基于析因设计探讨六味地黄汤不同组方对56肾切除大鼠肾纤维化的影响

基于析因设计探讨六味地黄汤不同组方对5/6肾切除大鼠肾纤维化的影响［摘要］目的:基于析因设计探讨六味地黄汤及其拆方对5/6肾切除大鼠肾纤维化的影响及机制。方法：大鼠随机分为假手术组、模型组（A2B2）和六味地黄汤组（A1B1）、六味地黄汤“三补”组（“三补”组，A1B2）、六味地黄汤“三泄”组（“三泄”组，A2B1）。模型组予生理盐水灌胃，六味地黄汤组、“三补”组、“三泄”组分别用六味地黄汤原方、六味地黄汤“三补”、六味地黄汤“三泄”方药灌胃。干预8周后，观察大鼠肾功能变化、残存肾病理改变，分别用免疫组化和RT-PCR法检测残肾Jaggedl、Notchl、a-SMA蛋白（a-平滑肌肌动蛋白）、E-Cadhefin（E-钙黏蛋白）的表达及其mRNA的表达。结果：5/6肾切除大鼠肾纤维化明显，肾功能下降，经六味地黄汤及其拆方干预后，肾纤维化程度和肾功能均得到明显改善，这可能与六味地黄汤及其拆方抑制残肾组织Notch1/Jaggedl信号通路激活，抑制残肾组织中a-SMA表达、提高E-cadherin表达相关。六味地黄汤效果优于其拆方。结论:六味地黄汤及其拆方可以改善大鼠5/6肾切除术后肾脏纤维化，保护肾功能。六味地黄汤“三补”、“三泄”药物有协同作用。[关键词]：析因设计;六味地黄汤；肾纤维化大多数慢性肾脏疾病进展至中后期出现肾间质纤维化，主要表现为肾小管上皮-间充质转化、炎症细胞浸润和相关介质的释放、细胞外基质的过量积聚及进行性肾功能下降[1]。六味地黄汤是中医经典方剂，由三味具有滋阴补肾功能的药物（熟地黄、山茱萸、山药）、三味具有泄下性质的药物（泽泻、茯苓、牡丹皮）组成，现逐步应用于临床慢性肾脏疾病的治疗，并取得了一定疗效[2-3]。我们课题组研究表明，给予肾大部分切除大鼠六味地黄汤干预后，大鼠生存期延长，残存肾系膜细胞增生、间质纤维化减轻，这可能与六味地黄汤下调基质金属蛋白酶抑制物、血小板源性生长因子、肝细胞生长因子、转换生长因子等表达，減少细胞外基质生成有关[4-5]。本研究中，我们基于析因设计，观察六味地黄汤及其拆方对5/6肾切除术后大鼠肾功能的影响，进一步探析六味地黄汤抗肾纤维化的机制。1材料与方法1.1动物80只雄性SD大鼠，SPF级，体重200±15g，每笼4-5只，自由摄食、饮水。1.2药物和试剂1.2.1药物药材均购自医院药剂科。药液制备方法:药材浸泡2小时，大火煮沸，文火再煎熬半小时，收集煎液后原药渣再煎煮取二煎液。两煎液混合后浓缩。1.2.2试剂Notchl、Jaggedl、a-SMA单克隆抗体购自武汉博士德；免疫组化试剂盒购自中杉金桥；TRIzoIRNA抽取试剂盒、RT-PCR试剂盒购自Promega公司。1.35/6肾切除大鼠模型的制备按照文献方法制备模型。大鼠用10%水合氯醛麻醉，在肾上、下极分别切除肾1/3，一周后再摘除右肾。1.4析因试验设计选取因素A(纯补：熟地、山茱萸、山药）和因素B(纯泄：牡丹皮、泽泻、茯苓)为研究因素，每个因素各2水平（1用和2不用），设计实验方案如下表：表12×2析因设计及实验方案因素A因素BB1B2A1A2A1B1A2B1A1B2A2B2由表可见，A1B1组为六味地黄汤组，A1B2组“三补”组，A2B1为“三泄”组，A2B2为模型组。1.5动物分组及干预动物随机分为5组：假手术组仅同期打开腹腔后关腹；模型组术后予生理盐水灌胃，六味地黄汤组、“三补”组、“三泄”组分别用六味地黄汤原方、六味地黄汤“三补”、六味地黄汤“三泄”方药灌胃。给药剂量根据体表面积换算，为成人的6.3倍。干预中死亡老鼠予以剔除。术后共给药8周。1.6检测干预结束后大鼠断头取血，取出残肾。部分肾组织用福尔马林固定后脱水、包埋，其余部分-80°冻存。1.6.1组织学观察石蜡块切片厚约4µM，分别进行HE及Masson染色。显微镜下观察。1.6.2肾功能检测生化仪检测血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)含量。