改良乳化溶剂挥发法制备利福布汀纳米粒及相关评价

改良乳化溶剂挥发法制备利福布汀纳米粒及相关评价目录中文摘要1英文摘要2前言31仪器与试药31.1仪器31.2试药42方法与结果42.1色谱条件42.2纳米粒的制备…42.3RB-PLGA纳米粒的相关评价42.3.1粒径、载药量（DL）和包封率（EE）的测定方法42.3.2体外释放研究…………...52.3.3溶血实验…53结果53.1RB-PLGA纳米粒的粒径、载药量（DL）及包封率（EE）63.2体外释放63.3溶血性74讨论与结论8参考文献11致谢13中文摘要目的：制备利福布汀（RB）--聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA)纳米粒，并对该纳米粒进行相关评价。方法：采用改良后的乳化溶剂挥发法制备，通过粒径、载药量、包封率、体外释放研究以及溶血实验对其表征结果：该实验所制备的纳米粒粒径为290.9nm，包封率为（60.2±4..0)％、载药量为（16.1±3.1）%。体外释放研究表明RB-PLGA纳米粒具有缓释作用，168h时的累计释放度达50.65%，对weibull模型的拟合度最高。溶血实验得出浓度800ug/ml的纳米粒溶血率为0.07739%，该浓度及以下符合临床应用安全范围，生物相容性较好。结论：将乳化溶剂挥发法进行改良后顺利制出了利福布汀--聚乳酸-羟基乙酸共聚物（RB-PLGA）纳米粒，粒径满足纳米制剂的要求，相比其他方法制得的纳米粒，载药量和包封率都表现出更优的水平，安全性能好和缓释能力佳，可为后续研究提供合格制剂。关键词：利福布汀；纳米粒；乳化溶剂挥发法；相关评价ABSTRACTObjective:topreparerifubutin(RB)-polylacticacid-glycolicacid(PLGA)nanoparticlesandtoevaluatethem.Methods:itwaspreparedbyemulsionsolventvolatilizationmethod,andcharacterizedbyparticlesize,drugload,encapsulationrate,invitroreleaseandhemolysis.Results:Theparticlesizeofthenanoparticlespreparedinthisexperimentwas290.9nm,andtheencapsulationratewas(60.2±4).0)%,andthedrugloadingwas(16.1±3.1)%.Invitroreleasestudieshaveshownthatrb-plgananoparticleshaveaslow-releaseeffect,withacumulativereleaserateof50.65%at168h,thehighestfittingdegreeforweibullmodel.Thehemolysisrateofnanoparticleswithaconcentrationof800ug/mlwas0.07739%,whichwasconsistentwiththesaferangeofclinicalapplicationandhadgoodbiocompatibility.Conclusion:RB-PLGAnanoparticlesweresuccessfullypreparedbytheimprovedemulsionsolventevaporationmethod,andtheparticlesizemettherequirementsofnanoparticles,thedrugloadingandencapsulationrateweregood,thesafetyperformanceandtheslow-releaseabilityweregood,whichcanprovidequalifiedpreparationsforthefollow-upresearch.Keywords：Rifambutin;Nanoparticles;Emulsionsolventevaporationmethod;Therelatedevaluation改良乳化溶剂挥发法制备利福布汀纳米粒及相关评价前言世界卫生组织(WorldHealthOrganization，WHO)发表的《2017年全球结核病报告》[1]的数据指出，2016年，在全球范围的结核病患者中，其中有23.1%的患者属于耐多药结核病(multidrug-resistanttuberculosis，MDRTB)或利福平耐药病(rifampin-resistanttuberculosis，RRTB)患者，且全球MDRTB患者较2015年新增49万例，中国耐药患者的比例仍占较大比例[2]。