格控制培养湿度，増加光照，尽量使用有气膜的瓶子，适当减少添加抗生素等一系列措施减少黄化。玻璃化现象是指在培养过程中材料呈半透明状，组织结构发育畸形的现象，又称过度水化。主要是组培苗生理紊乱，如叶片或嫩梢有水浸、半透明状，主要由于培养基液态氮含量高，而不是因为外植体受损加速乙烯合成引起的玻璃化。玻璃化的苗由于组织畸形，分化能力降低，不易成活，因此不宜用作继代和移栽的材料。所以本次实验将以优化番茄种子，优化番茄植物再生体系，减少褐变等问题发生为主要任务。1.5番茄组织培养的目的及意义近些年来，随着我国不断发展，传统农业也正在逐步向现代农业转变[27]，农产品与现代工业正在逐步接轨，农业生产及农产品附属市场标准化，统一化以及成为了一种必然的趋势，在农业与科技相结合的大时代背景下，番茄作为传统农业的代表性产物之一，培育出适合温室大棚种植的番茄优良品种，满足现代科技对农业产品更加苛刻的要求，已经成为番茄培养的刚性需求。再加上我们对番茄本身品质如口感、甜度等方面要求的提高，个人精致主义对食品的挑剔化、高要求化，城市农产品市场对保存商品的需求越来越高，以及虽然中国不断的从国外引进了非常多的优质番茄新品种，但依旧满足不了中国农产品市场越来越大的需求，所以培育出更高产量，适应性更好，品质更好的番茄品种成为了一个非常值得研究的课题。从宏观角度看，目前中国所种植的优良番茄品种绝大多数都是从国外引进的，因此在种子方面存在着进口种子价格昂贵，自制种子又难以保证原种的优良特性的问题，针对这种情况，在我国的科研工作者们的不断努力下，我国已经对一部分的番茄种子成功进行了品质优化，但是，中国关于番茄在国内主要种植种类的再生因素研究并不多，更不提关于纯合体栽培品种的相关实验就更是少数。另外，在番茄组织培养诱导愈伤中产生褐变、玻璃化以及培养时间较长等问题，都会在一定程度上限制诸如“中农二号”等番茄品种组织培养体系的进一步发展。而且除了一小部分被优化的品种外，还有很大一部分品种的番茄种子等待培养优化，改进品质，并且伴随着国内设施农业的大步伐前进，在帮助广大农民解决经济问题的同时，也随即引发了很多连带的问题，如次生盐溃化、养分不平衡、土壤酸化等；另外，番茄在种植中经常遭受病毒虫害侵害导致大量的死亡甚至绝收，又由于其对低温的抗性低，常规定要到5月才可种植，这极大地限制了番茄的上市时间。面对诸多问题，有很多国内外学者提出建议，将抗寒基因导入番茄获得抗寒植株，以此突破低温影响番茄生长的瓶颈，但由于种子的价格昂贵，不能广泛的为广大农民应用于日常的种植中，通过组织培养就可以有效的解决此类问题。将番茄植株不耐高温，易缺钙，得病率高，如脐腐病和棉疫病等缺点排除，减少其生长培育成本，加快其产业化、系统化进程，使之与现代农业更好的接轨。在番茄种植这一方面，由于目前中国的优良品种大多数是从国外进口，造成本国自制的番茄种子在农业种植及农产品市场中所占比重较小，价格偏低的现象。我国缺少国内自己创新研发的优良番茄品种，而在大批次生产上的品种又依赖于从国外进口，这就像一只大手将我们的喉咙抓住一样，使国内番茄产业很难有大的进步。而且一些番茄品种其抗病性较差，经常受早疫病、晚疫病、枯萎病等病菌的侵害。因此，利用转基因技术培养出优良的番茄品种成为当今关注的焦点。随着人们生活水平及健康意识的不断提高，广大农民更加喜欢有较好外观、风味良好，营养价值较高的新品种。所以目前如何优化本国自制种子，使其在番茄种植业中焕发光彩，是目前番茄种植的主要问题。在转基因技术迅速发展的前提下，人们对番茄等植物的研究也越来越深入，积极促进了改良番茄新品种这一道路更好的发展。而番茄作为一种蔬菜性作物，在基因工程方面得到了很好的发展，不仅是因为番茄的栽培过程简单，更重要的是人们对番茄遗传理论方面的研究较为深入[28]，这都为番茄基因工程的稳定发展奠定了基础。从科研角度上来说，利用组织培养技术繁殖番茄既可保证原种优良特性，又可以在短期内获得大量种苗[29]，是优化番茄品质，达到培育出合适番茄种子的最有效的途径。现在很多取得成功的番茄遗传转化体系都是建立在优良的组织培养基础之上，虽然我们己经初步建立了番茄成熟的以组织培养为前提的遗传转化技术体系，但是仍需继续优化。广大学者已经对番茄的各种细胞、组织进行了大规模的实验研究，在番茄花粉、愈伤、芽等方面取得了一定的进展。