基于荧光共振能量转移的聚芴共轭聚合物复合纳米粒子的制备及其应用

基于荧光共振能量转移的聚芴共轭聚合物复合纳米粒子的制备及其应用摘要：目前用于单链DNA(ssDNA)检测的基于FRET探针的材料主要有量子点、上转换纳米粒子以及水溶性共轭聚合物，它们的检测限通常是在10-9-10-8M范围之内。而利用基于FRET的双纳米粒子混合体系进行ssDNA的检测，其检测限会更高。我们利用再沉淀法制备了分散性非常好的双纳米粒子溶液体系。我们利用这个体系进行了阳离子聚电解质的响应性以及ssDNA的超灵敏检测。这次实验我们通过监测从PFO到MEH-PPV的荧光共振能量转移(FRET)效率来测定纳米粒子体系对阳离子的响应性。加入阳离子聚电解质之后，双纳米粒子体系的FRET效率至少增加了3.3倍。在荧光显微镜图像中，在PLL预处理过的纳米粒子溶液中，其注入ssDNA前后溶液中纳米粒子的距离以及MEH-PPV纳米粒子的亮度都是不同的。利用该方法，我们可以用来进行ssDNA的超灵敏检测，检测限可以达到1×10-14M。因此，我们相信这种基于FRET的双纳米粒子体系给我们提供了一种新的方法来进行超灵敏的DNA检测。关键词：FRET;聚芴共轭聚合物;复合纳米粒子;分子检测。PreparationandApplicationofPolyfluoreneConjugatedPolymerCompositeNanoparticlesBasedonFluorescenceResonanceEnergyTransferAbstract：MaterialscurrentlyusedforFRETprobesforsingle-strandedDNA(ssDNA)detectionmainlyincludequantumdots,up-convertingnanoparticles,andwater-solubleconjugatedpolymers,andtheirdetectionlimitsareusuallyintherangeof1nanometerto10nanometers.ThedetectionlimitofssDNAusingFRET-baseddualnanoparticlehybridsystemwillbehigher.Weusedthereprecipitationmethodtoprepareaverygooddispersionofdoublenanoparticlesolutionsystem.Weusedthissystemtoperformtheresponsivenessofcationicpolyelectrolytesandultra-sensitivedetectionofssDNA.Inthisexperiment,wemeasuredtheresponseofthenanoparticlesystemtocationsbymonitoringtheefficiencyoffluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)fromPFOtoMEH-PPV.Afteraddingthecationicpolyelectrolyte,theFRETefficiencyofthedualnanoparticlesystemincreasedbyatleast3.3times.Inthefluorescencemicroscopeimage,thedistancebetweenthenanoparticlesinthesolutionbeforeandafterssDNAinjectionandthebrightnessoftheMEH-PPVnanoparticlesinthePLLpretreatednanoparticlesolutionaredifferent.Usingthismethod,wecanbeusedforultra-sensitivedetectionofssDNA,thedetectionlimitcanreach0.00001nanometers.Therefore,webelievethatthisFRET-baseddualnanoparticlesystemprovidesuswithanewmethodforultra-sensitiveDNAdetection.Keywords:FRET;Polyfluoreneconjugatedpolymer;Compositenanoparticles;Moleculardetection.1绪论1.1FRET的发展科研人员们一直向往能够将复杂生物大分子的结构刨析清楚，荧光工作能量转移（FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET）的出现为大分子内部结构的测定及动态监视提供了一条快速，简洁，灵敏的途径。