食用菌剂模拟消化液耐受性检测方法

1食用菌剂模拟消化液耐受性检测方法本文件描述了食用菌剂（含菌体）在模拟消化液中的耐受性检测方法，包括仪器和设备、试剂和材料、耐受性检测、结果计算。本文件适用于粉末状食用菌剂（含菌体）在模拟消化液中的耐受性检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T601化学试剂标准滴定溶液的制备GB/T602化学试剂杂质测定用标准溶液的制备GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB4789.34食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌检验GB4789.35食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T23527.1—2023酶制剂质量要求第1部分：蛋白酶制剂QB/T4575食品用菌种制剂3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4仪器和设备除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下:4.1天平：感量0.01g、0.001g。4.2pH计：精确度0.1。4.3拍击式均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。4.4涡旋混合器。4.5恒温水浴锅：（37±2）℃。4.6容量瓶：10mL、100mL。4.7微量移液器及无菌吸头：1000μL、5000μL。4.8针头过滤器：0.45μm。4.9离心管：50mL。4.10无菌培养皿：直径90mm。4.11厌氧培养装置：厌氧培养箱、厌氧罐、厌氧袋或能提供同等厌氧效果的装置。25试剂和材料本方法中所用的水，在未注明其他要求时，应符合GB/T6682中三级水的规格，所用试剂，在未注明其他规格时，均指分析纯。分析中所用标准滴定溶液，杂质测定用标准溶液、制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T601、GB/T602、GB/T603的规定制备。5.1氢氧化钠：CAS1310-73-2。5.2浓盐酸（12mol/L）：CAS7647-01-0。5.3氯化钾：CAS7447-40-7。5.4磷酸二氢钾：CAS7778-77-0。5.5碳酸氢钠：CAS144-55-8。5.6氯化钠：CAS7647-14-5。5.7六水合氯化镁：CAS7791-18-6。5.8碳酸铵：CAS506-87-6。5.9二水合氯化钙：CAS10035-04-8。5.10胰蛋白胨：CAS73049-73-7。5.11L-半胱氨酸盐酸盐一水物：CAS7048-04-6。5.12十二水合磷酸氢二钠：CAS10039-32-4。5.13矿物油：CAS8042-47-5。5.14胃蛋白酶（CAS9001-75-6）：按GB/T23527.1—2023附录B方法，使用血红蛋白底物测定胃蛋5.15胰酶（CAS8049-47-6按GB/T23527.1—2023附录A方法测定胰酶活力，以胰蛋白酶活力计。5.16胆盐（CAS8008-63-7）：利用人总胆汁酸（TBA）酶联免疫法（ELISA）试剂盒进行定量检测，胆汁酸浓度单位以mmol/g表示。5.17氢氧化钠溶液（1.0mol/L）：称取4.0g氢氧化钠于烧杯中，加水并搅拌溶解，待溶液冷却到室温后用水定容至100mL。5.18盐酸溶液（1.0mol/L）：移取8.3mL浓盐酸溶于80mL水中，再加水定容至100mL。5.19电解质溶液A：称取0.064g氯化钾、0.015g磷酸二氢钾、0.263g碳酸氢钠、0.345g氯化钠、0.003g六水合氯化镁、0.006g碳酸铵、1.5g胰蛋白胨、0.05gL-半胱氨酸盐酸盐一水物，加入95mL蒸馏水充分溶解，调节pH至3.0，定容至100mL，121℃高压灭菌15min。5.20电解质溶液B：称取0.022g二水合氯化钙，加水溶解并定容至100mL，121℃高压灭菌15min。5.21电解质溶液C：称取0.057g氯化钾、0.012g磷酸二氢钾、0.793g碳酸氢钠、0.249g氯化钠、0.007g六水合氯化镁、1.5g胰蛋白胨、0.05gL-半胱氨酸盐酸盐一水物，加入95mL蒸馏水充分溶解，调节pH至7.0，定容至100mL，121℃高压灭菌15min。5.22电解质溶液D：称取0.088g二水合氯化钙，加水溶解并定容至100mL，121℃高压灭菌15min。5.23溶解液：称取8.5g氯化钠，0.5gL-半胱氨酸盐酸盐一水物，加入1000mL蒸馏水充分溶解，分装后121℃高压灭菌15min。5.24模拟胃液：取16.0mL电解质溶液A（5.19）和2.0mL电解质溶液B（5.20）于无菌离心管中，添加80000U的胃蛋白酶，调节pH至3.0，无菌水补充至20mL，混匀后经0.45μm无菌滤膜过滤制备模拟胃液，现配现用。