几种溶磷内生菌的鉴定和溶磷能力的研究

几种溶磷内生菌的鉴定和溶磷能力的研究

摘要磷是植物生长发育过程中的重要元素，在植物的碳、氮等代谢中扮演着至关重要的角色，所以如果土壤缺磷就会对植物的生长与发育造成非常严重的影响。虽然我国土壤中总磷含量较高，但是大部分的磷和金属离子结合成难溶性的磷酸盐，这些盐很难被植物吸收利用，所以导致土壤中很大一部分的磷都变为了无效磷。目前，土壤中有效磷的含量是限制我国农业发展的一个非常重要的原因，因此为了促进我国农业的发展和农作物产量的提升，不能只是单纯依靠提高施肥量，对土壤中无效磷向有效磷有转化的研究是不容忽视的。微生物广泛分布于自然环境中，同时微生物也是自然环境中各种元素循环的关键角色。经过研究发现，土壤和植物中有许多溶磷微生物，它们可以把土壤中难容的无效磷转化为植物可以利用的可溶的有效磷。人们对土壤、水体、植物根际、等环境的溶磷微生物进行了有关溶磷效应、溶磷机制及其应用效果等方面的研究，认识较为全面，但有关植物内生溶磷细菌的分离研究仍需进一步探讨。黄鹌菜（Youngiajaponica）和天蓝苜蓿（MedicagolupulinaL.）繁殖快、生存能力强，在缺乏营养元素的恶劣生境下可以顽强生长。说明这两种植物自身存在有一些帮助植物体汲取养料的微生物，经过之前的实验也证实这两种植物体内存在一定数量的溶磷内生细菌。对这些溶磷内生细菌进一步加以鉴定并且探究各溶磷内生细菌的溶磷情况，以及部分溶磷作用较强的菌种的最佳溶磷条件，不光可以扩大溶磷微生物来源、丰富功能内生细菌资源库，还可以为溶磷内生细菌的实际应用提供更准确的数据参考。实验中选取了7株溶磷内生细菌作为实验样品。对纯化的菌株进行16SrRNA基因测序。鉴定出一共包括5个属，包括假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、不动杆菌属（Acinetobacter）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、短波单胞菌属（Brevundimonas）。其中，主要为假单胞菌属（Pseudomonas）。可溶磷的细菌多为假单胞菌属。其中溶磷效果更好、更明显的也是假单胞菌属。在溶磷内生细菌对不同的磷源溶解情况的实验中，对磷酸钙的溶解量高于对磷酸铁的溶解量，对于磷酸钙和磷酸铁混合为磷源的部分，没有发现对溶磷结果有太大影响。关键词：溶磷内生细菌；16SrRNA基因；分离纯化；鉴定；溶磷活性

AbstractPhosphorusisanimportantelementinplantgrowthanddevelopment,andplaysavitalroleinplantcarbonandnitrogenmetabolism.Therefore,ifsoilphosphorusdeficiencyoccurs,itwillhaveaveryseriousimpactonplantgrowthanddevelopment.AlthoughthetotalphosphoruscontentinsoilishighinChina,mostofthephosphorusandmetalionscombinetoforminsolublephosphate.Thesesaltsaredifficulttobeabsorbedbyplants,soalargepartofthephosphorusinthesoilhasbecomeaphosphorus.Atpresent,thecontentofavailablephosphorusinsoilisaveryimportantreasontolimitthedevelopmentofChina'sagriculture.Therefore,inordertopromotethedevelopmentofagricultureandtheincreaseofcropyieldinChina,wecannotsimplyrelyonincreasingtheamountoffertilization.Microorganismsarewidelydistributedinthenaturalenvironment,andmicrobesarealsoakeyplayerinthecyclingofvariouselementsinthenaturalenvironment.Studieshavefoundthattherearemanyphosphorus-dissolvingmicroorganismsinsoilandplants,whichcanconverttheineffectivephosphorusinthesoilintosolubleavailablephosphorusthatplantscanuse.Peoplehavestudiedthephosphorus-dissolvingmicroorganisms,themechanismofphosphorussolubilizationandtheapplicationeffectsofphosphorus-dissolvingmicroorganismsinsoil,water,plantrhizosphereandotherenvironments.Theunderstandingismorecomprehensive,buttheseparationofplant-derivedphosphorus-dissolvingbacteriaStillneedtobefurtherexplored.YoungiajaponicaandMedicagolupulinaL.breedfastandhavestrongviability,andcangrowstubbornlyintheharshhabitatlackingnutrients.Itisindicatedthatthetwoplantsthemselveshavesomemicroorganismsthathelptheplantstotakenutrients.Ithasbeenconfirmedbypreviousexperimentsthatthereareacertainamountofendophyticbacteriainthetwoplants.Theseendophyticbacteriaarefurtheridentifiedandthephosphorussolubilizationofendophyticbacteriaandtheoptimumphosphorussolubilizationconditionsofsomestrainswithstrongphosphorussolubilizationcanbeexplored,whichnotonlycanexpandthesourceofphosphorus-dissolvingmicroorganisms,butalsoenrichthefunctions.Theendogenousbacterialresourcepoolcanalsoprovideamoreaccuratedatareferenceforthepracticalapplicationofendogenousbacteriaforphosphorussolubilization.Sevenstrainsofendogenousphosphorus-dissolvingbacteriawereselectedasexperimentalsamples.Thepurifiedstrainwassubjectedto16SrRNAgenesequencing.Atotaloffivegenerawereidentified,includingPseudomonas,Bacillus,Acinetobacter,Paenibacillus,andBrevundimonas.ThebacteriathatdissolvephosphorusaremostlyPseudomonas.Amongthem,theeffectofdissolvingphosphorusisbetterandmoreobviousisalsoPseudomonas.Intheexperimentofthedissolutionofendophyticbacteriatodifferentphosphorussources,thedissolutionofcalciumphosphateishigherthanthatofironphosphate.Forthepartwherephosphorusphosphateandironphosphatearemixedasphosphorussource,nophosphorusisfound.Theresulthastoomuchimpact.目录第一章绪论 第一章绪论1.1研究背景磷元素是植物生长不可缺少的元素，也是植物生长所必须的大量营养元素。其不仅是植物体的重要组成成分(如核酸,卵憐脂等),而且以不同的形式(如ATP等)参与植物体的各项生理生化活动ADDINNE.Ref.{9A0DC83A-65D1-485A-8359-9A719F8B05B7}[1]。研究表明我国土壤中总磷含量较高，但是大部分的磷会和一些金属离子结合成难溶性磷酸盐而难以被植物吸收利用，这在很多时候成为制约植物生长的控制因素ADDINNE.Ref.{E9C62B93-5A0A-4B76-A793-125E34635D28}[2,3]。当前主要通过施加化肥来提高土壤中磷元素的含量，但是大部分的磷化肥在施用过后会迅速被固定,成为植物不可以利用的无效磷，单纯的依靠增加磷肥的施用量并不是很好的办法。这些所施用的磷会经过雨水的冲刷,渗入地下,流入江河,增加水体中的磷含量，从而引起水体富营养化,甚至产生水华等破坏生态环境的影响。长期过量的施加化肥还会导致土壤板结等问题，同时也是严重的资源浪费。磷是农业生产中一个重要的限制因素，而溶磷微生物干预似乎是解决土壤中磷有效性的有效途径ADDINNE.Ref.{DAFA0AFB-3058-4484-8F62-93B5A451848C}[4]。研究表明,很多植物内生菌对植物的生长有促生作用,其中就有部分溶磷菌。对于提高作物的产量,减少化学磷肥的使用,保护生态环境具有积极而重大的意义ADDINNE.Ref.{555A6129-59C3-4760-912C-0AB3F3FE0F52}[5]。这些溶磷菌能够通过自身代谢作用将土壤中的难溶性磷元素（比如磷酸钙、磷矿粉等）溶解，使其转化为易于被植物吸收利用的有效磷。