荧光共振能量转移是依赖于供体和受体分子间距离的光物理进程，处于激发态的荧光团通过偶极子间的相互作用将能量以非辐射的方式转移给邻近的受体分子，从而导致供体荧光淬灭和受体荧光发射的增加。[1]供体和受体之间的FRET效率(E)与分子间的空间距离(r)满足6次方的关系：E=r-6/(r-6+R0-6)其中R0为Förster半径,是指E为50%时供体与受体间的距离。E与供体受体分子间空间的6次方关系决定了E对空间距离敏感,决定了FRET技术特别适合用于研究分子间的相互作用以及大分子间的空间变化。r是给体与受体之间从距离。FRET是一种非辐射过程，其中，激发态的染料给体通过远程的偶极-偶极作用，将能量传递给基态的染料受体。当将FRET用在荧光检测上的时候，它具有距离依赖性发射、双色荧光关联以及良好的灵敏性等特性[2]。当下，许多基于FRET的荧光探针被应用于检测生物大分子或化学物质，如蛋白质、核酸、活性氧、金属离子等。这些基于FRET的荧光探针有小分子、水溶性共聚物、量子点以及上转换纳米粒子[3-10]，而最常用的荧光探针为小分子和水溶性共轭聚合物。然而这些分子探针耐光性一般都较差，会发生光漂白、光氧化和光闪烁[11,12]。1.1.1FERT检测的问题主要影响FRET的两个因素：1光谱串扰，包括供体荧光串扰到收益通道和激发供体时直接激发受体。因为有机荧光的物理性质，大多数FRE供体受体对都存在着光谱串扰[13,14]。再定量检测FRET效率的时候必须解决这些串扰。2参与FRET作用的供体与受体分子都参与相互作用[15,16]。而参与相互作用分子的百分比不知道，所以各种定量检测的方法对有自由供受体存在的时候都不能很好的反映出FRET的效率。除此之外，背景噪音和活细胞中荧光蛋白的量也可能影响FRET效率的定量检测。1.2共轭聚合物纳米粒子共轭聚合物是近几十年备受关注的一类材料，又被称为导电高分子或合成金属。共轭聚合物已在生物领域和光电子器件方面取得广泛的应用。在过去几十年中，从而聚合物作为荧光探针在生物领域的应用取得了巨大的成果。相比于传统的无机半导体荧光材料，共轭聚合物荧光纳米粒子具有结构多样性，生物相容性好，功能可设计性等优点。荧光探针技术是一种借助荧光分子的物理和化学性质，在分子水平上研究生物体内结构变化的方法。荧光探针技术具有直观性强、灵敏度高、检测快速、试剂量小等特点，近年来已被广泛应用于蛋白质、核酸、细胞检测以及细胞标记等领域。但以传统的有机荧光染料和荧光蛋白为主的荧光探针存在光化学稳定性差、等显著的缺点，使其在应用中灵敏度降低，并且无法对标记物进行长期的追踪及观察标记物的动力学过程.无机荧光量子点的出现，在一定程度上克服了传统有机荧光试剂的缺陷。但是，目前得到的量子点大多数含有重金属组分，如镉和铅等。水分散性共轭聚合物荧光纳米材料(CPNs)是近年来发展起来的一种应用于生物相容体系中的共轭聚合物荧光材料。这类水相合成共轭聚合物纳米材料结合了传统共轭聚合物的优异光电性质和聚电解质水溶性的特点，为生物分析提供了新的发展领域。与无机半导体纳米材料相比，共轭聚合物纳米颗粒具有结构多样性、良好的生物相容性、荧光强机半导体纳米材料相比，共轭聚合物纳米颗粒具有结构多样性、良好的生物相容性、荧光强度高、发光时间长和光化学稳定性好等特性，在生物分析及细胞成像方面逐渐成为热点研究领域。CPNs能够满足这些研究的需求有其重要的原因:一方面，可以通过选择不同的共轭聚合物材料或者通过表面的修饰制备出不同性能的CPNs以满足不同实验的需求。另一方面:同现有的无机纳米材料相比CPNs的制备方法简单、颗粒的尺寸及光学特性可调控、低毒、生物兼容性佳等优点，因此在材料选择方面，CPNs有非常大的优势。与此同时，正如上面提到的，由于在许多高强度的荧光成像和长期的跟踪实验中，有机染料没有足够的光亮度和光稳定性，所以急需一种高亮度的荧光纳米颗粒。1.21共轭聚合物种类，结构根据主链共轭骨架结构的不同，可以将共轭聚合物划分为几种类型，如图1.1。聚芴类（PF），聚对苯乙烯撑类（PPV），聚噻吩（PT），聚乙炔（PPE），聚苯（PPP），聚芴撑乙烯（PFPV）。