高锡对雏鸡肠道微生物菌群的影响

高锡对雏鸡肠道微生物菌群的影响Effect

of

high

Tin

on

intestinal

Microflora

in

Chicks目录摘要 1关键词 21.前言 21.1国内外研究进展 21.1.1锡的理化性质 11.1.2锡的吸收和分布、排泄 11.1.3锡在机体内作用机制 11.1.4锡缺乏症 21.1.5锡中毒 21.1.6肠道微生物菌群 21.2研究目的 32.材料与方法24796_WPSOffice_Level1 33.实验结果及分析 74.讨论： 12参考文献 14致谢 16高锡对雏鸡肠道微生物菌群的影响摘要:锡作为动物生长发育必须的微量元素之一，它具有多种功能其中主要包括促进生长发育、血红蛋白分解、以及机体组织愈合，甚至抑制癌细胞的增殖。研究表明每天的基础饲料添加锡含量达400mg/kg及以上能使雏鸡的精神萎靡、食欲不振，导致雏鸡的生长发育变的缓慢，并且雏鸡肠道微生物菌的多样性降低和肠道菌群组成成分发生变化，且伴随严重的腹泻症状，严重的造成死亡。关键词：高锡；雏鸡；腹泻；肠道微生物菌群Abstract：Tin,asoneofthetraceelementsnecessaryforanimalgrowthanddevelopment,hasmanyfunctions,includingpromotinggrowthanddevelopment,hemoglobindecomposition,andtissuehealing,andeveninhibitingtheproliferationofcancercells.Accordingtothestudy,addingmorethan400mg/kgoftintothebasicfeeddailycanmakethechicks'mentalmalaiseandlossofappetite.Keywords:tin;chicks;intestinalmorphology;intestinalmicroflora前言1.1国内外研究进展1.1.1锡的理化性质锡（tin），银白色金属。展性大，抗蚀性好。原子量118.7，比重5.75，熔点232℃，沸点2260℃[1]。锡容易与其他物质发生化学反应形成有机锡和无机锡。自然界中的锡一般无机锡化合物的形式存在，不容易被空气氧化，主要以矿石为主。有机锡是锡元素碳元素结合形成的有机物，常温状态一般多为固体和液体，不易溶于水，容易溶于有机物。锡是人体生命活动必需的微量元素之一,它具有促进生长发育、血红蛋白的分解、机体组织生长和创伤愈合的功能,抑制癌细胞的生成。人体如果长期缺乏锡会影响生长发育,摄取过量锡则会出现中毒症状[2]。肠道作为吸收营养的主要部位，每天饲料中添大量的氯化亚锡含会改变雏鸡肠道形态,引起严重的腹泻，阻碍雏鸡的生长发育，严重时造成雏鸡死亡。肠道微生物在雏鸡的生长发育过程中起着非常重要的作用，菌群能够辅助肠道对一些营养物质的吸收，增强肠道免疫力还对保护肠道起正向作用。肠道微生物群在肠道病原菌感染和威胁期间维持和促进免疫稳态中起积极作用。1.2锡的吸收和分布与排泄锡作为动物生长的必须微量元素之一，各器官吸收量不同，以三甲基氯化锡(TMT)的吸收、分布、排泄规律，红细胞中锡浓度远大于其他主要脏器,且红细胞浓度最高脾次之然后再是肾脏[3]。三甲基氯化锡能够被机体在短时间吸收,通过血液循环,可通过血脑屏障进入大脑,最后缓慢经尿排出。1.1.3锡在机体内作用机制锡是动物生长发育过程中必需摄入的微量元素之一，牙膏中含有锡能防止牙质腐蚀，锡与体内蛋白质、酶和核酸合成有关，且能维持机体内环境稳定[4-5]。在雏鸡饲料中添加少量氯化亚锡，能促进生长发育[6]。锡还能影响其他微量元素的代谢，如同时给药老鼠锡和铁，发现锡能显著的降低老鼠肠道对铁的吸收，从而引起机体贫血[7-8]。