CN119286938B PSR.Syn.CD19.CD38 CAR-T细胞的制备方法及其细胞和应用 （广东君厚生物医药有限公司）

WO2023274303A1,2023.01.05PSR.Syn.CD19.CD38CAR-T细胞的制备方法PSR.Syn.CD19.CD38CAR_T细胞是指所述CAR_T细胞与CD19抗原阳性肿瘤细胞共孵育后会诱导表达效应分子抗_CD38_CAR，肿瘤细胞同时表达2CAR_T细胞是指所述CAR_T细胞与CD19抗原阳性肿瘤细胞共孵育后会诱导表达效应分子抗_CD38_CAR，肿瘤细胞同时表达CD19和CD38抗原时，则才会识别杀伤肿瘤的CAR_T细步骤2：用步骤1制备的所述PSR载体表达SynNotch系统，将所述SynNotch系统的CD19和CD38的PSR.SynNotch载体，CD19作为诱导靶5.根据权利要求1_4任一所述方法构建的PSR.Syn.CD19.CD38CAR_T细胞。6.权利要求1所述的PSR.Syn.CD19.CD38CAR_T细胞在制备肿瘤药物中的应用。3[0002]CAR_T细胞疗法是将特异性抗原嵌合受体CAR的编码基因转入T细胞，然后再将细毒性与CAR_T细胞单一的机械的杀伤识区。胞外区(输入识别信号)可用靶向各种肿瘤细胞上游激活序列(UAS)结合后可特异性激活靶基因的转录，单纯疱疹病毒VP16蛋白可增强基[0006]SynNotch系统的响应程序代表了一种重构T细胞响应的策略，以SynNotchCAR_T一共2.5kb左右，系统可编辑区的输入信号分子(如CD19_scfv)和输出信号分子(如BCMA_4慢病毒载体进行双病毒转导T细胞会产生一个制备生产问题，即制备双阳性T细胞的效率由于上述原因极大限制了SynNotch系统CAR_T细胞治疗方面的应用，需要进一步进行受体所述PSR.Syn.CD19.CD38CAR_T细胞是指所述CAR_T细胞与CD19抗原阳性肿瘤细胞共孵育γ_RV载体，即PSR载体；步骤2：用步骤1制备的所述PSR载体表达SynNotch系统，将所述SynNotch系统的GAL4诱导载体和UAS效应载体合并在一个所述PSR载体上，使得所述的质粒载体；和步骤3：将上述逆转录病毒载体的质粒转导T细胞，制备得到所述PSR.Syn.CD19.BCMACAR56长达72h的共孵育监测，本发明细胞对RPMI_CD19细胞(双阳)和Raji_Lu肿瘤细胞(双阳)的杀伤效率高于PAN_T组，结果表明本发明细胞对RPMI_CD19肿瘤细胞和Raji_Lu肿瘤细胞都异。实验结果显示实验组本发明细胞与CD19阳性肿瘤(RPMI_CD19)共孵育后CD69表达效率(83.9％)与阳性对照组CAR21_T组相近(90.肿瘤细胞刺激下增殖速率高于PAN_T组。本发明细胞特异杀伤肿瘤时，大量分泌的IL_2，7[0032]图7是本发明萤光素酶法检测Syn_CAR188_T对不同靶细胞的杀伤效率(n＝3)结果[0033]图8是Incucyte法检测Syn_CAR188_T对不同靶细胞持久性杀伤效果(n＝3)图，其孵育；9E：CAR21_T细胞与RPMI_CD19共孵育；9F：CAR21_T细胞与RPMI共孵育；9G：Syn_质粒商品化购买。质粒pCDH_CMV_TNFRSF17(human)，pHR_PGK_antiCD19_synNotch_Gal4VP64，pHR_Gal4UAS_tBFP_PGK_mCherry,pCDH_CMV_TNFRSF17(human)_EF1a_CopGFP_医学科学院基础医学研究所北京协和医学院细胞50×TAE凝胶电泳缓冲液；溴化乙锭(EB)核酸染色液，北京索莱宝科技有限公司；6×8[0040]本发明利用PB转座子系统(PB转座子质粒和PB转座酶质粒)构建稳定转染的SIN_M,etal.Overcomingpromotercompetitioninpackagingcellsimprovesproductionofself_inactivatingretroviralvectors[J].GeneTherapy,2006,13(21):1524_33中从而进一步提高载体包装容量和载体安全性。