1.6.3免疫组织化学SP法检测肾组织Jaggedl、Notchl、E-Cadhefin、a-SMA蛋白的表达。用MOTIC彩色病理图像分析系统软件进行分析。1.6.4RT-PCR法检测肾组织中NotchlmRNA、JaggedlmRNA、E-CadhefinmRNA、a-SMAmRNA的表达。引物见表2.表2引物序列引物序列（5’-3’）扩增产物长度NotchlJaggedlCadherina-SMA上游GGAGCCAACAAAGACATGCA下游CATCCAAAAGCCGCACHATA上游TGCCGAACCCCTGTCATAAT下游TTCGCACCGGTACCAGTTAT上游CAGGATTACAAGTTCCCGCCA下游CACTGTCCGCTGCCTTCAG上游GCTCTGTAAGGCGGGCTTTG下游ACGAAGGAATAGCCACGCTCA1931763545581.7数据处理及统计学分析组间比较用单因素方差分析。药物交互作用采用析因设计方差分析。2结果2.1对残肾组织结构的影响2.1.1HE染色假手术组肾形态正常、结构清晰；模型组残肾可见部分肾小球局灶、弥漫性硬化，肾小囊扩张并可见壁层上皮细胞增生，肾小管代偿性扩张，肾间质大量炎症细胞浸润和纤维组织增生。与模型组比较，六味地黄汤及其拆方干预各组病理改变较轻，其中原方组病理改变显著改善。2.1.2Masson染色假手术组的肾脏形态正常，肾间质胶原纤维不明显;模型组残肾的肾间质可见胶原纤维呈蓝色；六味地黄汤及其拆方干预各组胶原纤维较模型组减少，其中原方组得到明显改善。2.2对肾功能的影响与假手术组比较，模型组血清肌肝、尿素氮水平明显升高。与模型组比较，六味地黄汤干预各组血清肌肝、尿素氮水平降低，差异有统计学意义。交互作用分析：六味地黄汤干预各组间均有改善肾功能的作用，纯补组效果优于纯泄组，且两者具有显著的协同增效作用。见表3。表3六味地黄汤及其拆方对肾切除术后大鼠血清肌肝、尿素氮的影响组别N肌酐（umol/l）尿素氮(mmol/l)假手术组1542.86±2.887.42±0.99模型组1279.80±4.12**12.73±0.74**原方组1361.47±5.27##10.59±0.71##纯补组1472.75±4.66#11.05±0.58#纯泄组1470.88±5.05#11.64±0.69#与假手术组比较，*P<0.05，**P<0.0,1；与模型组比较，#P<0.05、##P<0.012.3对残肾组织Jaggedl、Notchl、a-SMA、E-cadhefin蛋白表达的影响和假手术组相比，模型组残肾中Jaggedl、Notchl、a-SMA蛋白表达升高，E-cadhefin蛋白表达则降低；与模型组比较，六味地黄汤及其拆方干预各组Jaggedl、Notchl、a-SMA蛋白表达明显升高，E-cadhefin蛋白表达降低。交互作用分析：六味地黄汤干预各组均有降低Notchl、Jaggedl、a-SMA蛋白表达，改善E-cadhefin蛋白表达作用。交互作用分析：六味地黄汤干预各组间均有降低Notchl、Jaggedl、a-SMA蛋白表达，改善E-cadhefin蛋白表达作用。纯补组、纯泄组具有显著的协同增效作用。见表4。表4六味地黄汤及其拆方对肾切除术后大鼠肾脏Jaggedl、Notchl、a-SMA、E-cadhefin蛋白表达的影响组别NNotchlJaggedlE-cadhefina-SMA假手术组150.01±0.000.08±0.0221.78±2.542.07±0.83模型组原方组纯补组纯泻组120.57±0.07**130.21±0.04##130.34±0.05##140.38±0.10#0.45±0.16**0.28±0.13##0.37±0.14#0.40±0.13#9.26±1.09**57.08±6.19**16.27+1.83##20.87±2.58##12.63±1.75#30.93±2.42##11.