1.1.4锡不足症状缺锡则导致人体发育迟缓,特别是儿童,锡补充不够会影响身体的正常生长发育,严重者可引起侏儒症。动物实验证实缺锡可使动物生长发生障碍,补锡后可加速生长[9]。1.1.5锡过量症状长期或者大量食入会无机锡中毒，当人体摄取过量无机锡可出现中毒症状，症状轻的出现恶心和腹泻、精神不振，口内有金属味等,严重的出现腹部疼痛、狂躁不安、甚至丧失等症状。机锡化合物中毒会影响神经系统,引起严重疾病,会出现头痛头晕、睡眠障碍、四肢乏力、记忆减退、恶心呕吐、胸闷心悸、耳鸣等非特异性表现[10]。雏鸡氯化亚锡中毒可能会出现腹泻、精神不振、发育迟缓，甚至出现死亡。1.1.6肠道微生物菌群肠道菌群是微生物组成的一部分，它参与动物生长、发育、消化、吸收、营养、免疫等各种功能和结构发生、发展和衰退的全过程[11]。肠道正常菌群是其与宿主共同进化形成的相互制约、互利共生的微生态[12-13]。雏鸡的肠道微生物菌群非常多样性，微生物菌群与宿主的肠道和整体健康关系是局部作用整体，整体影响局部。肠道菌群的生理功能包括营养作用、代谢作用、生物拮抗和免疫刺激等,肠道菌群紊乱会使机体适应性免疫及固有免疫受损,增加感染性疾病的发生风险。肠道真微生物菌群对维持肠道生态平衡有着重要的作用，一些菌群的缺少或者一些菌群的大量繁殖都会影响肠道的健康，从而导致机体发病。肠道微生物菌群代表了有益屏障功能，有益营养物质、蛋白质的合成，从日粮成分中获得能量的潜力及炎症和亚临床病理的有害影响之间的权衡[14]。肠道微生物群可分为两种不同的生态系统:肠腔微生物群(主要存在于粪便中)和黏膜微生物群(与黏膜结合并黏附于肠上皮细胞),通常可从肠道和粪便中分离得到。1.2研究意义该实验探究锡含量对肠道微生物菌群的影响。近年来，随着科学的不断进步，我国又是养禽大国，科学界对于鸡饲料和相关的药物的研究也越来越透彻，但是高锡对雏鸡肠道微生物菌群影响这方面研究还可以继续深入，从而为雏鸡的饲养提供更加全面的理论基础。材料与方法2.1实验动物与饲料一日龄健康三黄鸡350羽、购买于衡阳县鼎立农牧。实验用的基础日粮为自制鸡饲料。2.2主要试剂氯化亚锡购买于亚泰联合化工有限公司细菌DNA提取试剂盒购买于杭州昕诚生物科技有限公司2×EasyTaqPCRSuperMix,购买于南京腾达生物有限公司2.3主要器械制冰机（型号：IMS-30）购买于沃拓莱旗舰店；电热恒温干燥箱（型号： 202型）购买于力辰仪器五金专营店电子天平（型号：30kg/0.1g）购买于花潮高科旗舰店；氮液罐(规格:10L)购买于恩莱科技旗舰店。2.4实验分组将350羽一日龄三黄鸡雏鸡统一喂养2~3天，减少雏鸡环境应激。然后取情况整体相差无几的三黄鸡300羽，随机分成五组A、B、C、D、E，对照E组喂养普通全价鸡饲料，实验A组在饲料中添加锡含量200mg/kg、B组400mg/kg、C组600mg/kg、D组800mg/kg的氯化亚锡，E组为对照组喂养普通鸡饲料。实验过程中，每天喂养期间需要对雏鸡进行临床观察并记录情况。每天早上八点和晚上六点观察和记录鸡的临床症状。实验期间的第6天、13天、20天、27天、34天、41天的晚上对雏鸡禁食禁饮八个小时，禁食禁饮后的次日早上八点每一组随机取5只，共25只鸡进行称量，统计鸡的增重状况。称重完成后的三黄鸡，带到实验室进行处死，然后在超净工作台解剖雏鸡尸体获取整个肠道。肠道样品的采集，在试验分别进行到21和42日天时，每组随机抽取5只雏鸡颈动脉放血处死。局部去毛放置污染，带上检查手套然后打开雏鸡腹腔，分离出回肠和盲肠，在无菌超级洁净工作台上提取肠道内容物，迅速放入干燥管中，放入事先备好的液氮罐里，保存放入-20℃冰箱。表1试验方案设计分组试验设计饲料组成1高锡A组基础饲料+200mg/kg2高锡B组基础饲料+400mg/kg3高锡C组基础饲料+600mg/kg4高锡D组基础饲料+800mg/kg5对照E组基础饲料2.5

聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）DNA的提取，使用杭州昕诚生物科技有限公司的细菌DNA试剂盒提取雏鸡肠道细菌的DNA，取出冰箱中肠道内容物放入研磨仪中，研磨时加入液氮防止样本融化，充分研磨后使用移液管加入650μL加入试剂盒中，65℃恒温15分钟。最后将试剂盒中提取的肠道细菌DNA放入无菌干燥管中，放置在-20℃冰箱保存备用。基因组总DNA16SrDNAV3区扩增，采用引物341F（5＇-CCTACGGGACGCAGCAG-3＇）和907R（5＇-CCCCGTCAAT-TCATTTGAGTTT-3＇）对细菌所有DNA进行一轮PCR扩增。以前面叙述的扩增样品为模板用引物341F-GC(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCCGGGGGG-CCTACGGGAGGCAGCAG-3＇)和518R(5＇-ATTACCGCGGCTGCTGG-3＇)进行第二轮扩增，制备细菌16SrDNA基因V3区[15]。反应体系见下表表2-1,设置PCR反应程序如下：第一步95℃预变性5min；维持95℃变性30s，第二步53℃退火30s，第三步再72℃延伸1min，第四步反复40个循环；第五步72℃延伸7min。完成后分别将PCR扩增产物在有添加聚丙酰胺的琼脂糖凝胶（1.2%）上电泳，电泳检测时间24小时，然后紫外光下观察扩增效果。表2扩增基因组16SrDNAV3区片段的PCR反应体系一次扩增,FirstPCR二次扩增,SecondPCR添加量Content,μLTaqDNA酶(TaqDNApolymerase)TaqDNA酶(TaqDNApolymerase)5上游引物(314F)上游引物(314F-GC)1下游引物(907R)下游引物(518R)1无菌水(ddH2O)无菌水(ddH2O)41DNA模板(DNATemplate)DNA模板(DNATemplate)2合计（Total）50变性梯度凝胶（DGGE），按照40%和70%梯度进行DGGE凝胶电泳，40%和70%胶溶液的配制见表3，配置完成后去除气泡后，放置冰箱保鲜用。表3变性胶的配制Table5-2Ingredientsofdenaturinggel试剂40%变性剂70%变性剂尿素2.90g5.60g40%丙烯酰胺（38：2丙烯酰胺:双丙烯酰胺）3.600mL3.600mL50×TAE缓冲液50×TAEbuffer400uL400uLTEMED17uL17uL甲酰胺2.5mL2.5mL去离子水定容至20mL定容至20mL（1）灌胶首先准备干净的玻璃板把它放在灌胶架上固定。检查灌胶器的连通阀是否关闭，没有关闭需要关闭，之后分别向40%和70%胶中加入60μL100mg·mL-1的过硫酸铵溶液和30μL四甲基乙二胺，缓慢混合均匀，然后打开灌胶泵开启连通阀，匀速灌胶。(2)灌胶结束后，马上进行压液向灌胶液表面缓慢注入无菌水。等待50分钟后倒掉表面的无菌水并用吸水纸吸干玻璃板上的无菌水，插入适宜的梳子后配制上层胶。取变性剂

4

mL加入60

μL

100

mg·mL-1的过硫酸铵和30

μL

四甲基乙二胺，手动缓慢摇匀后注入玻璃板上，等待50min让其凝结，等胶完全聚合后拉出梳子，观察孔的形状，然后用无菌水清洗干净胶孔，洗去未凝结的变性剂。

(3)将新鲜配制的十倍稀释TBE缓冲液加入到电泳槽中。打开电泳槽的控温装置，加热至60℃。加热完成后将含胶玻璃板固定在电泳基座上，将电泳基座放入电泳槽中，盖上盖继续打开加热装置和打开水泵开关。打开电泳设备最上面的盖子，将16SrDNAV3区扩增产物与上样缓冲液混合均匀，取30μl加入到加样孔中，盖上盖子。设置电泳电压150