设计的载体PSR.MCS送往由金唯智生物科技子的PSR.SynNotch载体的质粒命名为，PSR.Syn.CD19.BFP(p167),PSR.Syn.BCMA.BFPGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGCGCCAGTCCTCCGATaGACTGcGTCGCCCGGGTACCCGTaTTCCCAATAAAgCCTCTTGCTGTTTGCATCCGAATCGTGGaCTCGCTGaTCCTTGGGAGGGTCTCCTCaGAtTGATTGACTGCTGGCCAGCGGTCGTTTCGTGTCTGTCTCTGTCTTTGGGCGTGTTTGTGCCGGCATCTAGTGTTTGCGCCTGCGTCTGTACTAGTTGGCTAACTAGATCTGTATCTGGCGGTCCCGCGGAAGAACTGACGAGTTCGTATTCCCGGCCGCAGCCCCTGGGAGACGTCCCAGCGGCCTCGGGGGCCCGTTTTGTGGCCCATTCTGTATCAGTTAACCTACCCGAGTCGGACTTTTTGGAGCTCCGCCACTGTCCGAGGGGTACGTGGCTTTGTTGGGGGACGAGAGACAGAGACACTTCCCGCCCCCGTCTGAATTTTTGCTTTCGGTTTTACGCCGAAACCGCGCCGCGCGTCTTGTCTGCTGCAGCATCGTTCTGTGTTGTCTCTGTCTGACTGTGTTTCTGTATTTGTCTGAAAATCGATaGACTGcGTCGCCCGGGTACCCGTGTTCtCAATAAACCCTCTTGCaGTTGCATCCGAcTCGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTGCCCACCTCGGGGGT9片段2基础上替换成antiBCMAscfv，antiCD38scfv，anti_GPC3_scfv。其中antiBCMAscfv是来自FDA批准上市的bb2121anti_BCMA抗体；antiCD38scfv是本研究团队通参见LIX,FENGY,SHANGF,etal.CharacterizationoftheTherapeuticEffectsofNovelChimericAntigenReceptorTCellsTargetingCD38onMultipleMyeloma[J].FrontiersInOncology,2021,11:703087；antiBCMAscfv来自商品化抗体antiBCMA2mL，铺板数量预留4个孔用于后期流式检测转染效率。接种第二天，待细胞的融合度为需质粒的体积，每孔加入的质粒为3.3μg，转染质粒分别是PSR.Syn.CD19.BFP(p167)，更换新鲜温热的10％FBS_DMEM培养基，2.5ml/孔，继续放至32℃,5％CO2细胞培养箱中培CAR167),PSR.Syn.BCMA.BFP(Syn_CAR168),PSR.Syn.CD38.BFP(Syn_CAR169),生长状态，若T细胞大量聚团生长则生长状态良好，可进行病毒载体转导T细胞。取出Syn_CAR168，Syn_CAR1[0064]本实验将原SynNotch系统的慢病毒双载体改造成PSR(稳转自失活γ_逆转表达不能放在启动子下游，所以设计在内部启动子和Gal4诱导受体上游。构建的4个质粒成功构建4个载体质粒PSR.Syn.CD19.BFP(p167)，PSR.Syn.BCMA.BFP(p168)，式检测结果如下图3所示，4种Syn_CAR_T的转导效率分别为50.030.3636.36%,tagBFP荧光蛋白都有较低的背景泄露表达，4种Syn_CAR_T的MFI(平均荧光强度)值分别为的诱导效率极低，不适合SynNotch系统。综上，靶点CD19诱导效率最高，最适合应用于育后会诱导表达效应分子anti_CD38_CAR。肿瘤细胞同时表达CD19和CD38抗原时，Syn_示技术筛选获得的CAR21分子，anti_CD38_CAR(CAR21)已证明体内和体外都具有高效的特载体生产滴度随着会降低。从5’LTR到3’SIN_LTR，即整个重组SIN_γ_RV总量大小为体片段。