利福布汀（Rifabutin，RB）属于螺旋哌啶基利福霉素，其抗菌范围和抗结核分枝杆菌活性都较大，利福布汀在体内的作用时间长且药物毒性表现出更低的水平，对于部分耐多药肺结核病患者来说有很好的临床疗效[3]。纳米制剂因具有靶向、缓释、提高疗效等优点而应用在药物制剂中[4]，RB口服生物利用度仅为20％，为达到治疗目的，临床上需长时间大量服药，患者顺应性差，而且易导致耐药及不良反应发生。同时，结核菌进入体内后会被吞噬细胞吞噬并能够逃避吞噬细胞的杀灭作用，而在胞内定植、繁殖，纳米粒在体内具有与结核菌共同点药动学特点，因此，抗结核药纳米粒制剂在理论上具有原型药没有的优势，为抗结核药纳米粒的开发提供了理论依据。以PLGA为载体原料的纳米粒的粒径比细胞小且作为“异物”，通常被细胞吞噬，而PLGA降解为水和二氧化碳，其中的药物释放出来而发挥作用，因此预计利福布汀与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的完美结合能够打破了以往单用药物在临床应用上的缺陷[5,6]，并提高抗结核治疗效果。本实验通过制备利福布汀PLGA纳米粒，对其粒径、安全性、缓释作用进行研究与评价，探索纳米制剂在抗结核药物中应用的可行性。1仪器与试药1.1仪器zetasizernanozs型Zetasizer纳米粒度电位仪（英国马尔文仪器有限公司）；FJ200-S数显高速分散均质机（上海标本模型厂）；KH19A型高速离心机；磁力搅拌器（德国IKA）；高效液相色谱仪（IC-20a型，日本岛津）；精密酸度计（HI211，Hannainstru-ments）；电子天平（SartoriusBP121S型）；透析袋（广州市胸科医院药剂科赠送）。试药PLGA(50:50）（济南岱罡生物工程有限公司）；利福布汀；二氯甲烷；聚乙烯醇（均为广州市胸科医院药剂科现有材料）；乙腈、甲醇（HPLC级，美国CNW公司）；叠氮钠，KH2PO4，NaOH，丙酮等其他试剂由广州市胸科医院药剂科实验室所有。2方法与结果2.1色谱条件[7]色谱柱：Lichrospher®100RP-8（250mm×4mm，5.0μm）；流动相：乙腈-甲醇-0.04moL·L-1KH2PO4（54∶10∶36，V/V/V），流速：1.0mL·min-1；柱温：40℃；进样量：5.0μL；检测波长：254nm。2.2纳米粒的制备采用改良的自乳化溶剂挥发法制备[8]。将PLGA和RB溶解于有机相二氯甲烷中（PLGA和RB的比例为2:1,本实验分别取0.4g和0.2g，二氯甲烷取6mL），充分溶解后将该溶液加入20mL浓度为2%聚乙烯醇（PVA）水溶液中，使用高速均质机16000r高速均质10min。均质后用搅拌子恒速搅拌过夜，挥发有机相。而后将所得的纳米粒溶液进行两次离心，第一次离心4000r×10min，取上清液，第二次离心16600r×20min，舍弃上清液，收集沉淀（即为所得载药纳米粒），去离子水洗涤三次，EP管定容1mL，超声混匀（注意温度不能高），离心13000r×10min，将得到的RB-PLGA纳米粒富集冻干保存。2.3RB-PLGA纳米粒的相关评价2.3.1粒径、载药量（DL）和包封率（EE）的测定方法粒径：采用Zetasizer纳米粒度电位仪进行测量分析DL、EE：取第二次离心后的上清液，用高效液相色谱法法[9]测定含量，根据其中RB等物质的量计算DL和EE，计算公式如下：2.3.2体外释放研究预处理：首先用配置好的２％碳酸氢钠（NaHCO3）、EDTA溶液（1mmol／Ｌ，pH=8.0），将透析袋先后在碳酸氢钠溶液和EDTA溶液中煮沸10min。而后直接将浸有透析袋的EDTA溶液放入冰箱４°Ｃ保存以备用。称取纳米粒3.7mg/0.5mL，装于处理好的透析袋（截留分子量为12000）中，加入已配制好的PBS（pH=7.4）溶液1mL，透析袋两端用橡皮筋扎紧使其不漏液，取PBS（pH=7.4）溶液30mL作为释放介质置于50mL锥形瓶中，保证透析袋完全浸泡在PBS溶液中，溶液温度保持在37±0.5℃范围内，使用振荡器恒速缓慢搅拌，分别于第1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h及144h，每次提取透析袋外的溶液1mL，同时向锥形瓶中补加的温度为37±0.5℃PBS1mL。分别将各时间点取的样品溶液16000r离心后，用高效液相色谱法检测各时间点的上清液，算出其中的药物含量，通过累积释放百分率[10]绘制出释放曲线，以此分析其释放特点。计算公式如下:累积释放百分率%=Qt/Q总×100%，Qt为t时释药量，Q总为总释药量。（式3）绘制体外释放曲线时，取样时间为横坐标，累积释放百分率为纵坐标。对药物的释放曲线分别用零级释放模型，一级释放模型，Higuchi模型，Hixcon-Crowell模型，Ritger-Peppas模型，Weibull模型进行拟合，得出拟合度最高的模型。