具溶磷能力的内生菌的分离筛选有助于扩大溶磷微生物来源,丰富功能内生细菌资源库及开发新的改善土壤磷素营养途径，利用溶磷菌增加土壤肥力对我国农业发展具有重大意义ADDINNE.Ref.{5C7D6EB2-EB63-4A6D-B680-9FA76960B7FD}[6]。植物内生菌是指一类在其生长过程中的一段时间或整个生长阶段一直在植物体内的健康组织或器官中,并且不引起植物明显症状变化的微生物ADDINNE.Ref.{B2A46E79-78A0-4A67-B323-26BC10F9EE96}[7]。这些微生物包括有细菌、真菌、放线菌等,通过分泌对植物生长有促进作用的激素或抑制病害菌的生长,直接或间接的促进植物的生长发育。在很久以前,研究人员就发现了在健康的植物组织中生活的微生物,这些微生物不会引起植物明显的病变或者使植物的生长受到阻碍。但是对于这些微生物的定义却存在着很多争议。开始将其定义为生活在植物组织之内的微生物,用来区分生活在植物表面的那些表生菌，但是这样就将一些致病菌也包含其中。之后修改为生活在植物的地上部分的生活组织中,并且不会引起植物产生明显病害症状的微生物,这个概念强调了植物与内生菌之间的共生关系。目前相对比较统一的观点是认为植物内生菌是指那些在其生活史中的某一阶段或全部阶段生活在健康植物各种器官或组织中的微生物,对于生长在其上的宿主植物并不表现出(或当时不表现出)外在明显病症,并且可以通过组织学方法和严格的表面消毒的植物组织中分离或是从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生ADDINNE.Ref.{42F0275D-30BC-48B0-896D-4EACB93FBFBE}[8]。目前人们对于溶磷内生细菌的研究也是比较多的,通过查询文献可知,主要包括有以下几个属:假单胞菌属(Pseudomonas)、芽胞杆菌属(Bacillus)、硫氧化硫功菌(Thiobacillusthivoxidans)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Serratia)、黄杆菌属(Flavobacteriutn)、产碱菌属(Alcaligenes)、肠细菌属(Enterbacter)、微球菌属(Micrococcus)、固氛菌属(Azotobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、色杆菌属(Chromobacteriurn)、多硫杆菌属(Thiobacillus)、节细菌属(Arthrobacter)和根瘤菌属(Rhizobium)等ADDINNE.Ref.{64B915A5-3A2D-4F1F-A5B1-C875553BC916}[9]。植物中不光存在植物内生真细菌，还存在植物内生真菌。植物内生真菌也是栖息在植物内部，尤其是根、茎、叶等部分，对寄主无明显危害的微生物，而且几乎所有的维管束植物和禾本科植物体内都有内生真菌存在。关于内生真菌的研究和植物内生细菌一样也具有悠久的历史，研究表明，植物内生真菌类群丰富，每种植物至少含有1种内生真菌ADDINNE.Ref.{23F1E885-E2A0-4636-98A0-DC8BEDDD8F72}[10]。近些年来，植物内生真菌受到了相当大的关注，其次生代谢产物具有防治植物病虫害、生物抗菌活性、抗肿瘤活性等作用。内生真菌不完全具有专一性，同一种内生真菌可以寄生在多种宿主植物体内，并且同一种内生真菌也可以寄生在宿主植物的不同部位ADDINNE.Ref.{0AA0467F-9D5C-45AB-B296-E0E50815BC3E}[11]。1.2内生菌的研究发展对内生菌的研究可以追溯到19世纪中叶，至今已经有一百多年的历史，研究者最早是从高等植物的茎叶化石中发现了一些与植物相关的微生物，这一研究证明早在地球出现高等植物时，微生物与植物的相互作用就开始演变ADDINNE.Ref.{070E4F8D-D1E8-459E-94B6-02E1EB05BDBC}[12]。现代植物和真菌之间的丛枝菌根共生现象无处不在，这有助于大多数维管植物获取养分。通过以前的研究可以发现，丛枝菌根可能在早期陆生植物的成功中发挥了重要作用ADDINNE.Ref.{CD4817AE-449F-4CAD-A144-1FB915760088}[13]。1876年Pasteur从无菌的葡萄果汁中分离出植物内生细菌，从此使植物内生细菌的研究开始受到关注。但是并没有人对内生细菌作出明确的定义，直到1886年。DeBary首先给这种植物内生细菌命名为植物内生菌(endophyte)，指一类有部分或全部生存时间在健康植物组织内部，而不会使宿主植物表现出明显感染症状或者影响宿主植物生长的微生物ADDINNE.Ref.{D0AFAC6F-A93B-4C0E-A47B-A4F9A1F96F50}[14]。植物内生细菌可以寄生在植物体的各个部分，包括根、茎、叶、花、果实、种子中。例如1951年HOLLIS从马铃薯块茎中分离得到巨的大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、节杆菌属(Arthrobactersp.)、阴沟气杆菌(Aerobactercloacae)。