大单元8 限时练26 基因表达载体的构建及基因工程的技术应用-2026年高考生物二轮复习

大单元八生物技术与工程

限时练26基因表达载体的构建及基因工程的技术应用

（选择题每小题3分）

一、选择题

1.（2025•福建漳州模拟）用氨茉青霉素抗性基因（4〃炉）、四环素抗性基因（7*）作为标记

基因构建的质粒如图1所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质

粒，构建基因表达载体，并转化到受体菌中。利用影印法（用无菌绒布轻盖在已长好菌

落的原培养基上，然后不转动任何角度，"复印”至新的培养基上）筛选菌株，过程如图

2所示。下列叙述正确的是（）

HindHI

1

SeaI^jjAmp9'-Sca1

图1

灭过菌的金丝绒

遍醪f◎匐A培养基

B培养基

图2

A.为防止目的基因与质粒的反向连接，可用，比dlH和Seal酶切

B.将质粒用SeaI酶切后，所得产物经琼脂糖凝胶电泳可出现3个条带

C.目的基因插入正严中，筛选时A培养基含四环素，B培养基含氨茶青霉素

D.利用影印法筛选时，能在B培养基中生长的是转化成功的菌落

2.（2025•江西模拟）受到外源DNA入侵时，细菌能将外源DNA中特异性序列整合到

CR/S尸R基因上。当再受到同样外源DNA入侵时，细菌可从CR/SPR基因上提取特异

性片段，转录出sgRNA;G/s基因则表达产生Cas酶，对外源DNA进行分解，两者共

同作用完成对细菌自身的保护，过程如图所示。下列说法错误的是（）

CRISPR前间隔

基孔里匚

鹏…黑广

［表达

sgRNAn~nn~~nnn

°O°

形成sgRNA-Cas宽合物曲-----一OO

外源DNACas醯

外源DNA降解物,■■■■■■

A.细菌将外源DNA整合到CRISPR基因上属于基因重组

B.sgRNA能对外源DNA进行定位且序列越短定位越准确

C.Cas酶能切割磷酸二酯键催化外源DNA分解

D.通过设计sgRNA可对动物细胞实现特定基因的定位

二、非选择题

3.（11分）（2025・四川卷）杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉

索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合

成拉索西J.的相关基因（/小如cF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如

卜•图。回答下列问题。

旦目的基因：2.9kb鸟

注:①Fl、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物,“一”指引物5匚3方向。

②密码子对应的氨基酸为AAA—赖氨酸;AUG—甲硫氨酸（起始）;UUC—苯丙氨

酸;ACA—苏氨酸;UCG—丝氨酸。

⑴用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增此力如/目的基因时，应选用引物。

本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是。

（2）采用EcoRI和BamHI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应

产生条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是________________。

（3）由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带_______（填氨基酸名称）的tRNA

进入结合位点，导

致,最终引

起细菌死亡。

（4）重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提

取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因

是o若运用发酵工程来生产拉

索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有

（答出1点即可）。

4.（11分）（2025•黑吉辽蒙卷）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。

通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因M可高效生产杏树脂醇。回答下列问题。

（1）可从中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为

转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5,端分别引

入和限制陶识别序列。PCR扩增基因M特异性酶切后，利用

连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前

后，质粒pYL对应部分大小基本不变。

各限制酶的识别序

列和切割位点

5Z-GAATTC-3Z

3Z-CTTAAG-5Z

y-ACTAGT-37

y-TGATCA-S7

5:CTCGAG-3,

3,-GAGCTC-5,

Xba\5'-TCTAGA-3,

a链3'-AGATCT-5'

引物2

——b链HindVi5'-AAGCTT-3'

基因

N3'-TTCGAA-5'

图1

空白

实验组对照组

注:M为指示分子大小的标准参照物，1〜4为菌株号。

图2

(2)进一步筛选构建的质粒，以17号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2

进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水

代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有的污染。初步判断

实验组(从力〜4”二选填)的质粒中成功插入了基因M理由

是。

(3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基

序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯

氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的

引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还

有0

a:5,...GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC...3*

b:51...GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG...3'

c:5'...GCC/TGG/CTG/TTPCCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC...3f

d:5,...GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG...3'

（4）进一步检测转基因酵母菌发酵得到的含量并进行比较，可以选出最优

的香树脂醇合酶基因的改造方案。

5.（11分）（2025・广东卷）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期

和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关

键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定

性好的红色荧光蛋白mKatc2为模式蛋白，测试质粒功能。回答下列问题。

（1）研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKatc2,将

质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生

长状况，结合PCR及检测，筛选获得重组菌株W1。

质粒①片加如e2|丽］终止子H抗性基因:卜

质粒②而悯际斗|终止子间加检/e2H终止子H抗性基因2卜

注：Pam为大肠杆菌内源启动子，在细胞快速生长期开启基

因转录，但进入生长稳定期后即停止基因转录；SsM基因编

码SsrA短肽；C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内

源蛋白眸系统特异性识别并以一定速率降解。

图a

（2）将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有

（答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用

是。培养结果（图b）表明,

进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是。

快速生长期生长稳定期

图b

（3）研究者选用启动子Px、X基因（编码阻遏蛋白X,阳谒Px开启转录），重新构建质粒

②（图a）,导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的

生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势

为o

（4）莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌

胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积

累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上

述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思

路:»