V，开始电泳。24min后，把加热装置和水泵开关、电源关闭，冷却至室温后将基座取出，取下玻璃板和凝胶，并用无菌水缓慢冲洗数次，准备染色。

(4)染色使用溴化乙锭对凝胶进行避光染色。在凝胶加入0.5μg/ml的EB，等待10分钟后用无菌水漂洗干净，转移至UVP凝胶成像系统上进行DGGE凝胶图像采集和分析。实验结果及分析3.1临床症状每一次测体重的时候进行临床观察，注意对照组和实验组所有雏鸡的采食量、精神状况、发病情况。观察得出了以下结果，实验开始的前三天，雏鸡没有异常表现，实验的第四天A组、B组和E组正常，C组和D组小部分雏鸡出现嗜睡的情况，一周过后，C组和D组嗜睡情况更加严重，且少量雏鸡出现拉稀，D组情况比C组严重。A组、B组和E组情况正常，但是A组和B组雏鸡体格状况优于E组。两周后C组和D组腹泻更加严重，且没有食欲，嗜睡，有出现死亡,E组、A组、B组雏鸡的精神状况和食欲明显比C组、D组的情况要好很多。三周后C组和D组情况未有好转陆陆续续死亡。实验结果表面，少量的锡有利于雏鸡健康，短时间食入大量锡不会表现临床症状，长时间大量食入锡会造成雏鸡精神萎靡，腹泻，严重导致死亡。3.2雏鸡的体重变化结果表4雏鸡体重高锡A组(g)第一周5149556059第二周7568726978第三周9885898691第四周146186181143157第五周200230270250261第六周364401358398390高锡B组（g）第一周5149556051第二周7568726975第三周9876898586第四周146186181153146第五周200230270200250第六周365401367398364高锡C组(g)第一周4136424737第二周6568726971第三周7885817669第四周12113011590105第五周180203220258216第六周256248269258220高锡D组(g)第一周4142424551第二周5149564849第三周5965494656第四周7565687480第五周9687779488第六周10512612599101高锡E组(g)第一周4850466047第二周7568726978第三周9885898669第四周145186124157181第五周230270220258261第六周361401369390388从表4体重得出B组体重总体增长幅度>A组>E组>C组>D组>，实验第一周五组体重相差无几，实验第二周B组的增长速度开始领先，A组和E组与B组相差较小，C组和D组相比B组较落后，到了实验第三周和第三周，C组和D组远远落后其他组。A组与B组相比数据可以得出以下结论，A组与对照组相比A组的增重幅度高于对照组，说明锡元素，B组生长的速度更快，说明雏鸡生长发育需要一定含量的锡。C组和D组与B组相比增重幅度大幅度下降，而且C组和D组多数雏鸡是患病状态。在三周日龄的时候高浓度锡虽然影响了雏鸡生长速度，情况却不是特别严重，但是六周天后雏鸡的情况更加差了这说明了长时间锡元素含量过高会影响雏鸡的生长速度。3.3菌群的变化情况图1可以看出，雏鸡21日龄时，对照组和实验组前面都具有条带八和条带七，A组与对照组相比条带6特别明显，C组和D组条带6也十分不明显，条带6在A组最明显；对照组、A组、B组、C组都有条带4唯独D组没有；对照组、A组、B组、C组都不具有条带14。42日龄对照组、A组、B组出现了条带9，D组条带9不明显；条带15只出现在C组；B组和C组出现21日龄B组跟C组没有出现条带10和条带。说明了在这期间菌群有组成有较大的变化，这可能是导致腹泻的原因之一。对聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳实验结果进行分析，表3-1中可以看出21日龄时，A组相似性系数为79%、B组为72%、C组为67%、D组为61%相比；氯化亚锡含量越高，相似性系数越低，说明了氯化亚锡肠道微生物菌群发生了改变。A组和对照组相似性系数虽然都差别，但是根据临床观察，该两组没有严重的腹泻，说明肠道菌群略微改变不影响健康。而到42日龄时，与对照组相比，雏鸡肠道内容物肠道菌群的相似性系数A组、B组为83%，80%，说明肠道微生物菌群变化程度不大，未造成严重的影响。但是C组和D组相似性系数分别为59%、55%，肠道微生物菌群变化十分明显，造成严重的影响。