基因工程复习2

基因工程

一、名词说明

1.基因：是分子中含有特定遗传信息的一段核甘酸序列，是遗传物质的最小功

能单位。

2.定位克隆：获得基因在染色体上的位置信息，然后采纳各种方法对该基因进

行定位和克隆

3重组：是由于不同链的断裂和连接而产生片段的交换和重新组合，形成新分子

的过程。

4.克隆：科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆

技术，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细

胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。

5克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质一一同源或异源、原核

或真核、自然或人工的与载体相结合成一具有自我复制实力的分子一一复制

子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进

行扩增、提取获得大量同一分子，即克隆。

5.融合基因：是指应用体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不

同基因核甘酸序列的新型基因。

6.:是指以在反转录酶作用下合成第一链为模板进行的。

7.:起始于、止于、、的连续的密码子区域，是潜在的编码区。

8.:指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的片

段。

9.基因工程：在体外把核酸分子（的分别、合成）插入载体分子，构成遗传物质

的新组合（重组），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁

殖，培育符合人们须要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品

等。

10.5,：是一种通过进行末端快速克隆的技术，是以为模板反转录成第一链后

用技术扩增出某个特异位点到5,端之间未知序列的方法。

11文库：是指某生物某一发育时期所转录形成的片段与某种载体连接而成的克

隆的集合。

12.载体：能载带微量物质共同参加某种化学或物理过程的常量物质，在基因工

程重组技术中将片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的分子。三

种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。

13.基因诊断：乂称诊断或分子诊断，通过分子生物学和分子遗传学的技术，干

脆检测出分子结构水平和表达水平是否异样，从而对疾病做出推断。

14.限制性核酸内切酶：是由细菌产生的一类能特异识别双链中的特定碱基序

列，并在识别位点切割磷酸二酯键的核酸内切酶（简称限制酶）。

15.基因文库：将全部的重组分子都导入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混

合体，这样一个混合体称为基因文库。

16文库：从组织细胞中分别得到纯化的，然后以为模板，利用逆转录酶合成其

互补，再复制成双链片段，与适当载体连接后导入受体菌内，扩增，构建文

库。

17：标记是发展最早的标记技术。是指基因型之间限制性片段长度的差异，这

种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。

18.核酸探针：是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特别的方法探

知的分子。抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用都可

以看作是探针与靶分子的相互作用。

19穿梭质粒载体：指一类由人工构建的具有两种不同复制起点的选择标记，

因而可在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体。

20.限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来爱护宿主细胞不受

外源的感染，可讲解外来，从而阻挡其复制和整合到细胞中。一般来说，与限

制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能爱护自身的不被

讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。

21.星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相像的序列，这个

变更的特征称为星星活性。

二、简答题

1.载体的分类

按功能分：克隆载体：（主要用于扩增或保存片段，是最简洁的载体。具有强大

的包装实力）

表达载体：（带有H标细胞识别的启动子）

其他载体：（整合载体、穿梭载体等）

按进入受体细胞类型分（1）原核载体

（2）真核载体

（3）穿梭载体

按来源分：质粒（细菌等原核生物染色体外遗传物质）

噬菌体（原核细胞的病毒）

真核病毒（真核细胞的病毒）

人工遗传物质（噬菌粒、粘粒、细菌、酵母等）

2、基因克隆载体必备条件：

1）具有多种单一核酸内切酶切割位点（多克隆位点）一个或多个）外源插入，不

影响载体复制。

2）能携带外源片段进入受体细胞能自我复制，或整合到染色体随受体细胞复制

而复制。

3）有选择克隆子的标记基因（筛选标记）。

4）分子量小，拷贝数高，易从宿主细胞中分别。

5）平安性（不含损害受体的基因，不随意转入别的,尤其人的细胞）。

3、表达载体和基因工程一般克隆载体在元件构成上有何差别？

表达载体：启动子；终止子；核糖体结合位点（序列）；筛选标记；复制子（质

粒拷贝数）；多克隆位点

克隆载体：筛选标记；复制子（质粒拷贝数）；多克隆位点

4、原核表达载体与真核表达载体与穿梭载体的区分

1）真核表达载体和原核表达载体就是能在直核生物或原核生物中表达的载体,它

们一般都带有能在真核生物或原核生物中表达的必需表达元件；

2）真核表达和原核表达的R的都是为了能够大量获得自己所须要的R的基因的

表达产物,最好有生物活性，以便下一步的试验须要.