随着科学技术的不断进步，植物组织己渉及生物学科的不同领域，成为了一项重要的研究手段，它不仅对于研究植物的发育生理、代谢调节生理及基因表达等众多问题及植物细胞、组织、器官的形态发生与建成具有重要的意文，同时还对生产实践有着重要的指导价值，前景一片光明。利用这个途径，我们就可以在相对便捷的条件下改良番茄品质，去除植株缺点，达到科研目的。国内农业生产上番茄的培育品种有很多，而且已有少部分的番茄品种成功的进行了植物组织培养，比如中蔬（鲜丰）系列、樱桃番茄、丽春等等，都是非常具有代表性的品种。经过一系列的研究证明，番茄的根、茎、叶、花药和胚等器官都能进行外植体离体培养以此获得再生植株[30-33]。而植物组织培养在分子生物学及基因工程研究中都被广泛应用，在科研理论与技术实践上都已经成熟，具有很高的可行性。本次实验将以番茄种子为外植体，利用无菌苗下胚轴和子叶开展诱导愈伤组织培养试验，为优化番茄植物再生体系，减少褐变，及番茄遗传转化等研究提供基础。2实验材料与方法2.1实验材料本次实验以市售番茄种子“中农二号”为实验材料。对照材料茄子种子。2.2实验设计与方法2.2.1培养基的配制种子发芽培养基：配制愈伤组织诱导培养基，1/2MS培养基，将上述的培养基都加入30g/L的蔗糖以此作为碳源，各加入7g/L的琼脂固化培养基，利用NaOH与HCl将pH调整至5.8到6.2之间，然后121摄氏度20分钟高压蒸汽灭菌。2.2.2番茄无菌苗的培育将为实验所准备的种子分为3组，分别用升汞消毒灭菌10分钟、12分钟、15分钟，然后用蒸馏水洗涤三次，洗净种子表面所残余的升汞，用蒸馏水浸泡一分钟，在超净工作台上进行接种，将种子以10粒为一份接种于一瓶1/2MS培养基中，每组接种20瓶，共计60瓶，600粒种子。同时另取200粒茄子种子，在同一环境下做接种处理，灭菌12分钟，以10粒为一份接种于一瓶1/2MS培养基中，接种20瓶。将接种后的培养基置于培养室中25摄氏度左右恒温培养，24小时不间断光照，每隔5天观察一次，记录其生长状况，统计其出苗率，污染率，并且及时清理污染培养基。出苗率=成功出苗的种子数/接种于培养基的种子数*100%。污染率=污染的培养基数/总培养基数*100%。2.2.3番茄不同外植体在不同激素配比下的愈伤组织诱导将上文种子培育得到的子叶完全展开的番茄幼苗在超净工作台上取出，将其子叶剪下，切成0.5cm2左右的块状，再将幼苗嫩根切除，剪除多余叶柄，将剩下的茎剪成1.5cm左右长度的茎段，分别接种于不同激素配比组合的6组培养基并标记编号，各组培养基配方如下M1：MS+3.0mg/L6-BA+0.4mg/LNAA，M2：MS+3.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，M3：MS+2.0mg/L6-BA+0.4mg/LNAA，M4：MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，M5：MS+1.0mg/L6-BA+0.4mg/LNAA，M6：MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA。在无菌条件下每瓶培养基接种8根茎段或者每瓶培养基接种四片块状子叶碎片，接种时外植体以一定的间隔接种，防止外植体之间交差污染。每组接种10瓶培养基，共计茎段接种60瓶培养基，子叶接种60瓶培养基，合计120瓶。然后将已经接种完毕的材料放置于培养室25摄氏度恒温培养，湿度50%至60%，光照强度1500至2500lx。每隔7天观察记录一次，统计其出愈率，并且及时的清理被污染培养基。出愈率=产生愈伤组织的外植体数目/接种于培养基的总外植体数目*100%。3实验结果与分析3.1不同消毒时间对番茄种子发芽率的影响由表1我们可以看出，不同的升汞消毒时间对种子的出苗率以及污染率有很大的区别，在消毒时间为10分钟时，虽然出苗率高达78.5%，但污染率仍较高，15%的污染率会给实验造成很大的损失。而15分钟升汞消毒时间与12分钟消毒时间都未出现污染现象，而在污染率相差不大的情况下，12分钟消毒时间的出苗率有72%，高于15分钟消毒时间出苗率近15个百分点，所以，在综合对比下，12分钟升汞消毒时间为当前最优时间点。