说明了肠道菌群的改变跟锡浓度和持续吸收的时间有关。且42日龄的B组跟C组两者相似性系数相差较大与21日龄B组和C组相似性系数相差较小说明持续吸收高锡时间越长，对肠道微生物菌群影响越大。总之，锡浓度和持续食入锡时间的长短都对肠道微生物菌群有影响。根据表5实验数据，雏鸡21日龄A组和B组与对照组菌群的丰富度接近，到了42日龄实验组、A组和B组菌群丰富度上升的幅度也相差无几。然而C组和D组在21日龄与对照组菌群的丰富度有较大的差异，42日龄C组和D组相对21日龄菌群丰富度有上升，丰富度低于对照组。21日龄对照组香农指数>A组>B组>C组>D组。图1变性梯度凝胶电泳实验结果实验数据表5菌群丰富度、香农指数、相似性系数实验数据丰富度21天24天A组2628B组2627C组1722D组1518E组2831香农指数21天24天A组2.93.1B组2.83C组2.62.8D组2.52.6E组3.13.2相似性系数21天24天A组79%83%B组27%80%C组67%59%D组55%65%E组100%100%讨论传统的方法一般是先是获取动物肠道然后提取肠道内容物进行稀释，再使用不同的培养基培养细菌，接种后的培养基放入恒温箱，等到三到五天再取出，观察培养基上面的菌落，然后再对菌落进行计数，最终达到对肠道菌群进行分离和鉴定。这种虽然方法能够简单、快速、有效的对肠道活的细菌进行鉴定，这种传统培养基培养法存在一定的局限性。因为在动物肠道内有部分微生物生长需要特殊的条件，传统的方法无法对这些肠道细菌进行分离鉴定。然而分子生物学技术的应用和普及为更加深入和精准的研究肠道微生物菌群提供了新的基础。变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术在16SrRNA分析技术的基础上进一步对微生物多样性进行分析，具有重复性好，快速高效检测突变DNA片段的优点[16]。现在该方法仍被广泛的用于动物肠道微生物菌群的研究。人们利用PCR-DGGE技术发现在饲料中添加膳食脂类和抗生素能增加鸡回肠链球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌等菌群数量，饲料中其他有效成分也可能影响动物肠道多样性和组成。而且马[17]研究燕麦麸皮对大鼠肠道菌群的影响，大量研究表明动物肠道菌群分布、数量及种类会因为日常饲料的添加物而发生变化，所以维持动物肠道内菌群种类的正常与平衡是维持动物健康必重要因素。造成雏鸡发育不良甚至死亡的原因很多，肠道微生物菌群紊乱是一个十分重要的因素。牛胃中的纤毛虫能够帮助牛分解和吸收胃中草料，说明肠胃里的部分微生物能够对机体起到积极作用。正是肠道微生物与肠道两者的关系密不可，菌群出现了问题，也会导致肠道出现疾病从而导致腹泻，局部影响整体严重是造成死亡。罗雯[18]研究显示肠道微生物群落结构与肉鸡个体长势显著相关,显著差异菌群可应用于改善肉鸡生长性能。Zeng等[19]探讨饮食习惯与人体肠道菌群分布之间的关系，好的饮食习惯能够改善肠道菌群。Luo[20]等发现雏鸡饮食高氟也能改变肠道菌群对组成和多样性，但由于高氟导致肠道某些细菌群落的异常膨胀或消亡，从而对肠道产生负面影响。这说明了饲料中多数成分都能够对雏鸡肠道微生物菌群造成影响。有些研究也表明，饲料中添加过量的金属元素都会对肠道微生物菌群带来坏处，而且也报道过人体摄入过多的锡会导致腹泻。通过这个实验，我们进行临床观察发现，腹泻现象普遍存在雏C组和D组，D组腹泻随实验时间越长，腹泻越严重，最后造怒放雏鸡死亡。因此，我们推测长时间食入过量的锡会改变雏鸡肠道菌群的多样性和组成，从而导致雏鸡腹泻。参考文献[1]王翔朴,王营通,李珏声.卫生学大辞典:[M].青岛:青岛出社,2000(7):1035.[2]吴茂江.锡元素与人体健康[J].微量元素与健康研究,2013,30(2):66-67.[3]武昕,谢玉璇,李颖超等.三甲基氯化锡在SD大鼠体内的吸收、分布、排泄研究[J].中国工业医学杂志,2013,26(6):409-41[4]张春善.动物必需微量元素营养学[M].高等教育出版社，2007.Yu,H,WegehauptF

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