图1.1共轭聚合物分子式1.22共轭聚合物纳米粒子的制备方法合成得到高分子聚合物的方法有纳米沉淀法，微乳液法。着两个方法简单方便，高分子聚合物可以直接合成的也可以直接用商品化的共轭聚合物。微乳液法是表面活性剂在油/水界面形成的有序组合体，采用表面活性剂分子如十二烷基磺酸钠（SDS），十四烷基三甲基溴化铵（TTAB）等作为稳定剂，使有机溶剂和油溶性共轭聚合物在水溶液中均匀分散形成纳米级微乳溶液滴，等到有机溶剂缓慢蒸发后，可以得到共轭聚合物固相纳米粒子。因为微乳液可以对纳米粒子的粒径和稳定性进行较为精确的控制，同时可以选择不用表面活性剂对纳米颗粒表面进行修饰，所以这个方法具有特定功能纳米材料的优点。通过调控共轭聚合物和表面活性剂的浓度，可以获得粒径在50-400nm之间的水分散性共轭聚合物纳米粒子。如图1.2图1.2微乳液法制备共轭聚合物纳米粒子的示意图再沉淀法也称作纳米沉淀法，1992年，日本的Nakanishi课题组首次报道了利用再沉淀法制备有机纳米粒子和纳米晶体的消息。他们利用再沉淀法制备了芳香化合物，聚二炔类化合物的纳米晶体。该方法操作简单，是将少量溶于良溶剂的有机化合物注入强烈搅拌的水里，利用有机化合物再不团溶液中的注解度不同使有机分子聚集成长，得到分散在水里的有机纳米晶体。与微乳液法制备共轭聚合物纳米粒子相比，再沉淀法得到的共轭聚合物纳米粒子尺寸较小，在5-30nm之间。2005年，MeNeill等利用再沉淀法制备了聚苯撐乙烯(MEH-PPV)荧光纳米粒子水溶液，并采用透射电镜(TEM)和扫描近场荧光显微镜对得到的MEH-PPV纳米颗粒进行表征，结果表明，通过再沉淀法可以得到单分子MEH-PPV荧光纳米粒子，并且该体系具有较高的稳定性.Wu等报道了再沉淀法制备多色荧光共轭聚合物纳米粒子,结果表明，聚合物纳米颗粒粒径较小、荧光强度高、抗光漂白能力强。另外，通过将共轭聚合物和有机荧光染料混合溶解于有机溶剂，控制两者的组成和比例，可以得到所需光学响应性能和荧光发射波长可调谐的荧光纳米粒子。Wu等首先将发蓝光的聚芴主体材料分别与绿色发光聚芴苯撑乙烯交替共聚物(PFPV)、黄分别与绿色发光聚芴苯撑乙烯交替共聚物(PFPV)、黄绿光聚芴—苯并噻二唑交替共聚物(PFBT)和橙色发光聚苯撑乙烯(MEH-PPV)受体材料混合溶解于四氢呋喃溶剂中，通过再沉淀法得到了系列不同荧光发射波长的掺杂型聚合物纳米颗粒。结果发现，随受体材料浓度的增加，颗粒内聚芴主体材料的荧光可被有效猝灭，通过调节各组分比例，可以有效调控纳米颗粒荧光。在此基础上，该课题组采用类似方法制备了一系列小分子荧光染料(花、四苯基卟啉、香豆素6、尼罗红)掺杂的聚芴纳米颗粒，光漂白实验表明，能量转移效应极大增强了染料掺杂聚芴纳米颗粒的光稳定性。1.23共轭聚合物纳米粒子的物理性质共轭聚合物的管够性质主要由共轭主链结构决定，通过控制共轭聚合物的分子结构可以调控其光谱性质，由于共轭聚合物纳米颗粒中共轭聚合物构象和聚集状态变化的影响，一般共轭聚合物纳米粒子的光物理性质与其再有机溶液中油明显差异。McNeil等报道，通过共沉淀法制备的系列共轭聚合物纳米颗粒与其在有机溶剂中相比，荧光发射光谱发生红移,紫外吸收光谱明显蓝移并且变宽。他们认为，紫外吸收光谱的明显蓝移可能是因为纳米颗粒形成过程中分子链扭曲导致有效共轭长度变短。同时，由于大分子发生链间聚集，并产生系列无序能量转移陷阱，导致共轭聚合物纳米颗粒的荧光发射光谱发生红移。1.3共轭聚合物纳米粒子的研究进展在过去的十多年里纳米技术在生物领域的应用使得CPNs材料在医学界得到了更广泛的关注。CPNs主要是由有机的、光学和电子活跃的共轭聚合物，亦可以同两亲的聚合物材料共同组成，以便于制备成更好的纳米粒子。CPNs的吸收系数和耐光性都比小分子荧光染料更高。CPNs是由完全的有机分子组成，具有无毒特点。这些特征使得CPNs在生物学应用有很高的前途。包括pH、金属离子和温度传感，组织的分子成像和疾病的生物标记，肿瘤的光动力治疗，神经细胞的即时激活，以及癌症的光辅热治疗等[17]。Wang课题组，通过芴等单体合成了具有荧光聚集诱导发光的共轭聚合物，并使用CPs通过纳米沉淀的方法制备成纳米粒子。VinodK.Jain课题组用AgNO3与共轭聚合物通过一锅法制备纳米粒子，当没有铁离子存在下，CPNs表现出明亮的荧光，当在铁离子存在下纳米粒子荧光淬灭。KanyiPu课题组还报道了一种提高PA亮度的方法就是在共轭聚合物纳米粒子表面包覆一层硅氧层。