表SEQ表\*ARABIC1不同升汞消毒时间对番茄种子出苗影响Table1EffectofDifferentMercuryUprisingDisinfectionTimeonTomatoSeedEmergence升汞消毒时间（分钟）出苗种子数（粒）种子总数(粒）出苗率(%)污染数（瓶）总瓶数（瓶）污染率(%)1015720078.5320151214420072.002001511320056.502003.2不同激素配比情况对番茄子叶愈伤组织形成的影响由表2我们可以看出，不同的激素配比组合下的培养基对子叶诱导愈伤组织有很大的影响，且在不同的培养基下，在诱导过程中发生褐化现象的概率也有一定不同。在M1培养基中，出愈率有92.5%，褐化率也不高，较为理想。而M2与M5培养基在诱导过程中出愈率不高，M3与M5培养基出愈率都高达100%，但是M4培养基褐化率高达40.0%，这对于实验来说是一个非常大的不稳定的因素，从客观角度上来说并不适合作为愈伤诱导培养基，而M6培养基在防止褐化方面最佳，没有出现褐化情况，但是出愈率并不理想。而在愈伤组织形成情况方面，M1、M2、M3与M4培养基外植体产生愈伤组织时间短，且愈伤组织状态良好，愈伤组织团较为紧密，透明度高，直径较大，无部分坏死现象，而M5与M6培养基外植体产生愈伤组织时间较长，愈伤组织团松散，透明度相对较低，直径较小，产生了部分坏死现象。因此，综合对比分析下，M3培养基激素配比组合对子叶外植体诱导愈伤组织较为理想。表SEQ表\*ARABIC2不同激素配比情况对番茄子叶愈伤组织形成的影响Table2EffectsofDifferentHormoneRatiosonCallusFormationofTomatoCotyledon不同激素配比组合培养基出愈外植体数（块）接种外植体数（块）出愈率（%）褐化瓶数（瓶）褐化率（%）M1374092.5220.0M2264065.0330.0M34040100.0110.0M44040100.0440.0M5334082.5330.0M6354087.5003.3不同激素配比情况对番茄茎段愈伤组织形成的影响通过对表3数据整理分析，我们可以看出在不同激素配比组合下外植体茎段愈伤组织形成情况有明显差异。其中，M2、M3与M4培养基中出愈率为100%，出愈率达到了理想水平，而M1培养基出愈率96.25%，褐化率也近三成。M5与M6培养基愈伤组织诱导情况相似，出愈率为91.25%与95.0%，而M5培养基在愈伤组织诱导过程中还保持着10.0%的褐化率。在愈伤组织形成情况方面，M1、M2、M3与M4培养基产生愈伤组织时间短，愈伤组织团较为紧密，颜色呈黄绿色，直径较大，无部分坏死现象，而M5与M6培养基外植体产生愈伤组织时间较长，愈伤组织团松散，颜色为较黄绿色，直径较小，产生了部分坏死现象。综合对比下，M4培养基激素配比组合对茎段外植体诱导愈伤组织比较理想。表SEQ表\*ARABIC3不同激素配比情况对番茄茎段愈伤组织形成的影响Table3EffectsofDifferentHormoneRatiosonCallusFormationofTomatoStemSegments不同激素配比组合培养基出愈外植体数（块）接种外植体数（块）出愈率（%）褐化瓶数（瓶）褐化率（%）M1778096.25330.0M28080100.0330.0M38080100.0220.0M48080100.000M5738091.25110.0M6768095.0003.4番茄与茄子不同外植体愈伤组织诱导比较研究按上述方法，另将茄子种子无菌发芽，取其子叶和茎段为外植体，进行诱导愈伤对比试验。由表4可知，在同样的培养条件下，不同茄科植物不同外植体均会表现出结果差异，番茄子叶在愈伤组织培养中时间最长，产生愈伤组织时间平均为13天，且愈伤组织团直径较小，仅为1.7cm，褐化率较高，出愈率相对较低，而番茄茎段产生愈伤组织时间平均为10天，愈伤组织团直径达1.9cm，褐化率15%，出愈率97.1%。反观茄子，子叶与茎段产生愈伤时间也有两天的差距，但褐化率都较低，茄子子叶仅为6.7%，而茄子茎段未出现褐化现象，在出愈率方面，茄子子叶出愈率92.5%，茄子茎段出愈率高达100%。将番茄与茄子愈伤组织进行对比，产生愈伤时间相差不大，而愈伤组织平均直径，番茄相对较小，在同外植体之间番茄与茄子愈伤组织大小有着0.2cm到0.4cm直径的差距。番茄愈伤组织颜色为黄绿色，偏向翠绿，而茄子愈伤组织颜色为浅黄色。番茄愈伤诱导时褐化率高，出愈率相比之下较低，但也高达90%左右。