3）原核表达载体一股只能在原核生物中表达外源基因，但有些穿梭载体可以分别

在真核和原核生物中表达它们的表达元件.

5、什么是包涵体？

重组蛋白在胞内表达时，经常以不溶性蛋白聚集成的晶状物形式存在，这种晶

状体即包涵体。包涵体的形成是外源蛋白的高效表达时的普遍现象，这是由于

肽链折叠过程中部分折叠的中间态发生了错误聚合，而不是形成成熟的自然态

或完全解链的蛋白。

探针标记的方法：

（1）缺口平移法（）

原理与过程：反应体系中酶I随机在探针上打开缺口，然后利用聚合酶I5'

一3,外切酶活性，在缺口处按5,一3,方向切除单核甘酸；同时聚合酶I有

5'-3'的聚合酶活性，在缺口处3'端加入底物中的单核甘酸，弥补缺口处

的核甘酸链。随着反应的进行底物中被标记单核甘酸，并被随机掺入。聚合酶1

的两种作用交替进行，探针即被标记。

（2）随机引物法（6核甘酸引物标记法）

原理与过程：利用聚合酶I的亚单位，合成含有标记核甘酸的链。具有5,一

3'聚合酶活性。被标记的（探针）变性成单链，引物与模板结合。在的催化下，

以引物3,端为起点，沿模板3，一5,方向合成新链。反应体系中含有标记的,

随机掺入新合成的链中，探针即被标记。

（3）末端标记

多核昔酸激酶的用途5'端磷酸化、标记的5'端。包括正向反应和交换反应标记

法

6、反应的基本原理：

1）变性：在反应体系中，通过加热使温度至95c左右，使双螺旋的氢键断裂，

形成单链作为反应模板。

2）退火：反应中，经变性后将温度降至引物的值左右或以下，引物与模板互补

区域结合，形成杂交链的过程。

3）延长：当反应体系温度升至70c左右时，聚合酶催化以引物为起始点的

5'-3'延长反应，形成新生链。

7、引物设计的基本原则

最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。

（1）引物长度一般为15~30个核甘酸。

（2）碱基随机分布，避开出现喋吟，喀咤的积累现象。的含量为45~55%。（3,

端和5,端引物具有相像的值。4（）+2（）o引物长度要确保解链温度不低于

54°Co）

（3）两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避开3'端的互补重叠，连续互补

序列一般不超过3。

（4）引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。

（5）引物3'端碱基肯定要与模板配对，最佳碱基选G和C而不用A。

（6）引物的5,端没有严格限制，可以修饰，如加限制酶位点，引入突变位点，

起始密码子，终止密码子等。

别片段的范围为0250之间：而聚丙烯酰胺辨别片段的范围为17000,分别小片

段效果最好，辨别率极高，相差1的也可分开。

13、转基因与克隆的不同

将人工分别和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引

起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术.