2.3.3溶血实验用肝素管采集新鲜人血（采集前获取知情同意），3000rpm10min离心除去血浆，富集的红细胞再用生理盐水清洗，3000rpm10min离心富集，重复上述操作直至上清液澄清。而后将红细胞溶液用生理盐水稀释至浓度为2%（v/v）。取0.3mL2%的红细胞溶液加入1.2mL本实验制得的RB-PLGA纳米粒溶液。将RB-PLGA纳米粒设为浓度为100、200、400和800ug/mLl四个梯度进行实验。同时，用蒸馏水和生理盐水做阳性和阴性对照，生理盐水RB-PLGA纳米粒为空白对照。将各EP管轻微摇晃均匀后，37℃水浴加热2h，观察上述各EP管是否有粘集或溶血现象，2h后1500rpm×5min离心，取少量上清液，用酶标仪测定其在540nm处的吸光值，并用公式计算出各浓度纳米粒的溶血率。（式4）3结果3.1RB-PLGA纳米粒的粒径、载药量（DL）及包封率（EE）由图1可知，三次测量制得的利福布汀纳米粒的平均粒径为290.9nm，且通过比较三次测量的粒径分布，粒径分布于100nm--800nm之间，符合纳米制剂的要求，且纳米制剂粒径大都集中在290nm左右，粒径较为均一。由计算公式1、2得出，制备的RB-PLGA纳米粒的载药量为（16.1±3.1）％、包封率（60.2±4.0）％。图1RB-PLGA纳米粒的粒径及分布3.2体外释放由图2可见，RB-PLGA纳米粒的释放过程较平稳，没有出现突释现象。第7天（168h）时的累积释放度为50.65%（见表1）。将所得数据用不同模型进行拟合，Higuchi模型、Ritger-Peppas模型和Weibull模型的拟合度较高，拟合度在0.9以上，其中以Weibull分布函数拟合度最高(r=0.963)，提示利福布汀纳米粒体外释放符合该模型规律（见表2）。表1利福布汀纳米粒时间（h）累计释放度0.53.64%16.46%28.02%314.18%820.88%2432.29%4841.21%7246.49%9648.71%12048.93%14449.52%16850.65%图2纳米粒拟合曲线表2RFB-NP的体外释放的拟合方程拟合模型方程r零级释放方程Q=0.101t+5.7060.774一级释放方程ln(100-Q)=-0.001t+4.5420.765Higuchi模型Q=1.476t1/2+2.4390.926Ritger-Peppas模型lnQ=0.437lnt+0.9030.962Hixcon-Crowell模型（100-Q）1/3=-0.002t+4.5520.806Weibull模型Lnln(1/1-Q)=0.456lnt-3.6860.9633.3溶血性由图3可知，37℃水浴的2h后，各浓度梯度的管与阴性对照组的管出现粘集现象，阳性对照组出现溶血现象。根据溶血率计算公式算出各浓度RB-PLGA纳米粒的溶血率，由表3可知，阴性对照即生理盐水纳米粒溶血率为零，阳性对照即蒸馏水组溶血率为100%，浓度为100ug/mL的含药纳米粒溶血率小于0.01%，200、400、800ug/mL的含药纳米粒溶血率分别为0.006159%、0.045539%、0.07705%。据文献所知，当溶血率低于1%表示样品没有溶血性且溶血率不应高于5%时。由此得知，800ug/mLl及以下浓度的RB-PLGA纳米粒没有溶血性，生物相容性优，可以应用在临床上。图3纳米粒水浴2h后现象表3RB-PLGA纳米粒溶血率浓度（ug/mL）RFBNP100200400800阴性对照阳性对照空白对照10.07360.07850.09570.10580.07020.62580.032220.06940.07250.10520.11210.07560.65120.035130.06850.07120.10240.11890.07310.64250.036440.07490.07520.09010.12510.06890.59420.031150.07150.07790.09380.11670.070.63830.0344均值0.071580.075060.097440.115720.071560.63040.03384阳性-阴性0.5683溶血率（%）<0.00010.0061590.0455390.0777054讨论与结论在近几十年对纳米制剂的研究探索中，纳米制剂的制备方法有很多，大体上有四种，分别为乳化聚合法、凝聚法、分散法和纳米沉淀法，其中分散法又可分为乳化溶剂挥发法和扩散法、超临界流体快速膨胀法反溶剂法。而应用在实验室中的方法通常采用制备程序较为简单的乳化溶剂挥发法。由于氯仿具有较强毒性，人们对乳化溶剂挥发法进行改良，将有机相的氯仿换成毒性较小的二氯甲烷或丙酮。