1.4基于荧光共振能量转移的混合纳米粒子的设计思路在本实验中，我们利用共轭聚合物制备的双纳米粒子间的FRET效应来进行阳离子聚电解质的响应以及ssDNA的超灵敏检测。9,9-二辛基聚芴(PFO)和2-甲氧基-5-（2’-乙基己氧基）-1,4-对苯乙烯撑(MEH-PPV)(结构式如图1.3所示)用来作为整个体系的主体纳米粒子。1.3PFO和MEH-PPV聚合物的结构式我们利用再沉淀的方法在水溶液中制备了PFO和MEH-PPV混合的双纳米粒子体系。这样，在合适的距离内，两种纳米粒子将会发生FRET效应。我们发现，在水溶液中，PFO和MEH-PPV这两种纳米粒子(NPs)的表面均带负电，因此阳离子聚电解质可以拉近纳米粒子之间的距离，促使FRET效率的增加。因此，我们可以利用这种体系进行阳离子聚电解质的响应。此外，ssDNA携带有高密度的负电荷，它可以和聚电解质的聚合物链之间发生静电吸附作用。因此，ssDNA可以将纳米粒子从阳离子聚合物的链上解吸下来，随着解吸的作用，纳米粒子之间的距离会增加，从而FRET效应会减弱，因此，利用这个方法，我们可以实现ssDNA的超灵敏检测，检测限可达到10-14M。图1.4为双纳米例子体系对聚合物电解质响应性以及对ssDNA检测的示意图。图1.4双纳米粒子系统对聚合物电解质的响应以及对ssDNA的检测的示意图2实验部分2.1实验原料和仪器表2-1实验仪器仪器名称和型号生产厂商荧光光谱仪HitachiF-7000日立紫外/可见分光光度计HitachiU-3900H日立粒度Zeta电位仪，NanoZS90马尔文共聚焦荧光显微镜，FV1000-IX81Olympus扫描电镜，JSM-7401F日本电子JEOL表2-2实验原料名称规格生产厂商PFOMw=58200Sigma-AldrichMEH-PPVMn=40000−70000Sigma-Aldrich聚乙烯亚胺(PEI)Mw=750000Sigma-Aldrich聚（二甲基二烯丙基氯化铵）(PDDA)Mw=200000−350000Sigma-Aldrich聚丙烯酸(PAA)Mw=100000Sigma-Aldrich聚烯丙胺盐酸盐(PAH)Mw=58000Sigma-Aldrich聚苯乙烯磺酸钠(PSS)Mw=70000Sigma-Aldrich聚赖氨酸(PLL)Mr=70000−150000BioDeeBiotechnologyssDNAs上海生工生物在本实验中，我们采用HitachiU3900可见分光光度计测量吸收光谱。采用HitachiF-7000荧光光谱仪，在室温的条件下，用氙灯作为激发光源来测量荧光光谱。采用NanoZS90测量室温下水溶液中纳米粒子的ζ电位以及其直径。采用JSM-7401F扫描电镜来进行纳米粒子体系的成像，采用OlympusFV1000-IX81共聚焦荧光显微镜对处理过的纳米粒子体系进行体系的荧光显微镜成像。其中，共聚焦显微镜的激发波长为385nm，捕捉范围为420nm波长以上。纳米粒子体系的光学图片在365nm紫外灯的照射下拍摄。2.2实验步骤2.2.1混合纳米粒子体系的制备以及光学特性的表征我们利用再沉淀法在水中制备了PFO和MEH-PPV的混合纳米粒子[18]。首先，将浓度为2.0mg/mL的共轭聚合物溶于良溶剂四氢呋喃(THF)中，将瓶子用铝箔纸包好进行避光处理，将其在45oC的热台上加热至少12h。然后用0.22μm聚偏二氟乙烯(PVDF)进行过滤。之后将250μLPFO/THF溶液快速的注入到5mL的超纯水中并且在45oC的条件下超声5min，然后将250μL的MEH-PPV/THF注入到上述纳米粒子溶液中同时在45oC的条件下超声5min。最后用0.22μm的聚四氟乙烯(PTFE)对双纳米粒子溶液进行过滤。然后，取1mL的双混合纳米粒子溶液放入比色皿中，在25oC的条件下，用型号为NanoZS90的粒度/Zeta电位仪来测量双混合纳米粒子的直径和Zeta电位。2.2.2纳米粒子对聚电解质的响应实验将制备好的双纳米粒子混合溶液放置12h，让纳米粒子可以充分的混合均匀。然后，分别往6个比色皿里注入500μL纳米粒子溶液，然后向纳米粒子溶液中加入200μL超纯水来稀释上述的纳米粒子溶液。PLL,PAH,PDDA,PEI,PSS和PAA被用来检测双纳米粒子溶液对聚电解质的响应性。将上述聚电解质分别注入到6个已经稀释的纳米粒子溶液中，调节聚电解质的浓度范围在1×10-6−1×10-4M（该浓度为重复单元的浓度）。用荧光光谱仪，在385nm的激发条件下获得溶液的荧光发射光谱。