5.25模拟肠液：取16.0mL电解质溶液C（5.21）和2.0mL电解质溶液D（5.22）于烧杯中，添加相当于4000U的胰酶，0.4mmol的胆盐，无菌水补充至20mL，混匀后经0.45μm无菌滤膜过滤制备模拟肠液，现配现用。35.26样品菌液：以无菌操作称取2.0g样品，置于装有198mL溶解液（5.23）的无菌均质袋中，充分混匀后，以10次/秒通过均质器拍打2min；或置于装有198mL溶解液（5.23）的无菌均质杯内，8000g～10000g均质1min～2min，直至样品分散均匀，制备成样品菌液，现配现用。6耐受性检测6.1模拟胃液耐受性6.1.1检测步骤本方法适用于食用菌剂的模拟胃液耐受性检测，检测步骤按图1所示步骤进行。图1模拟胃液耐受性检测步骤6.1.2初始活菌计数按GB4789.34、GB4789.35、QB/T4575或相关方法测定样品菌液（5.26）的活菌总数，记为A1。6.1.3模拟胃液处理取5.0mL模拟胃液（5.24）和5.0mL样品菌液（5.26）于50mL离心管中，涡旋混匀，用胶头滴管在溶液上方缓慢加入约5mL矿物油，使溶液上方形成油封层。将离心管置于37℃恒温水浴锅水浴2h，利用胶头滴管移除矿物油，制备模拟胃液消化液。6.1.4处理后活菌计数按GB4789.34、GB4789.35、QB/T4575或相关方法测定混合均匀的模拟胃液消化液（6.1.3）的活菌总数，记为A1’。6.1.5重复检测重复步骤6.1.2～6.1.4，完成2次相同样品的模拟胃液耐受性检测，初始活菌总数结果记为A2和A3，处理后活菌总数结果记为A2’和A3’。6.2模拟肠液耐受性6.2.1检测步骤4本方法适用于食用菌剂的模拟肠液耐受性检测，检测步骤按图2所示步骤进行。图2模拟肠液耐受性检测步骤6.2.2初始活菌计数按GB4789.34、GB4789.35、QB/T4575或相关方法测定样品菌液（5.26）的活菌总数，记为B1。6.2.3模拟肠液处理取5.0mL模拟肠液（5.25）和5.0mL样品菌液（5.26）于50mL离心管中，涡旋混匀，调节pH为7.0，用胶头滴管在溶液上方缓慢加入约5mL矿物油，使溶液上方形成油封层。将离心管置于37℃恒温水浴锅水浴2h，利用胶头滴管移除矿物油，制备模拟肠液消化液。6.2.4处理后活菌计数按GB4789.34、GB4789.35、QB/T4575或相关方法测定混合均匀的模拟肠液消化液（6.2.3）的活菌总数，记为B1’。6.2.5重复检测重复步骤6.2.2～6.2.4，完成2次相同样品的模拟肠液耐受性检测，初始活菌总数结果记为B2和B3，处理后活菌总数结果记为B2’和B3’。6.3模拟胃肠道消化液耐受性6.3.1检测步骤本方法适用于菌体的模拟胃肠道消化液耐受性检测，检测步骤按图3所示步骤进行。5图3模拟胃肠道消化液耐受性检测步骤6.3.2初始活菌计数按GB4789.34、GB4789.35、QB/T4575或相关方法测定菌体发酵液的活菌总数，记为C1。6.3.3模拟胃肠道消化液处理取5.0mL模拟胃液（5.24）和5.0mL菌体发酵液于50mL离心管中，涡旋混匀，用胶头滴管在溶液上方缓慢加入约5mL矿物油，使溶液上方形成油封层。将离心管置于37℃恒温水浴锅水浴2h，利用胶头滴管移除矿物油，制备模拟胃液消化液。取5.0mL模拟肠液（5.25）和混合均匀的5.0mL模拟胃液消化液于50mL离心管中，涡旋混匀，调节pH为7.0，用胶头滴管在溶液上方缓慢加入约5mL矿物油，使溶液上方形成油封层。将离心管置于37℃恒温水浴锅水浴2h，利用胶头滴管移除矿物油，制备模拟胃肠道消化液。6.3.4处理后活菌计数按GB4789.34、GB4789.35、QB/T4575或相关方法测定混合均匀的模拟胃肠道消化液（6.3.3）的活菌总数，记为C1’。6.3.5重复检测重复步骤6.3.2～6.3.4，完成2次相同样品的模拟胃肠道消化液耐受性检测，初始活菌总数结果记为C2和C3，处理后活菌总数结果记为C2’和C3’。7结果计算7.1模拟胃液耐受性结果计算模拟胃液耐受性检测中食用菌剂的初始活菌总数，按式（1）计算：M6式中：M——模拟胃液耐受性检测中食用菌剂的初始活菌总数，单位为菌落形成单位每克（CFU/gA1——第1次模拟胃液耐受性检测初始活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL）；A2——第2次模拟胃液耐受性检测初始活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL）；A3——第3次模拟胃液耐受性检测初始活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL）；200——样品溶解体积，单位为毫升（mL）；3——三次试验取平均值；m——样品质量，单位为克（g）；计算结果保留两位有效数字，以科学计数法表示。