55±1.59#29.46±3.05##与假手术组比较，*P<0.05，**P<0.0,1；与模型组比较，#P<0.05、##P<0.012.4对残肾组织中Notchl、Jaggedl、E-cadhefin、a-SMAmRNA表达的影响与假手术组比较，模型组残肾组织NotchlmRNA、JaggedlmRNA、a-SMAmRNA表达增加，E-cadhefinmRNA表达明显降低；与模型组相比，六味地黄汤及其拆方干预各组NotchlmRNA、JaggedlmRNA、a-SMAmRNA表达明显升高，而E-cadhefinmRNA表达降低。交互作用分析：六味地黄汤干预各组均有降低Notchl、Jaggedl、a-SMAmRNA表达，改善E-cadhefinmRNA表达表达作用。交互作用分析：六味地黄汤干预各组间均有降低Notchl、Jaggedl、a-SMAmRNA表达，改善E-cadhefin蛋白表达作用。纯补组、纯泄组具有协同增效作用。见表5。表5六味地黄汤及其拆方对肾切除术后大鼠肾脏Jaggedl、Notchl、a-SMA、E-cadhefinmRNA表达的影响组别NNotchlJaggedlE-cadhefina-SMA假手术组150.20±0.060.28±0.191.05±0.041.00±0.26模型组原方组纯补组纯泻组121.48±0.36**130.54±0.10##130.93±0.14##140.88±0.12#2.11±0.36**0.57±0.11##1.37±0.23#1.29±0.13#0.38±0.02*4.45±0.34*0.91±0.16#2.27±0.08#0.76±0.01#2.65±0.04#0.74±0.02#2.58±0.03#与假手术组比较，*P<0.05，**P<0.0,1；与模型组比较，#P<0.05、##P<0.013讨论现状大家逐渐认识到，慢性肾衰多属于虚实夹杂、本虚标实之证，本虚为肺、脾、肾虚损，尤以脾肾虚损贯穿整个慢性肾衰病程；标实是因三焦气化失职，导致外有外邪入侵，内有热毒、湿浊、瘀血等潴留。治疗应补脾脾肾，通腑降浊。六味地黄汤方中熟地黄、山茱萸、山药三味药物配合，肾、肝、脾三阴并补，称为“三补”，补肾为主；牡丹皮、茯苓、泽泻是“三泄”，泄虚热、泄肾浊、渗脾湿。六味药物合用，三补三泻，以补为主，泄为辅。由于其配方特点，六味地黄汤广泛应用于慢性肾脏疾病的治疗中。研究显示，Notch1在多种慢性肾脏疾病的肾组织中均呈高表达，Notch1表达上调可以加重肾间质纤维化程度［6］，这可能与其激活Notch1/Jaggedl信号通路有关[7]。a-SMA是肾小管上皮-间充质转化的表型标志，其表达量与肾间质纤维化程度呈正相关[8]。E-cadherin是细胞黏接分子,介导细胞之间黏附反应，参与调节分化，对维持组织的形态结构起重要作用。E-cadherin表达减少、上皮层的破坏是肾间质纤维化的始动环节[9]。本研究显示，六味地黄汤及其拆方均有保护肾功能，减轻肾间质纤维化作用，但六味地黄汤原方效果最明显。六味地黄汤可能通过抑制激活肾组织中的Notch1/Jaggedl信号通路，同时通过抑制残肾组织中α-SMA表达、提高E-cadherin表达，从而减轻肾间质纤维化的程度。六味地黄汤作为经典方剂，与单独使用“三补”、“三泄”药物相比，疗效明显。“三补”、“三泄”药物有交互作用，合用治疗慢性肾衰，具有显著的协同增效作用。这为今后进一步研究六味地黄汤治疗慢性肾衰提供了新的思路。[参考文献][1]EddyAA.Overviewofthecellularandmolecularbasisofkidneyfibrosis[J].KidneyIntSuppl(2011),2014,4(1):2-8.[2]许杰红,庞伟.六味地黄丸治疗慢性肾衰对内皮素、白介素-8及肌酐影响的临床研究[J].新中医,2004,36(7):11-12;[3]徐斌.加味六味地黄汤治疗慢性肾小球肾炎临床观察[J].中医药临床杂志,2013