然后用365nm的紫外灯照射处理过的纳米粒子溶液，用相机拍摄溶液的荧光照片。2.2.3纳米粒子体系的扫描显微镜(SEM)图像为了研究双纳米粒子体系在加入阳离子聚电解质前后纳米粒子粒径大小以及纳米粒子距离之间的变化，我们对纳米粒子体系进行了扫描电镜(SEM)成像。首先切取若干大小为0.5cm×0.5cm的硅片，用超纯水将硅片清洗干净，然后用比例为1:2的H2O2/H2SO4溶液对硅片进行亲水化处理一个小时，接着用超纯水洗涤三遍并用氮气将其吹干。分别取5μL的PFO和MEH-PPV的双混合纳米粒子溶液以及加入PLL(浓度为1×10-4M)的纳米粒子溶液，将其分别滴涂到不同的硅片上。经过喷金后，用JSM-7401F扫描电镜进行SEM成像。2.2.4ssDNA的检测取2个比色皿，往2个比色皿中分别注入500μL的双纳米粒子混合溶液，然后将ssDNA注入到纳米粒子溶液中(一个是被PLL处理过的溶液，一个是未被处理的溶液)，调节ssDNA浓度的范围在1×10−14-5×10−12M。然后用荧光光谱仪，在激发波长为385nm条件下，检测溶液的荧光光谱。2.2.5荧光显微镜成像首先，用超纯水将盖玻片清洗干净，然后对盖玻片进行亲水化处理一个小时，接着将盖玻片清洗三遍并用氮气将其吹干。然后分别取未处理过得纳米粒子溶液，PLL处理的纳米粒子溶液以及PLL和ssDNA处理过的纳米粒子溶液各2μL，然后滴到处理好的盖玻片上，将其放在共聚焦显微镜下进行成像。结果与讨论3.1纳米粒子在水溶液中的特性光共振能量转移(FRET)是一个非辐射的物理过程，其中，激发态的染料给体通过远程的偶极-偶极作用，将能量传递给基态的染料受体的过程。有效的能量转移要求供体和受体之间的距离在1–10nm之间，给体的荧光光谱和受体的吸收光谱要充分的重叠。在一般情况下，PFO的荧光光谱其主峰位置在425nm，两个肩峰位置分别在457nm和489nm。而MEH-PPV的主峰位置在550nm，肩峰位置在598nm。如图3-1a所示，MEH-PPV纳米粒子表现出很宽的紫外可见吸收带，范围从300nm到580nm，和PFO的纳米粒子的发射带有很好的重叠。根据文献[19]中的公式，我们可以计算出FRET的相关参数，如光谱重叠J以及Förster距离R0。计算公式如下：R06其中，FD是给体的归一化荧光强度，()是受体的消光系数(M1cm1)，λ是波长(nm)，∅D是给体的荧光量子产率，n代表溶液的折光指数，k2是给体(D)和受体(A)之间的间跃迁偶极矩取向因子，一般情况下为2/3，N是阿伏伽德罗常数。在本章的实验中，∅D是0.044，n是1.33，积分区域为403nm到600nm。根据计算，Förster半径R0的值为~6nm。因此，在合适的纳米粒子距离范围内会发生FRET效应。图3-1b展示出了水溶液中PFO和MEH-PPV混合纳米粒子的粒径分布。纳米粒子的主要粒径为94.3nm(多分散系数为0.114)。该体系非常稳定，放置一个月左右也不会出现明显的聚集现象。这是因为这两种纳米粒子表面带有相同的电荷，因此他们之间会发生相互排斥的静电相互作用，以至于纳米粒子能在水溶液中稳定的存在。根据Coehn’s经验法则，当两个电解质紧密接触时，有可能会发生静电电荷分离。具有较高介电常数的物质将接收正电荷，另一个物质将接收负电荷[20,21]。水的相对介电常数是80，而PFO和MEH-PPV的相对介电常数分别是3.26和3.0[22,23]。因此，在水溶液中，PFO和MEH-PPV的表面都会带负电荷。测试PFO和MEH-PPV混合纳米粒子溶液的ζ图STYLEREFu正文1级标题\n错误!使用“开始”选项卡将u正文1级标题应用于要在此处显示的文字。-1(a)PFO纳米粒子的荧光发射光谱和MEH-PPV纳米粒子的吸收光谱；(b)双纳米粒子体系(PFO和MEH-PPV的纳米粒子水溶液)的粒径(直径)分布。插图展示的是纳米粒子溶液在365nm的紫外照射下的图片。3.2纳米粒子体系对聚电解质的响应性如上述所提到的那样，溶液中的纳米粒子表面带有负电荷。因此，这些纳米粒子会吸附在带有正电荷的聚电解质链上，并且我们预测荧光也会发生一定的变化。为了证明这种猜想，在相同的条件下，我们选择了六种聚电解质进行调查，包括阳离子聚电解质PLL、PAH、PEI、PDDA以及阴离子聚电解质PSS和PAA。图3-2展示出了这些聚电解质的分子结构。图3-3展示出了双纳米粒子在不同浓度的聚电解质加入后的荧光光谱图，插图则是展示出了纳米粒子溶液分别在未被聚电解质处理和被电解质处理条件下的图片。