艇A酶B

碳源一前体一A...一A莽草酸—»....一►细胞生长必需物

图C

6.（11分）（2025・河南卷）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解

为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌

种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题。

（1）选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因

是o将培养后的菌液混匀

并充分，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。

（2）为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1）,对华的PCR扩增产物

和质粒进行双酶切，随后用Eco〃DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，eg转

录模板链的5,端最好含有酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组

合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无

法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是。

SmaIxbaIBamHl

限制酶的识别序列和切割位点如下：

II

BamHl5,-GGATCC-3,EcoRV5'-GATATC-3'

2，FAC",

3'-CTATAG-5Z

5'-CCCGGG-3,S'-ACTAGT-3'

V-GGG.CCC-5'3'-TGATCA-5,

5'-TCTAGA-3Z

y-AGATCT-5'

(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的

是,随后在含和的培

养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。

(4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高

CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表

明该位点对酶的功能越关键)，如图2所示。根据分析结果，选择第位的氨基

酸替换成半胱氨酸最合适，原因是_____________________________。

缀氨酸)第76届

保守度：0.83

第44位

保守度:

保守度：0.31

第45於一」

保守度：0.92

注：虚线长度代表氨基酸间的空间距离。

7.（12分）（2025•山东卷）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利

用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休

眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦

基因组序列信息已知。

Ti质粒部分序列及限制酶酶切位点

LBXbaIPstISma1BamHIBarr.W1RBKan'

5,J,\II/,I,J,।,

C,启动子终止子

目的基因信息

抗除草剂基因X

3'

转录的/|_200bp—I--------------550bp------------1

模板链SmaISpeISmaI

注:LB/RB为T-DNA的边界序列;为卡那霉素抗性基因;bp为碱基对。

限制醉的切位点

SmaI5Z-CCCGGG-3Z

Z,

Pst\5-CTGC/JG-3

XbaI5Z-1TTAGA-3Z

5LGbATCC-3'

BamWI

5Z-XcTAGT-3，

SpeI

甲Ti质粒与抗除草剂基因信息

（l）Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为。选用图甲中的

Sma1对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和对Ti质粒进行完

全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是o利用DNA连

接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重

组载体，转化大肠杆菌;经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶进行完

全能切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为

bp,则一定为正向重组质粒。

（2）为证明这两个突变体是由于T・DNA插入小麦基因组中同一基因导致的，提取基因

组DNA,经酶切后产生含有T・DNA的基因组片段（图乙）。在此随切过程中，限于后

续PCR难以扩增大片段DNA,最好使用识别序列为（填“4"6”或"8”）个碱基对

的限制醐，且T・DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段:

才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操

作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为

（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对

P2_

未知序列未知序列

P1

注:Pl、P2表示引物。

乙基因组DNA酶切后含T-DNA的片段

（3）通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到

野生型基因，（填“能''或“不能”）确定该植株的表型为野生型。

参考答案

1.B解析若用“山dill和Sc。【酶切质粒，由于质粒中有两个Seal的醐切位点，因而

不一定能防止目的基因与质粒的反向连接，A项错误。由于图示质粒中有两个Seal

的酶切位点，所以用ScoIiW切质粒，能得到三种DNA片段，即完整的片段和两个短

片段，所得产物经凝胶电泳可形成3个条带，B项正确。目的基因插入7aR中，则含

有重组质粒的细菌对四环素不具有抗性，对氨苇青霉素有抗性，所以A培养基含有氨

茉青霉素，B培养基含有四环素，C项错误。转化成功的菌落对氨苇青霉素有抗性，

对四环素没有抗性，所以能够在A培养基中生长，不能在B培养基中生长的菌落是转

化成功的菌落，D项错误,

2.B解析细菌将外源DNA整合到CRISPR基因上属于基因重组，A项正确。sgRNA

通过与外源DNA分子一条单链互补配对引导Cas酶到特定基因位点进行切割，序列越

短，定位越容易发生脱靶现象，越不准确，B项错误。Cas酶切割特定基因位点，相当

于限制醐作用于脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，催化外源DNA分解，C项正确。

sgRNA可以与外源DNA分子一条单链进行碱基互补配对，通过设计sgRNA可对动物

细胞实现特定基因的定位，D项正确。

3.答案(1)F2、F4保证目的基因能在链霉菌细胞中复制

(2)2检测重组质粒是否构建成功

(3)苯丙氨酸翻译过程无法正常进行，细菌无法合成蛋白质

(4)目的基因发生突变(或目的基因表达受到抑制等合理答案)发酵的最佳条件(或提高

发酵产物产量的方法、产物的分离和纯化方法等合理答案)

解析(1)引物需要结合到模板的T端，且与H的基因的部分碱基序列互补配对，子链延

伸方向为5,端一3,端，因此用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增九3-/%尸目的基因时，