模拟胃液耐受性检测中食用菌剂的处理后活菌总数，按式（2）计算：M式中：M’——模拟胃液耐受性检测中食用菌剂的处理后活菌总数，单位为菌落形成单位每克（CFU/gA1’——第1次模拟胃液耐受性检测处理后活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL）；A2’——第2次模拟胃液耐受性检测处理后活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL）；A3’——第3次模拟胃液耐受性检测处理后活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL2——稀释倍数换算系数；200——样品溶解体积，单位为毫升（mL）；3——三次试验取平均值；m——样品质量，单位为克（g）；计算结果保留两位有效数字，以科学计数法表示。模拟胃液耐受性检测中食用菌剂的耐受性以（%）表示，按式（3）计算：X式中：X——模拟胃液耐受性检测中食用菌剂的耐受性；M’——模拟胃液耐受性检测中食用菌剂的处理后活菌总数，单位为菌落形成单位每克（CFU/gM——模拟胃液耐受性检测中食用菌剂的初始活菌总数，单位为菌落形成单位每克（CFU/g）；计算结果表示至整数。7.2模拟肠液耐受性结果计算模拟肠液耐受性检测中食用菌剂的初始活菌总数，按式（4）计算：N式中：N——模拟肠液耐受性检测中食用菌剂的初始活菌总数，单位为菌落形成单位每克（CFU/gB1——第1次模拟肠液耐受性检测初始活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL）；B2——第2次模拟肠液耐受性检测初始活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL）；B3——第3次模拟肠液耐受性检测初始活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL）；7200——样品溶解体积，单位为毫升（mL）；3——三次试验取平均值；m——样品质量，单位为克（g）；计算结果保留两位有效数字，以科学计数法表示。模拟肠液耐受性检测中食用菌剂的处理后活菌总数，按式（5）计算：N式中：N’——模拟肠液耐受性检测中食用菌剂的处理后活菌总数，单位为菌落形成单位每克（CFU/gB1’——第1次模拟肠液耐受性检测处理后活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL）；B2’——第2次模拟肠液耐受性检测处理后活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL）；B3’——第3次模拟肠液耐受性检测处理后活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL2——稀释倍数换算系数；200——样品溶解体积，单位为毫升（mL）；3——三次试验取平均值；m——样品质量，单位为克（g）；计算结果保留两位有效数字，以科学计数法表示。模拟肠液耐受性检测中食用菌剂的耐受性以（%）表示，按式（6）计算：Y式中：Y——模拟肠液中食用菌剂的耐受性检测；N’——模拟肠液耐受性检测中食用菌剂的处理后活菌总数，单位为菌落形成单位每克（CFU/gN——模拟肠液耐受性检测中食用菌剂的初始活菌总数，单位为菌落形成单位每克（CFU/g）；计算结果表示至整数。7.3模拟胃肠道消化液耐受性结果计算模拟胃肠道消化液耐受性检测中菌体的初始活菌总数，按式（7）计算：P式中：P——模拟胃肠道消化液耐受性检测中菌体的初始活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL）；C1——第1次模拟胃肠道消化液耐受性检测初始活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL）；C2——第2次模拟胃肠道消化液耐受性检测初始活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL）；8C3——第3次模拟胃肠道消化液耐受性检测初始活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL）；3——三次试验取平均值；计算结果保留两位有效数字，以科学计数法表示。模拟胃肠道消化液耐受性检测中菌体的处理后活菌总数，按式（8）计算：式中：P’——模拟胃肠道消化液耐受性检测中菌体的处理后活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL）；C1’——第1次模拟胃肠道消化液耐受性检测处理后活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL）；C2’——第2次模拟胃肠道消化液耐受性检测处理后活菌总数，单位为菌落形成单位每毫升（CFU/mL）；C3’——第3次