荧光光谱在437nm处进行了归一化处理。短波长（蓝色光）区域中的发射带来自PFO的发射，与此同时，长波长（橙色光）区域出现的发射带则来自MEH-PPV的发射。图STYLEREFu正文1级标题\n错误!使用“开始”选项卡将u正文1级标题应用于要在此处显示的文字。-2聚合物的分子结构示意图随着阳离子聚电解质(PLL、PAH、PEI和PDDA)在纳米粒子溶液中浓度的增加，相对于PFO而言，MEH-PPV的发射强度变得越来越大。除此之外，该溶液的发光颜色明显的由蓝色变为黄绿色或者黄色（如图3-3a-d所示）。然而，对于加入阴离子聚合物(PSS和PAA)之后的情况却不是这样。随着阴离子聚电解质在纳米粒子溶液中浓度的增加，相对于PFO而言，MEH-PPV的发射强度只有很微小的变化，而且溶液的发光颜色几乎没有什么改变（如图3-3e-f所示）。如上述所提到那样，PFO和MEH-PPV纳米粒子的表面都带有负电荷，而阳离子聚电解质的链上带有正电荷，向双混合纳米粒子溶液中加入阳离子聚电解质，阳离子聚电解质和纳米粒子之间会发生静电相互作用，从而可以拉近纳米粒子之间的距离。由于FRET和距离有着非常密切的联系，纳米粒子之间的距离变近会使从PFO向MEH-PPV荧光共振能量转移的效率增加，从而使得MEH-PPV纳米粒子的发射强度增加。而对于阴离子聚电解质，他们和PFO、MEH-PPV一样都是带有负电荷的，阴离子聚电解质和纳米粒子之间没有静电相互作用，因此在纳米粒子溶液中加入阴离子聚电解质之后，纳米粒子之间的距离没有明显的变化，所以FRET效率也没有明显的变化。如图3-6所示，双混合纳米粒子溶液在未进行任何处理时的FRET比率（在这里是荧光强度I574nm/I437nm的比率）为0.23，而在相同条件下加入聚电解质PLL、PDDA、PAH、PEI、PSS和PAA（终浓度均为1×10-4M）后，FRET的比率分别为1.59、1.15、1.01、0.99、0.25以及0.22。如I574nm/I437nm比率值所反映的那样，向纳米粒子溶液中加入阳离子聚电解质之后，FRET效率至少增加了3.3倍，甚至，当加入PLL之后，纳米粒子的效率比原来增加了6倍。图STYLEREFu正文1级标题\n错误!使用“开始”选项卡将u正文1级标题应用于要在此处显示的文字。-3双混合纳米粒子溶液体系经过不同浓度的聚电解质处理后的荧光发射光谱：(a)PLL,(b)PAH,(c)PDDA,(d)PEI,(e)PSS,(f)PAA。插图是在紫外照射下纳米粒子溶液的荧光图片，作图为未进行过处理的溶液图片，右侧为用聚电解质处理后的溶液图片。光谱图均在437nm处进行归一化处理，激发波长均为385nm从图3-3中可以看出，PLL的重复单元上有两个氨基单元，这两个氨基单元都可以进行水解从而带上正电荷，而PAH、PDDA和PEI的重复单元上都只有一个氨基基团可以水解。所以，PLL比其他的三种阳离子聚电解质拥有更高的电荷密度。因此，PLL和纳米粒子之间的静电相互作用比其他的三种阳离子聚合物都要强，所以被PLL处理后的纳米粒子溶液其MEH-PPV的发射强度最高。然而，用阴离子聚电解质处理过的纳米粒子溶液其FRET效率没有明显的变化。因此，可以证明PFO和MEH-PPV双纳米粒子体系可以用来响应阳离子聚电解质。图STYLEREFu正文1级标题\n错误!使用“开始”选项卡将u正文1级标题应用于要在此处显示的文字。-4双纳米粒子溶液体系的FRET比率（I574nm/I437nm），从左向右依次为未进行聚电解质处理的纳米粒子体系、PLL处理的、PDDA处理的、PAH处理的、PEI处理的、PSS处理的以及PAA处理的（聚电解质的浓度均为1×10-4M）纳米粒子溶液体系。3.3纳米粒子体系的SEM图像我们利用扫描显微镜进行纳米粒子体系的SEM成像。如图3-5所示，其中图3-5a是PFO和MEH-PPV双混合纳米粒子体系的SEM图，3-5b是加入阳离子聚电解质PLL之后纳米粒子体系的SEM图。从图中可以看出，未加入阳离子聚电解质时，纳米粒子的粒径在90nm左右，并且纳米粒子排列较为疏松，而加入PLL之后，从图3-9b中可以看出，纳米粒子的粒径变大，很多都在110nm以上，而且纳米粒子呈现出密集堆积的状态，这说明带正电的阳离子聚电解质对带负电的PFO和MEH-PPV有很强的吸附作用。图STYLEREFu正文1级标题\n错误!使用“开始”选项卡将u正文1级标题应用于要在此处显示的文字。