CN118813434B 高产聚乳酸的重组酿酒酵母、其构建方法及其应用 （陕西海斯夫生物工程有限公司）

篇第1-16页.本发明公开了一种从头合成聚乳酸的重组酿酒酵母，所述酿酒酵母工程菌是在酿酒酵母BY4741中敲除丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶酸乙酰辅酶A转移酶突变体YDIFF199Y_D358L基因构瓶发酵中实现聚乳酸的产量达到133mg/gDCW，21.一株产聚乳酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述酿酒酵母工程菌是以酿酒酵母YDIF突变体和PHA合成酶基因PHAC，并缺失丙酮酸脱羧酶基因PDC1和乙醇脱氢酶基因ADH1雷菌的乙酸辅酶A转移酶基因YDIF基因的199位从苯丙氨酸突变为酪氨酸，其核酸序列如2.乙酸辅酶A转移酶基因YDIF突变体在提高酿酒酵母工程菌株的聚乳酸产能中的应是将如SEQIDNo.7所示的来源于居泉沙雷菌的乙酸辅酶A转移酶基因YDIF基因的199位从扩增大肠埃希氏菌来源D_乳酸脱氢酶基因LDHA，将扩增片段插入至pY26粒pY26TEF_LP的NotⅠ位点，分别获得质粒pY26TEF_LP_YDIFF1pY26TEF_LP_YDIFF199Y_D3以酿酒酵母BY4841基因组为模板PCR扩增PCD1和ADH1基因的上下游同源臂，所得上游和MluⅠ酶切的ploxpura3loxp载体上，分别得到质粒ploxpura3loxp_PDC1和将如SEQIDNO.13所示的Cre基因合成至pUC57载体上得到载体pUC57_Cre，以pUC57_得菌株经PCR验证正确后命名为BY4741_1，BY4741_1即敲除PDC1基因的酿酒酵母BY4741菌3除PDC1和ADH1基因的酿酒酵母BY4andAdaptiveEvolutionforEfficientProductionofl_LacticAcidinT,SunL,ZhangC,LiuY,LiJ,DuG,LvX,LiuL.CombinatorialmetabolicengineeringandprocessoptimizationenableshighlyefficientproductionofL_lacticacidbyacid_tolerantSaccharomycescerevisiae.Bioresour细胞干重16Tan等[ChunlinTan,FeiTao,PingXu.Directcarboncapturefortheproductionofhigh_performancebiodegradableplasticsbycyanobacterialcell5乳酸合成关键基因乙酸辅酶A转移酶基因YDIF进行基因挖掘，考察不同来源的YDIF对重组菌的聚乳酸产能的影响，并尝试对乙酸辅酶A转移酶基因进行定点突变以期进一步提高聚肠杆菌(Escherichiacoli)，乙酸辅酶A转移酶基因YDIF来源于大肠杆菌(Escherichia因PHAC核酸序列如SEQIDNO.2所示；丙酮酸脱羧酶基因PDC1核酸序列如SEQIDNO.3所示；乙醇脱氢酶基因ADH1核酸序列如SEQIDNO.4所示；来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的乙酸辅酶A转移酶基因的核酸序列如SEQIDNO.5所示；来源于居泉沙雷菌源于艾伯特埃希菌(Escherichiaalbertii)的乙酸辅酶A转移酶基因的核酸序列如SEQID基因YDIF突变体是将来源于居泉沙雷菌的乙酸辅酶A转移酶基因YDIF基因的199位从苯丙[0012]本发明还提供乙酸辅酶A转移酶基因YDIF在提高酿酒酵母工程菌株的聚乳酸能成(Serratiafonticola)、芽孢杆菌(Bacillussp.oxB一1)或艾伯特埃希菌(Escherichia[0013]作为一种特别优选的实施方式，本发明还提供乙酸辅酶A转移酶基因YDIF突变体在提高酿酒酵母工程菌株的聚乳酸能成的应用，所述乙酸辅酶A转移酶基因YDIF突变体是将乙酸辅酶A转移酶基因YDIF基因的199位从苯丙氨酸突变为酪氨酸，或将第358位从天冬6200rpm条件下培养72h形成种子液，将种子液按照体积比2％的接种量接种到含150ml的发[0021]以酿酒酵母BY4841基因组为模板PCR扩增PCD1和ADH1基因的上下游同源臂，所得NdeⅠ和MluⅠ酶切的ploxpura3loxp载体上，分别得到质粒ploxpura3loxp_PDC1和[0022]将如SEQIDNO.13所示的Cre基因合成至pUC57载体上得到载体pUC57_Cre，以pUC57_Cre载体为模板扩增获得Cre基因，所得基因片段连接到经HindⅢ和SmaⅠ酶切的型培养基筛选出转化成功的单菌落，选取乙醇产量最低的菌株去除URA标记和JN44_Cre质粒，所得菌株经PCR验证正确后命名为BY4741_1，BY4741_1即敲除PDC1基因的酿酒酵母即敲除PDC1和ADH1基因的酿酒酵母BY47[0026]将步骤(1)的pY26TEF_LP_YDIFF199Y、pY26TEF_LP_YDIFD358L和pY26TEF_LP_氢酶基因LDHA、乙酸辅酶A转移酶突变体基因SfYDIFF199Y或SfYDIFD358L或SfYDIFF199Y_D358L和7[0029]本发明验证了乙酸辅酶A转移酶在酿酒酵母中具有良好的催化效果，可有效将乳酸催化为乳酰辅酶A从而进入下一步反应产生聚乳酸。