本次制备方法参考陶涛等人的实验研究，对乳化溶剂挥发法进一步改良，将PLGA（LA/GA=75:25）改为PLGA（LA/GA=50:50）,使其溶解性更好，采用均质机使纳米粒粒径更为统一。粒径大小及分布决定着药物的安全应用，本实验制得的RB-PLGA纳米粒平均粒径为290.9nm，在纳米制剂的粒径范围内属于粒径较小的一种，粒径小有利于纳米粒在血液、组织及器官中的分布，但其粒径大于100nm，不能躲避网状内皮系统的吞噬[11~13]。包封率和载药量是评判纳米制剂质量的重要指标，载药量大可以节约载体的成本以及减少给药数量及间隔，而包封率的高低决定了药物的有效使用量，高包封率可以减少药物的浪费。本实验制得的RB-PLGA纳米粒载药量为（16.1±3.1）%，包封率为（60.2±4.0）％。对比陶涛等人制得的RB-PLGA纳米粒，该实验纳米粒的载药量和包封率与其相差不大，但粒径上本实验的纳米粒粒径更小、更均一。RB-PLGA纳米粒的体外释放研究方法采用使用率较高的动态透析法，操作简单，精确度较好。对药物的释放曲线使用零级释放模型，一级释放模型，Higuchi模型，Hixcon-Crowell模型，Ritger-Peppas模型，Weibull模型进行拟合，其中Weibull模型的拟合度表现出最高水平，该模型是缓控释药物释放分布模型的一种，说明该实验制得的纳米粒符合缓控释药物剂型的要求，缓释效果较好，为以后的实验研究提供理论基础。除了载药量与包封率是纳米制剂的重要评价标准，生物相容性也是纳米制剂中的一项重要指标，PLGA具有良好的生物相容性、毒性小，最终代谢为二氧化碳和水[14]。本实验通过溶血率来评价药物的生物相容性及安全性。在PalanirajanVijayarajKumar[15]等人的实验研究里提到，用酶标仪测定上清液541nm处的吸光值。该实验测得RB-PLGA纳米粒的溶血率较好，在聂玲辉[16]的研究中，也采用了相同的方法及辅料制备纳米粒,该学者所制得的纳米粒的溶血率为0.244%，而本实验800ug/mL的纳米粒溶血率为0.077705%，产生较大差异的原因是药物不同、浓度不同。因此生物相容性的优良PLGA占了很大部分影响的同时，药物、浓度也对安全性有大联系。综上，采用改良后的乳化溶剂挥发法顺利制出RB-PLGA纳米粒，且粒径符合纳米粒要求，载药量和包封率良好，安全性能好和缓释能力佳，不足之处是制备所用有机相二氯甲烷仍具有毒性，可以采用毒性更小或者没有毒性的丙酮和乙醇。参考文献WorldHealthOrganization.Globaltuberculosisreport2017.Geneva:WorldHealthOrganization,2017.张怡,孙峰,张文宏.耐多药结核病治疗指南的发展趋势[J].中国防痨杂志,2018,40(2):135-139.韩发惠.利福布汀治疗耐多药肺结核病的临床应用观察[J].当代医学,2014,(17)学,2014,(17):142-142.DOI:10.3969/j.issn.1009-4393.2014.17.102.杨伟丽.纳米靶向制剂应用的研究进展[J].广东化工,2019,46(11):121+120.ZhangJ,TaoW,ChenY,etal.Doxorubicin-loadedstar-shapedcopolymerPLGA-vitaminETPGSnanoparticlesforlungcancertherapy[J].JournalofMaterialsScienceMaterialsinMedicine,2015,26(4):165.FengShuibin,NieLei,ZouPeng,SuoJinping.Drug-loadedPLGA-mPEGmicromicroparticlesastreatmentforatopicdermatitis-likeskinlesionsinBALB/cmicemodel[J].Journalofmicroencapsulation,2015,32(2):201-9.陶涛,邢贞建,李祥.利福布汀-PLGA纳米粒的制备[J].中国药房,2012,23(41):3901-3903.邢贞建,陶涛,李祥.高效液相色谱法测定利福布汀的含量[J].临床合理用药杂志,2011,4(29):80-81.国家药典会员会.中华人民共和国药典[S].二部.北京:中国医药科技出版社,2010:附录202.陶涛,李祥,邢贞建.利福布汀纳米粒的体外释放研究[J].今日药学,2013,23(01):8-10.MehtaSK,KaurG,BhasinKK.Incorporationofantituberculardrugisoniazidinpharmaceuticallyacceptedmicroemulsion:effectonmicrostructureandphysicalparameters[J].PharmRes.2008,2