-5纳米粒子体系的SEM图；其中(a)为PFO和MEH-PPV纳米粒子体系的SEM图，(b)为加入PLL之后纳米粒子体系的SEM图3.4纳米粒子体系的荧光显微成像我们利用共聚焦显微镜(CLSM)来进行纳米粒子体系的真实荧光颜色的成像，图3-6a是未进行任何处理的双混合纳米粒子溶液的荧光图像，图3-6b是加入PLL(1×10-5M)之后纳米粒子体系的荧光图像。如图3-6a所示，在没有加入PLL的纳米粒子溶液中，纳米粒子的聚集度比较小，MEH-PPV的荧光亮度很低，由于这两种纳米粒子在溶液中都有良好的分散性(如图3-10a所示)，值得注意的是，这里所说的纳米粒子的聚集是一种可逆的过程，这种聚集可以说是暂时的。在将PLL加入到纳米粒子溶液之后，阳离子聚电解质可以使PFO和MEH-PPV纳米粒子之间的距离变近。因此，FRET效率会增加，这个可以从图3-6b中看出来。在3-6b的这个图中，我们可以看到更多更亮的橘红色的荧光纳米粒子，而且纳米粒子的聚合度也变得比之前大。这主要是因为PLL(聚合物链带有正电荷)和纳米粒子(表面带有负电荷)之间具有静电吸附作用，纳米粒子之间的距离由于PLL的加入变近，甚至有一些纳米粒子会被PLL包裹住。因此，我们可以观察到比较大的纳米粒子聚集度。由于聚集作用，PFO和MEH-PPV纳米粒子之间的距离变得接近，一般都在小于10nm的范围，所以FRET会有效的发生。图3-6c则是PLL(1×10-5M)预处理后加入ssDNA(5×10-12M)的荧光图像。当ssDNA(A43)加入到PLL处理过的纳米粒子溶液中后，带有高密度负电的ssDNA会和PLL相结合，使得PFO和MEH-PPV从PLL的聚合物链上解吸下来。从图3-6c中可以看出，纳米粒子的聚集度重新变小，这就意味着纳米粒子之间的距离将会变大，MEH-PPV纳米粒子的荧光亮度将会变弱。除此之外，我们可以从图3-6d中看出，在未进行PLL处理的纳米粒子溶液的纳米粒子直径为94.3nm，当加入PLL(1×10-5M)之后，纳米粒子的直径为141.8nm，将ssDNA(A43)加入到PLL处理过的纳米粒子溶液中，纳米粒子的直径恢复到类似最初未加PLL的纳米粒子直径的状态。因此，我们可以得出结论，本章中的双纳米粒子溶液在进行阳离子聚电解质预处理后，可以用来进行ssDNA的超灵敏检测。图STYLEREFu正文1级标题\n错误!使用“开始”选项卡将u正文1级标题应用于要在此处显示的文字。-6不同条件下的双纳米粒子体系(PFO和MEH-PPV纳米粒子体系)的荧光显微镜图。(a)没有进行预处理的双纳米粒子原液体系；(b)加入PLL(1×10-5M)之后的双纳米粒子体系；(c)加入PLL(1×10-5M)和ssDNA(5×10-12M)后的双纳米粒子体系。(d)该图为(a)-(c)溶液体系中纳米粒子的直径。其中图(a)和图(b)中的插图为对应区域的局部放大图结论我们利用再沉淀法制备了分散性非常好的双纳米粒子溶液体系。我们利用这个体系进行了阳离子聚电解质的响应性以及ssDNA的超灵敏检测。在本实验中，我们通过监测从PFO到MEH-PPV的荧光共振能量转移(FRET)效率发现双纳米粒子体系对阳离子聚电解质比如说PLL、PAH、PEI以及PDDA有很好的响应性，而这个体系对阴离子聚电解质则是没有响应性的。加入的阳离子聚电解质的浓度越大，FRET的效率会越高。在本实验中，双纳米粒子溶液体系的FRET效率用荧光强度比率(I574nm/I437nm)来表示。加入阳离子聚电解质(1×10-4M)之后，双纳米粒子体系的FRET效率至少增加了3.3倍，尤其是加入PLL之后的，纳米粒子溶液的FRET效率增加了原来的6倍。在荧光显微镜图像中，在PLL预处理过的纳米粒子溶液中，其注入ssDNA前后溶液中纳米粒子的距离以及MEH-PPV纳米粒子的亮度都是不同的。利用该方法，我们可以用来进行ssDNA的超灵敏检测，检测限可以达到1×10-14M。因此，我们相信这种基于FRET的双纳米粒子体系给我们提供了一种新的方法来进行超灵敏的DNA检测。参考文献[1] 张建伟,陈同生.荧光共振能量转移(FRET)的定量检测及其应用[J].华南师范大学学报(自然科学版),2012,44(03):12-17.[2] YangJ.Y,YangW.Y.Site-specifictwo-colorproteinlabelingforFRETstudiesusingsplitinteins[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2009,131(33):11644–11645.