本发明首次在酿酒酵母中引入聚乳选出SfYDIFF199Y_D358L突变体，该突变体可使酿酒酵母聚乳酸产量达133mg/gDCW，与Tan等[ChunlinTan,FeiTao,PingXu.Directcarboncapturefortheproductionofhigh_performancebiodegradableplasticsbycyanobacterialcellfactories[J]89[0046]YPD液体培养基：葡萄糖2酵母粉1蛋白胨2固体培养基另加入2％的琼脂2SO42SO4[0050]将重组酵母菌在含50mlSD_URA液体培养基中200rpm、30℃培养72h得到种子液，30℃；检测器为UV载体上，下游同源臂通过GibsonAssembly试剂盒连接到经NdeⅠ和MluⅠ酶切的[0060]Cre基因序列如SEQIDNO.13所示，将Cre基因送至金斯瑞生物科技公司合成至pUC57载体上，以pUC57_Cre载体为模板，设计上下游同源臂扩增引物Cre_F/R并扩增获得[0061]利用酵母转化试剂盒，将经ApaⅠ线性化的ploxpura3loxp_PDC1转化到酿酒酵母中诱导Cre蛋白表达，表达蛋白切割ploxpura3loxp_PDC1质粒的LOXP位点以去除URA标记，去除成功的菌株在YPD液体培养基中传代培养3次，第3次传代菌液涂布于含SD_LEU固体培发酵筛选后去除URA标记和JN44_Cre质粒，菌落PCR正确的菌株命名为BY4741_2(即敲除[0064]以大肠杆菌K12系列菌株BW25113基因组(NCBIReferenceSequence:NZ_用SD_URA培养基筛选获得产D_乳酸工程菌株BY4741_3(敲除PDC1和ADH1基因并转入LDHA基[0066]分别以GAP启动子和CYC1终止子启动和终止PHAC基因的转录起始和终止，以购自和ADH1终止子启动和终止不同来源的乙酸辅酶A转移酶基因的转录起始和终止，获取并合因至线性载体pY26TEF_LP上，获得重组质粒pY26TEF_LP_EcYDIF、pY26TEF_LP_CwYDIF、[0067]通过检测发酵液中乳酸及聚乳酸含量，以筛选出高产聚乳酸的重组菌株，以[0071]从PubChem下载底物D_乳酸分子(PubChemCID：61503)，以AlphaFold建模的(358)_D至线性载体pY26TEF_LP上，获得重组质粒pY26TEF_LP_SfYDIFF199Y、pY26TEF_LP_来源于居泉沙雷菌的乙酸辅酶A转移酶SfYDIF的突变体SfYDIFF199Y、SfYDIFV210E和酸的产量下降4.9而SfYDIFF199Y和SfYDIFD358L突变体使聚乳酸产量分别增加24％和(199)_U，YDIF(199/358)_M/和YDIF(358)_D至线性载体pY26TEF_LP上，获得重组质粒明州生物)和YPH499(购于明州生物)中，经SD_URA缺陷型培养基筛选出含有线性化质粒的名为INVSC1_1(即敲除PDC1基因的酿酒酵母INVSC1)和YPH499_1(即敲除PDC1基因的酿酒酵(即敲除PDC1和ADH1基因的酿酒酵母INVSC1)和YPH499_2(即敲除PDC1和ADH1基因的酿酒酵[0081]将实施例3中构建的质粒pY26TEF_LP_SfYDIF和pY26TEF_LP_SfYDIFF199Y_D358L分别转入酿酒酵母INVSC1_2，使用SD_URA培养基筛选，经PCR验证正确的菌株分别命名为INVSC1_3和INVSC1_4；将pY26TEF_LP_SfYDIF和pY26TEF_LP_SfYDIFF199Y_D358L分别转入酿酒酵母YPH499_2中，使用SD_URA培养基筛选，经PCR验证正确的菌株分别命名为YPH499_3和菌株进行发酵实验，结果如图4所示，比较各菌株聚乳酸产量发现，酿酒酵母INVSC1_2和YPH499_2本身不产聚乳酸，在引入聚乳酸途径后分别可产生90.21mg/gDCW和85.30mg/g[0083]以上实验结果可以看出，并非任意来源的乙酸辅酶A转移酶YDIF基因均能提高酿酒酵母产聚乳酸的能力，其中，来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)、居泉沙雷菌(Serratiafonticola)、芽孢杆菌(Bacillussp.ox