茄子愈伤诱导褐化率很低，而出愈率高，茄子茎段出愈率甚至高达100%。表SEQ表\*ARABIC4番茄与茄子不同外植体愈伤组织形成表现差异Table4DifferencesinCallusFormationPerformanceofDifferentExplantsofTomatoandEggplant类别产生愈伤时间（天）愈伤组织团直径（cm）颜色紧密度褐化率（%)出愈率（%）番茄子叶131.7黄绿色紧密21.787.9番茄茎段101.9黄绿色紧密15.097.1茄子子叶121.9浅黄色松散6.792.5茄子茎段102.3浅黄色松散01004讨论与结论在本次愈伤组织诱导实验中，污染及褐化问题仍比较突出明显，由于本次实验是采取的种子无菌发芽，再利用无菌苗子叶和茎段为外植体诱导愈伤组织，所以材料本身对污染率没有太大影响。愈伤诱导过程虽然出现了污染现象但仅为个例。而导致无菌苗诱导愈伤出现污染的原因大致可分为3点：一是在组织培养接种过程中无菌操作不严谨，超净工作台消毒灭菌不够彻底，二是在愈伤组织培养过程中培养室空气中的细菌进入培养基所致，三是季节变换导致细菌活动变动所致。在降低污染率方面，我们可以通过更为严谨细致的工作，如接种器械严格消毒灭菌及对操作者接种严格训练等来减少制造污染的几率，将外部环境对愈伤诱导的影响降至最低。而对于季节变化所导致的污染，目前并没有特别好的解决办法，我们可以尽量避免在梅雨季节试验，而在细菌并不活跃的高温季节进行愈伤组织的诱导，或通过培养室封闭性灭菌可将外部季节因素的影响尽量消除。而在本次实验中，褐化问题成了最为核心的问题，无论是番茄子叶还是茎段，都存在着或多或少的褐化现象，而褐化本身又会严重影响组织培养的实验进程。通过观察总结，对于褐化问题的产生因素大致有如下几个推测：一是外植体的不同会影响褐化概率，在相同环境下子叶愈伤组织的褐化率较茎段高。二是激素配比组合的不同会影响褐化率，由实验数据可以看出在不同的激素配比组合下褐化率也出现了较大的差异。三是愈伤诱导时间，经过实验发现，褐化现象通常会发生在诱导愈伤的后期，诱导愈伤前期暂未发现褐化现象。四是培养环境变动，在实验过程中，会对愈伤组织进行增殖培养，而培养基环境的变动也会导致褐化率的突然上升。在降低褐化率方面，一是可以通过选择最适的激素配比组合来降低褐化率，二是经过观察发现，褐化现象通常会由先局部开始，可及时切割已经褐化愈伤组织，消除褐化传染源来及时阻止愈伤组织的进一步褐化。对于已经褐化愈伤组织，本次实验暂未观察到褐化逆转现象。因为本次实验采取的是先培养无菌苗，后接种愈伤诱导外植体的方式来降低愈伤诱导实验的污染率，所以无菌苗出苗过程中本身的污染率也是十分重要的，从实验数据来看，接种种子时对种子的消毒处理十分关键。有效控制污染是获得无菌苗的关键，而控制污染的关键在于使用的接种工具、操作和种子的消毒处理，若消毒不彻底会造成细菌性污染。番茄种子表面的病菌并不难除去，造成出苗过程中污染现象的往往是潜藏在种子内部的病菌，而本试验采用升汞对番茄种子进行灭菌15分钟己经达到无菌培养效果，但若是对种子进行了过高强度的消毒处理，很容易导致种子的死亡。所以说，如何平衡升汞消毒时间是种子高出苗率低污染率的关键。本次实验采取的10、12、15分钟消毒时间造成了不同的结果，其中，以12分钟的消毒时间结果最为理想，能够在保持低污染率的前提下将对种子的损伤降至最低，让番茄种子的出苗率并不会收到太大的影响。在番茄愈伤诱导过程中，不同的外植体对不同的激素配比组合情况产生了不同的结果，其中对于番茄子叶而言，接种M3与M4培养基时的诱导出愈伤组织的概率均高达100%，但是M4培养基培养愈伤组织过程中表现出了极高的褐化率，实验本身会受褐化率所影响，而在M3培养基中，番茄子叶愈伤组织的褐化率仅为10%。而后还会出现褐化的原因，推测可能是诱导愈伤时间过长所致。因此在番茄子叶诱导中，添加2.0mg/L的6-BA与0.4mg/L的NAA激素的MS培养基为最适培养基。对于番茄茎段而言，接种于M2、M3与M4培养基都有着高达100%的出愈率，而M1与M5培养基在诱导愈伤过程中也有着95%及以上的出愈率，再通过比较他们的褐化率，可以筛选出M4与M6是较为理想的番茄茎段诱导愈伤培养基，其褐化率都为0，而M6培养基的出愈率未达100%的原因可以推测为激素浓度太低的原因，所以以M4培养基最佳。在番茄茎段愈伤组织诱导中，以添加2.0mg/L的6-BA与0.2mg/L的NAA激素的MS培养基为最适培养基。