[3] XuQ,WuC,ZhuC,DuanX,LiuL,HanY,WangY,WangS.Awater-solubleconjugatedpolymerforproteinidentificationanddenaturationdetection[J].ChemAsianJ,2010,5:2524–2529.[4] TrainaC.A,BakusIiR.C,BazanG.C.Designandsynthesisofmonofunctionalized,water-solubleconjugatedpolymersforbiosensingandimagingapplications[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2011,133(32):12600–12607.[5] GaylordB.S,HeegerAJ,BazanG.C.DNAdetectionusingwater-solubleconjugatedpolymersandpeptidenucleicacidprobes[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2002,99(17):10954–10957.[6] ChenB,WangP,JinQ,TangX.Chemoselectivereductionandself-immolationbasedFRETprobesfordetectinghydrogensulfideinsolutionandincells[J].Organic&BiomolecularChemistry,2014,12(30):5629–5633.[7] HeF,FengF,WangS,LiY,ZhuD.Fluorescenceratiometricassaysofhydrogenperoxideandglucoseinserumusingconjugatedpolyelectrolytes[J].JournalofMaterialsChemistry,2007,17(35):3702–3707.[8] PearceD.A,WalkupG.K,ImperialiB.PeptidylchemosensorsincorporatingafretmechanismfordetectionofNi(II)[J].Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,1998,8(15):1963–1968.[9] JiangG,SushaA.S,LutichAA,StefaniF.D,FeldmannJ,RogachA.L.CascadedFRETinconjugatedpolymer/quantumdot/dye-labeledDNAcomplexesforDNAhybridizationdetection[J].ACSnano,2009,3(12):4127–4131.[10] WangF,BanerjeeD,LiuY,ChenX,LiuX.Upconversionnanoparticlesinbiologicallabeling,imaging,andtherapy[J].Analyst,2010,135(8):1839–1854.[11] ChenG,SongF,XiongX,PengX.Fluorescentnanosensorsbasedonfluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)[J].Industrial&EngineeringChemistryResearch,2013,52(33):11228–11245.[12] SanchesJ.M,RodriguesI.Aphotobleaching/photoblinkinganalyticalmodelforLSFCMimaging[J].MicroscopyandMicroanalysis,2013,19(S4):81–82.[13] XIAZ,LIUY.Reliableandglobalmeasurementoffluo-rescenceresonanceenergytransferusingfluorescencemi-croscopes[J].