片段1是UASanti_CD38_CAR，模板质粒来商品化的质粒p184；片段2是抗CD19scfv_Notch_Gal4VP64，模板质粒来自商品化质粒p184；片段3为hEF1_HTLVpromoter_[0079]将PCR产物和酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳及胶回收。胶回收产物直接进行无缝于载体Syn_CAR188装载基因过大，插入片段共5500bp，从5’LTR到3’SINLTR的大小为胞孔，两群及以上细胞为多克隆细胞孔。荧光显微镜观察96孔板单克隆细胞，挑出表达胞阳性率。筛选出流式检测Myc和CopGFP的细胞阳性率大于70％的单克隆细胞，并做好标[0092]构建的质粒Syn_CAR188和转座酶质粒共同转染病毒载体包装细胞系Ampho细胞，由于Syn_CAR188质粒携带CopGFP荧光蛋白和嘌呤霉素抗性基因，转染后48h进行嘌呤霉素tag标签。转染后48h(day2)，day10，day20的Ampho细胞表达CopGFP的阳性率分别为82.9591.5599转染后48h(day2)，day10的Ampho细胞表达Myc的阳性率分别为(day2)和day10，Ampho细胞表达Myc同启动子的表达效率及载体整合宿主基因组的位置通过荧光显微镜观察初步筛选出50个绿色荧光明亮且均一的克隆。待单孔细胞密度达到A188细胞表达CopGFP荧光蛋白和Myctag标签的阳性率，需筛选出阳性率都大于70％的单标准的单克隆细胞A188_47，表达CopGFP和Myctag的阳性率都大于70％。阳性率分别为与表达不同抗原(CD19抗原，CD38抗原)的肿瘤细胞共培养，通过流式检测表达anti_CD19scfv的阳性T细胞中表达anti_CD38_scfv的阳性率。实验流程为：将收获的单克隆细胞[0098]分离人源PBMC，加OK_T3和IL_2活化培养。PBMC活化培养后48h。加单克隆细胞为32.34％。研究结果表明，本实验成功制备Syn_CAR188_T细胞，可用于后续验证Syn_CAR188_T细胞与表达不同抗原肿瘤细胞共孵育培果表明，Syn_CAR188_T细胞与多种CD19抗原阳性肿瘤细胞共孵育后诱导效率皆大于70%,与CD19阴性肿瘤细胞共孵育后诱导效率较低(18.31.08％)，未与肿瘤孵育背景表达约可用于后续进一步研究Syn_CAR188_T细胞对肿瘤细胞的特异[0107]将PSR.Syn.CD19.CD38CAR_T(Syn_CAR188_T)细胞与表达不同抗原(CD19抗原，实时动态活细胞成像监测系统Incucyte研究Syn_CAR188_T细胞对肿瘤细胞的持久性杀伤孵育后活化差异，通过CFSE(活细胞荧光染料)流式检测研究Syn_CAR188_T细胞增殖效果。通过CBA(多细胞因子检测)流式检测研究Syn_CAR188_T细胞细胞因子分泌水105算所需肿瘤细胞数和T细胞数。先将肿瘤细胞用AIM_V完全培养基稀释至2×105cells/mL，分别用AIM_V完全培养基稀释至对应效靶比的密度，将3组T细胞分别加入96孔板中与肿瘤时检测多种细胞因子。本实验所使用的CBA试剂盒为HumanCD8/NKPanel(13_plex)，(Carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester，羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺上实验组T细胞和阳性对照组T细胞与双阳性肿瘤细胞共孵育都具有特异性杀伤肿瘤功能。性杀伤表达CD38抗原的肿瘤细胞。图7B实验结果显示，阳性对照组CAR21_T细胞对K562_K562_CD19_BCMA肿瘤细胞共孵育12h后杀伤效率检测结果。K562_CD19_BCMA肿瘤细胞表达后可诱导表达antiCD38_CAR，但是肿瘤细胞不表达CD38抗原，则无法启动特异性杀伤功结果一致。图7C是3组T细胞与RPMI_CD19肿瘤细胞共孵育12h后杀伤效率检测结果。RPMI_[0127]结果显示在4种不同效靶比下，Syn_CAR188_T组和CAR21_T组对RPMI_CD19肿瘤细种不同效靶比下，CAR21_T细胞对RPMI肿瘤细胞杀伤效率都显著高于Syn_CAR188_T组和性杀伤功能