在番茄子叶与茎段愈伤能力对比方面，在诱导愈伤过程中茎段产生愈伤组织的品质更好，活力更强。在愈伤组织诱导初期，茎段往往更快的出现愈伤组织，而且茎段从出现愈伤到愈伤组织成熟的时间更短。在愈伤组织形成表现上，茎段愈伤组织均从茎段俩端开始产生愈伤组织，而子叶产生愈伤的部位较为平均，推测是由于同一外植体不同部位细胞活性不同所致，可以推断茎段内的细胞全能型比茎段表面更高，而子叶各细胞的全能性较为平均。将他们的愈伤组织分别进行增殖培养，可以发现茎段愈伤组织增殖较快，而子叶愈伤组织更易出现褐化甚至死亡的现象。通过本次实验研究，发现将番茄茎段与子叶诱导产生的愈伤进行继代培养，通常来说番茄茎段的愈伤活力比番茄子叶的活力高，这与大部分实验研究结果相同。在番茄子叶形成愈伤的过程中，由于子叶分为正面与反面，所以对子叶正面朝上与反面朝上培养分别进行了观察。观察发现，在子叶形成愈伤的过程中，子叶背面朝上诱导愈伤的速度较快，子叶背面朝上往往会比正面朝上产生愈伤组织快1到2天，而子叶背面朝上愈伤组织的成熟也较快。在形成表现差异上，两者产生的愈伤组织并无明显不同，颜色，大小及紧密度都相差不大，因此认为，在组织培养中，番茄子叶俩面放置的不同只会影响愈伤产生时间而不会改变愈伤组织特性。在观察番茄与茄子的诱导愈伤组织形成表现差异的过程中，可以观察到不同植物外植体在不同激素配比组合下有着不同的表现，在6-BA与NAA的比值过小时，产生的愈伤组织团会变得较为分散，愈伤组织会相对较小，而在比值适度时，愈伤组织团会比较紧密，愈伤组织相对较大，而过大时，番茄愈伤组织会更易出现褐化等问题。因此，若是想要得到更为合适的愈伤组织，选择一个合适的激素比值是非常必要的，总结得出在细胞分裂素和生长素比值为5到10时，番茄愈伤组织的本身品质是最佳的，而过小或者过大均会较大程度的影响其品质。通过比较番茄与茄子在形成愈伤组织的表现，可以观察到两者同种外植体的表现也会出现非常大的区别，产生愈伤时间会出现2到3天的差距，而愈伤组织大小也有0.2cm到0.4cm的差距，愈伤组织颜色会因为其组织中含有成分尤其是色素的不同而表现出肉眼可见的差异，但通常以绿色调为主，致密程度产生差异的原因推测为细胞表面之间粘性的不同，而褐化率及出愈率差异巨大的原因可能是其外植体对于激素浓度敏感度的不同所导致的。在本次实验中，虽然可以通过各种途径来降低污染率与褐化率，但本质原因并未查清，有待进一步研究。参考文献GeisenbergC,StewarstK.Fildcropmanagement.In:AthertonJG,RudichJ(eds).TheTomatoCrop:Ascientificbasisforimprovement[J].London:ChapmartandHall,1986:511-517;王毅,杨宏福,李树德.园艺植物冷害和抗冷性研究[J].园艺学报,1994,21(3):239-244.BeecherGR.Nutrientcontentoftomatoesandtomatoproducts[J].ExperimentalBiologyandMedicine,1998,218:98-100.黄丽华,李芸瑛.樱桃番茄果实营养成分分析[J].中国农学通报,2005,21(10):91-92.IlahyR,HdiderC,LenucciMS,etal.Antioxidantactivityandbioactivecompoundchangesduringfruitripeningofhigh-lycopenetomatocultivars[J].JournalofFoodCompositionandAnalysis,2011,24:588-595.肖日新.辣椒、茄子和番茄栽培技术[M].海口：海南出版社,1998张银山.不同激素浓度和配比对番茄遗传转化的影响[A].中国植物病理学会.中国植物病理学会2017年学术年会论文集[C].中国植物病理学会,2017:1.\t"/http/77726476706e69737468656265737421fbf952d2243e635930068cb8/KXReader/_blank"赵菁菁.过表达SlMPK3对番茄低温耐受能力的影响[D].杨凌:西北农林科技大学,2016.徐加新.番茄红素-β-环化酶反义基因对番茄的遗传转化[D].