科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术，其

本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该

细胞系中每个细胞的基因彼此相同。

克隆是对单体的复制，这和转基因有着很大的不同。转基因技术可以保持生物

基因的多样性，而克隆却没有什么帮助，反而有肯定的威逼。

三、论述题

1、文库的构建

（1）分别细胞总，纯化分别。

（2）以为模板，在逆转录酶的催化下，合成第一链，

（3）双链的合成：（方法）第一链与模板分别之前，在第一链分子3,端加上

一段（）。通过碱性蔗糖梯度离心处理，使模板分子降解，回收全长的第一链。

最终以互补的（）序列作为引物引导其次链的合成

（4）将合成的双链重组入载体，导入宿主（大肠杆菌）增殖

2、什么是基因组文库（）？构建基因组文库，涉与哪些基本过程?它同遗传学上的

基因库有什么不同？

基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组的各种片段

的克隆群。一般以改造的噬菌体或黏粒作为载体，包括下列过程：（1）高分子量

染色体的制备；（2）体外重组连接；（3）包装蛋白的制备；（4）重组体的体外包

装；（5）将重组导人寄主细胞；（6）筛选。基因组文库同遗传学上所讲的基因库

是完全不同的概念。基因库（）是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖

的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中，由于运用的载体不同，分

为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、文库、文库等。

3、目的基因筛选的策略

1、核酸杂交筛选

原理：将基因文库的菌落或噬菌斑原位转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜之后，进

行裂解，释放并且固定在膜上，利用特异的核酸探针进行筛选，依据碱基配对

原则筛选到目的基因。

适用范围：

（1）目的基因序列已知，利用该基因作为探针筛选。

（2）“基因园”：目的基因序列未知，同源基因已知，利用同源基因序列制备

探针筛选。

（3）寡核甘酸简并引物探针：对目的基因的表达产物的氨基酸序列有所了解，

则可以从这些氨基酸序列倒过来推导出核酸的可能序列，合成寡核昔酸作为探

针。

2、抗体筛选

（1）适用范围：己有目的基因表达产物的特异性抗体，利用抗体筛选表达特异

抗原的克隆。

(2)原理：将定向克隆到表达载体构建成表达文库，用能与目的基因表达产物

特异结合的抗体与文库中能表达目的基因的克隆结合，再用标记的二抗与一抗

结合，指示目的基因所在克隆。

3、功能结合法筛选

适用范围：己知目的基因表达产物的功能

(1)噬菌体显示法

噬菌体展示技术的原理：噬菌体展示技术是将外源通过基因工程技术克隆到适

当的噬菌体载体上，使外源片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣壳蛋白上形

成融合蛋白，呈现在噬菌体表面。外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而

其编码基因作为噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌体序列测序出来。

(2)酵母单、双杂交法

酵母质粒有9和424o

酵母双杂合系统用于检测已知蛋白质之间的相互作用，还可用于蛋白质的功能

域探讨与未知蛋白编码基因的分别克隆等。

4、杂交一般过程与影响杂交因素。

杂交操作步骤：

(1)用限制性内切醐防切，经凝胶电泳分别各酶切片段；

(2)转膜：将片段转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；

(3)预杂交：封阻滤膜上非特异性位点；

(4)杂交：让探针与同源片段特异性结合；

(5)洗脱：去除非特异性结合的探针；

(6)自显影检查目的所在的位置。

杂交影响因子

1)、目的在总中所占的比例

2)、探针的大小和标记效率

3)、转移到滤膜上的量

4)、探针与靶的同源性

5、简洁阐述差异显示克隆基因的原理与其优缺点，有何应用？

主要原理：利用真核生物结尾处有(A)结构，在其3'端设计象5'11样引物，该

引物可与总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5'

端的随机引物(20条10),可以使不同长度的基因得到扩增。

优点：

简便、灵敏、高效、省时，能快速显示的组成。

所需的量少。

各样本的差异可同时进行比较。

扩出的可干脆用于测序、文库筛选等。

缺点：

假阳性条带多，对低丰度的基因表达不简洁检测。

工作量大。

无法定量探讨。

扩出的条带往往是3、端比较短的区的一段序列，供应的信息较少.

利用该技术，目前已有越来越多的差别表达基因得以分别和鉴定，在分子生物

学和基因工程探讨领域发挥了极大的作用。(P221)

6、抑制性差减杂交的原理与应用。

原理：的核心技术是抑制性，它是一种将检测子单链标准化步骤和消减杂交步

骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的单链丰度，而消减杂

交步骤去除了检测子和驱逐子之间的共同序列，使检测子和驱逐子之间不同的

序列得到扩增。

应用：

1基因突变体的探讨：如