应选用F2、F4引物。载体使用链霉菌的复制原点，是为了保证目的基因能在链霉菌细

胞中复制，使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传给后代。

(2)采用EcoRI和BamWI完全酶切构建的重组质粒，会得到载体片段和目的基因片段,

产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生2条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是检测

重组质粒是否构建成功，若能得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带，说明

酶切成功，重组质粒构建可能成功。但是还需要进一步的鉴定。

(3)观察拉索西丁的作用机制图，结合所给密码子信息，可知拉索西丁与核糖体结合后,

会阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点。因为位点2对应的密码子是UUC,编码

苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点，会导致翻译过程无法

正常进行，进而使细菌无法合成蛋白质，最终引起细菌死亡。

(4)重组链霉菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因

是目的基因发生突变，导致其表达的产物结构改变，从而失去杀菌活性;也可能是目的

基因的表达受到抑制等。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还

需进一步研究的问题有:发酵的最佳条件，如温度、pH、溶氧量等;如何提高发酵产物

的产量;产物的分离和纯化方法等。

4.答案⑴序列数据库XhoIXbaIDNA连接陶

(2)其他模板1实验组1的电泳条带大小与基因N的大小接近

(3)GCC

(4)香树脂醇

解析(1)可从序列数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链

为转录模板链，所以右端为启动子端，为保证基因N与质粒pYL正确连接，右端要与

质粒pYL中用限制酶I切出的末端(5，-A

3，-TGATC)相连，而限制随会将基因N切断，所以引物2的S端应引入限制酶

XbaI的识别序列，以便切出与SpeI相同的末端进行连接;引物1的5,端则引入限制酶

X〃ol的识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片

段。

(2)在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反

应中是否有其他模板的污染。初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因M理由是

重组质粒的大小约9.5kb,质粒pYL的大小约7.2kb,所以基因N的大小约为2.3kb,

使用引物1和引物2进行PCR扩增的是基因M实验组1的电泳条带大小约为2.3kb,

与基因N的大小接近。

(3)a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，据图可知，a的5，端显

示的前三个碱基GCA即为第240位脯氨酸替换为两氨酸后对应的密码子序列;又因为b、

c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，据

图可知，只有c的序列与a的序列(244位〜250位)相同，故c链为诱变第243位苯丙氨

酸的引物，5,端显示的前三个碱基为第243位苯丙氨酸替换为丙氨酸后对应的密码子

序列GCC。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。

(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香

树脂醇合酶基因的改造方案。

5.答案⑴荧光(或mKate2蛋白)

(2)显微镜直接计数法排除培养液本身的荧光强度对实验结果的干扰，保证实验结果

的准确性PG「。在生长稳定期停止基因转录，旦C.末端带有SsrA短肽的mKate2被大

肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并降解

(3)快速生长期荧光强度弱，生长稳定期荧光强度迅速上升

(4)用酶A基因替换质粒②中〃7Kse2基因，用酶B基因替换质粒①中〃水〃招2基因，构

建酶B基因缺失的大肠杆菌突变菌株，并导入上述质粒

解析(1)在基因工程中，结合PCR技术扩增目的基因片段，可检测目的基因是否成功

导入，依据荧光(mKate2蛋白)检测筛选出含有目的基因的重组菌株W1。

(2)检测培养液中细胞密度时，由于大肠杆菌细胞是肉眼无法直接观察到的，因此常用

的方法有显微镜直接计数法，显微镜直接计数法可通过细菌计数板在显微镜卜直接数

出细胞数量。接种前需要检测液体培养基的荧光强度，其目的是排除培养液本身的荧

光强度对实验结果的干扰。根据图a中的注释可知，PGr。在生长稳定期停止基因转录，

且C-末端带有SsrA短肽的mKatc2可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并降解，

由于红色荧光蛋白mKatc2减少，因此进入生长稳定期后荧光强度快速下降。

(3)图a中的质粒②，由于启动子PG,。在细胞快速生长期开启转录，会使X基因编码的

阻遏蛋白X阻遏Px开启转录，致使mKate2荧光蛋白表达受阻，同时X上带有SsrA

短肽，又会被大肠杆菌不断降解，因此快速生长期荧光强度弱;而到了生长稳定期PG「。

停止基因转录，阻遏蛋白X又被不断降解而含量下降，Px开始大量转录，荧光蛋白不

断积累，荧光强度不断上升。

(4)根据(2)(3)知，用酣A基因替换质粒②中〃7Kse2基因，使其在生长稳定期能持续合

成前A,从而促进莽草酸的合成，用酶B基因替换质粒①中〃?KWe2基因，构是成B

基因缺失的大肠杆菌突变菌株，并导入上述质粒，使其在生长稳定期时酶B合成大量

减少，从而实现莽草酸的大量积累。因此，为保证细胞正常生长，并在生长稳定期实

现莽草酸的大量积累，重组生产菌株构建思路见答案。

6.答案(1)在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大稀释

(2)氏7〃7HI重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列

⑶使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态卡拉胶四环素

(4)44该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替

换后对醐功能的影响较小

解析(1)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用

前景的卡拉胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可

能性较大，因此可选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀

并充分稀释，