杨凌:西北农林科技大学,2008.Ozyigit,II,KahramanMV,ErcanO.Relationbetweenexplantage,totalphenolsandregenerationresponseintissueculturedcotton(GossypiumhirsutumL.)[J].AfricanJournalofBiotechnology,2007,6(1):003-008.\t"/http/77726476706e69737468656265737421fbf952d2243e635930068cb8/KXReader/_blank"QiuDL,DirettoG,TavarzaR,etal.ImprovedprotocolforAgrobacteriummediatedtransformationoftomatoandproductionoftransgenicplantscontainingcarotenoidbiosyntheticgeneCsZCD[J].ScientiaHorticulturae,2007,112(2):172-175.张建民.利用农杆菌介导将外源基因导入番茄的研究[J]．东北林业大学学报,1999,27(1)：42-43.苏彩霞,霍秀文,刘杰才,等.番茄子叶下胚轴植株再生体系的建立[J].湖南农业大学学报,2006,27(4):28-30．叶志彪,李汉霞,周国林.番茄多聚半乳糖酵酸酶反义cDNA克隆的遗传转化与转基因植株再生[J].园艺学报,1994,21(3):305-306.马杰,邱栋梁.番茄组培再生体系优化研究[J],中国农学通报,27(8):185-189．罗素兰,田嘉君,长孙东亭.番茄高效再生体系的建立[J],海南大学学报,2002,5(12):317-323.MeissnerR,JacobsonY,MelamedS,etal.Anewmodelsystemfortomatogenetics[J].ThePlantJournal,1997,12(6):1465-1472El-BakryAA.Effectofgenotype,growthregulators，carbonsource,andpHonshootinductionandplantregenerationintomoto[J].InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant,2002,38(5):501-507陈丽萍,张丽华,程智慧.加工番茄离体再生体系的建立[J].西北农业学报,2007,16(1):162-167BhatiaP,AshwathN.Effectofdurationoflight：darkcyclesoninvitroshootregenerationoftomato[J].AsianJournalofPlantSciences,2005,4(3):255-260GresshoffPM,DoyCH.DevelopmentanddifferentiationofhaploidLycopersiconesculentum(tomato)[J].Planta,1972,107(2):161-170陈火英,张建华,钟建江,等.番茄下胚轴离体培养植株再生及其组织学观察[J].西北植物学报,2000,20(5):759-765,899NakashimaK,SatohR,KiyosucT,etal.Ageneencodingprolinedehydrogenaseisnotonlyinducedbyprolineandhypoosmolarity,butisalsodevelopmentallyregutatedinthereproductiveorgansofArabidopsis[J].PlantPhysiol,1998(118):1233-1241.\t"/http/77726476706e69737468656265737421fbf952d2243e635930068cb8/KXReader/_blank"132-135.任晓平,张喜春,张楠,等.低温胁迫对番茄幼苗叶片中脯氨酸降解酶的活性及其基因表达量的影响[J].中国农学通报,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