T∕CVMA 365-2026 本尼登虫病诊断技术

准本尼登虫病诊断技术2026-4-1发布2026-4-1实施I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广州双螺旋基因技术有限公司和华南农业大学共同提出。本文件由中国兽医协会归口。本文件起草单位：广州双螺旋基因技术有限公司、华南农业大学。本文件主要起草人：石磊、但学明、李言伟、莫泽权、常彦磊、张璜、陈灏挺、孔明慧。仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范兽医学检测本尼登虫属于扁形动物门(Platyhelminthes),单殖吸虫纲(Monogenea),分室科(Capsalidae),实时荧光PCR:实时荧光聚合酶链式反应(Real-timepol工2应按照GB/T27401的相关要求进行采样。具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员操作。整选择符合5.1临床症状的患病鱼。 38.1.4荧光定量PCR仪。8.2.1除非另有说明，检测中所用试剂均为分析纯，试验用8.2.3荧光PCR反应液：按照不同的实时荧光PCR平台的说明书选取推荐的荧光PCR扩增试剂。8.2.4引物和探针：参照本尼登虫ITS特异性基因片段(序列见附录B中B.1),设计本尼登虫荧光PCR扩增特异性引物及探针序列，见附录C。8.2.5阳性对照：含有本尼登虫ITS基因片段的重组质粒按照附录B中B.2制备，也可以使用其他经8.3.2实时荧光PCR反应体系8.3.3实时荧光PCR反应当阳性对照的FAM检测通道有典型的S型扩增曲线且Ct值≤30,阴性对照和空白对照的FAM检被检样品FAM检测通道出现典型的S型扩增曲线，且Ct值≤36,判定为本尼登虫核酸阳性。8.4.2.2阴性被检样品FAM检测通道Ct值>40或无Ct值，未见的S型扩增曲线，判定为本尼登虫核酸阴性。4被检样品FAM检测通道36<Ct值<40,判定为可疑，可疑样品需重新进行一次检测。如重新检测后仍出现上述结果，可判定为阳性；如重复检测后无Ct值或者无“S”型扩增曲线，可判定为阴性。9.1如果在淡水浸泡病鱼后的水体中观察到疑似虫体，则判定为可疑。9.2如观察到符合7中的疑似虫体，并用实时荧光PCR方法检测呈阳性，则可确诊为本尼登虫。病鱼同时符合5.1中的症状，则确诊为本尼登虫病。5(规范性)本尼登虫虫体形态图本尼登虫虫体形态见图A.1。储精囊图A.1本尼登虫虫体形态图6(资料性)本尼登虫ITS基因片段序列B.1本尼登虫ITS基因片段参考序列(GenBankAccessionNo.LC718918.1)5’-CGGAGATGCAAGCGATATCGCTTTTGTGTGCGATTCAGCTATGGTATAAATGGGCTACGGTCCACTTGTCCTTTGTGACTTCCATTGACGGTTCATCAACTATGGTATTATCTAGCTGTACAATCACATCTTGCAACTGTGTGGCTAGATAAGAGCTGTACTATGTATGGCACTGTTGATGGCCACGTTGCAATGAATGTACATTTACTGCACAATATAATGTTGTGTGATGGCGCCCTGTTTGTTAACTATCACTTCATGTAGTGGATCACTTGGTTCACACTTCGATGAAGATGAAAGCTTAGACTACGTTTGCTCGAGTGCTGGCTAAACATTGATCAATACGTGCCAGTATTGCTAGTGCTACATGTAAGTGTGTTTATTGTAATAAAACGTACTGGTTAAATGGCACTTCTGTATCCCTAACATATAAGCATTAGTACGAGTATATATGACAACGTGCACAATGTGTGCGTTTGTAATTGGCAAGATTCTATGGCGGGGTCAGATATGCACCCATGCATAAAGCGCTAGTATTGTATTTTTAGTTTACTCGCTTATACATAGTTGTGAGCCCTTTACATTGAGCCGCGTGCTGTTAGGCCTGTGGTTCAAAACCCATGTGATAAGCGGTATGATGCTAACACTTGACTTGGTCATTGTAAAGTGTGGTTGTAGAAGGGCTTGAAATTATCTAGGCTGCTGCTGCCCAAATGCTAGCCATGTTTAATTTGGCAACGTGCATCATGTTGAGGTATAACGATGGGTGAGATGCTGCACGCTGGCTTTGAGTAGTATGATATATGCATTATAATTAGTAGCTTTGTGTGATGTAGATTATACAATGTB.2阳性质粒制备将附录B.1中阳性对照序列合成基因片段，克隆至pUC57载体，再转化至DH5α感受态细胞，构建重组质粒。重组质粒经测序正确即为目的阳性重组质粒。利用超微量分光光度计测定阳性重组质粒浓度，并将浓度换算成拷贝数(DNA拷贝/μL=[6.02×10²³×DNA浓度(ng/μL)×10-9]/(DNA碱基数×660)),即为所制备本尼登虫阳性对照母液。将阳性对照母液10倍系列稀释之后，选取10⁶拷贝/μL稀释度作为阳性对照。7(资料性)病原靶基因引物和探针序列本尼登虫下游引物R5