1987年Gagnes等曾从苜蓿的根中分离出丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)、假单胞菌(Pseudomonassp.)、草生欧文式菌(Erwiniaherbicola)和欧氏杆菌(Eroiniasp.)等内生细菌ADDINNE.Ref.{082F8BBC-6172-4196-8855-B994E9098481}[15]。1995年PLEBANS等在温室中对向日葵的花和花椰菜的种子接种内生细菌对病虫害进行防控。20世纪90年代，Stierle等人从短叶红豆杉韧皮部分离到产紫杉醇的内生真菌ADDINNE.Ref.{B400216B-CCB5-4A1C-9E9D-3E55EE6D5AE9}[16]。随着人们对植物内生菌的深入研究，发现内生细菌的种类是非常多的，内生细菌的功能也是非常的广泛。从微生物资源开发的角度看植物内生细菌，可以说内生细菌是巨大且宝贵的微生物资源库。1.3内生菌的应用价值植物内生细菌的应用价值主要为生物防治作用、促生作用和固氮作用。植物体中的一些内生细菌能抵抗某些鳞翅目害虫和线虫等对植物体的入侵。促生作用分为两种：直接促生作用和间接促生作用。分别是通过产生植物激素促进植物生长和通过抵抗植物致病菌促进植物生长的两种方式ADDINNE.Ref.{A2EB8678-F538-40DE-A6C0-C713ACEB6D19}[17]。（1）、生物防治内生细菌生物防治的原理主要有三个方面：①一些内生细菌在植物体内可以产生抗生素，这些抗生素对病原菌可以起到拮抗作用，从而降低了植物对有害环境条件的敏感性，提高植物自身的抗逆性ADDINNE.Ref.{9BB85B6C-0C8F-40E2-B865-107D72519761}[15,18]。②一些内生细菌能产生杀菌蛋白或者几丁质酶等，可以破坏病原菌的完整生物结构从而杀死病原菌。③除了产生特异的抗性物质,内生细菌的生物防治也包括非特异性方面,即内生细菌在植物体内实际上是抢占了病原菌的生存空间。由于资源有限，所以病原菌的入侵和定殖都会受到一定的限制。内生细菌与病原菌争夺资源，使病原菌得不到正常的营养供给而消亡。（2）、促生作用研究表明，有些植物内生细菌能产生赤霉素、植物生长激素等植物激素作为促生物质。其中研究最多的是吲哚乙酸，假单胞菌属和芽孢杆菌属等都能产生分泌吲哚乙酸。草生欧文氏菌不仅可以产生吲哚乙酸，还可以产生细胞分裂素。一般来说，内生菌感染的植株往往比没有被内生菌感染的植株生长的更快。这些促生物质能够非常有效地促进植物的生长。（3）、固氮作用经过研究发现，很多植物内生细菌都能够吸收空气中的氮气并将其固定为化合态氮。固氮内生细菌是通过利用植物产生的多余能量进行固氮的，与根瘤菌不同的是，固氮内生细菌与植物不形成特定的组织结构，而且这种固氮方式几乎可以在植物的各种营养器官进行。在植物与固氮内生细菌的长期共进化过程中形成了宏观调节系统，植物不再需要将一大部分能量用于固氮作用，避免能量不足导致植物自身对微生态系统和代谢系统的正常调节作用失控，否则很可能不光无法促进植物的生长，还会抑制植物的生长。植物在这种固氮作用下能始终处在较为主动的地位。所以有效地发挥非豆科作物内生细菌的固氮作用，可以在一定程度上取代或减少化肥的使用。固氮内生细菌分为兼性固氮内生细菌和专性固氮内生细菌。前者可以在根表、根内或者在土壤中都可以表现出活跃的生存状态，而后者只能生存在根内或茎叶等部位，无法再土壤中存活。同兼性固氮内生细菌相比，专性固氮内生细菌虽然不能在植物组织外部生存，但可以随着宿主植物的种子萌发产生的新组织和植物新植株进行散播。另外,兼性固氮内生细菌可以侵入并定殖到植物内部组织,但与专性固氮内生细菌不同的是,它们能在植物组织外部存活一定的时间ADDINNE.Ref.{FF9C9F2E-1446-46F8-9173-542B372C47F3}[17]。

第二章材料与方法2.1内生菌活化、筛选2.1.1实验材料（1）供试菌在校园内采样得到的黄鹌菜和天蓝苜蓿的根系中提取出的溶磷内生菌，经过分离纯化后接种到试管中并在4℃的冰箱中保存。黄鹌菜（Youngiajaponica），一年生草本，菊科。生于山坡、山谷及山沟林缘、林下、林间草地及潮湿地、河边沼泽地、田间与荒地上。温度、湿度无太多要求，具有很强的适应性。有很高的药用价值，可以治疗咽喉炎、跌打损伤等。其分布范围非常广，北京、甘肃、山东、江苏、浙江、江西、陕西、福建、河南、湖北、安徽、湖南、广西、四川、广东、云南、西藏等地均有分布。在日本、印度、菲律宾、中南半岛、马来半岛、朝鲜等地也有分布。天蓝苜蓿（MedicagolupulinaL.），一年生或多年生草本，豆科。似三叶草，因为耐干旱，耐冷热，产量高而质优，又能改良土壤等优势为人所知。广泛栽培，主要用于制造干草、青贮饲料或用作牧草。产地非常广，遍布我国南北各地，甚至在青藏高原也可以找到。适于生长在凉爽气候及水份良好土壤，但在各种条件下都可以发现野生种，一般多见于河岸、田野、路边及林缘等地。欧亚大陆广泛分布，世界各地均有归化种ADDINNE.Ref.{BB524AA9-6BAE-49F5-969A-4FCEAAEA6E18}[19]。（2）器材高压蒸汽灭菌锅、电子天平、滤纸、勺子、玻璃棒、烧杯（1000ml，100ml）、9cm培养皿、锥形瓶、接种环、酒精灯、恒温培养箱、冰箱、紫外灯超净工作平台。（3）试剂二水合硫酸钙、碳酸钙、氯化钠、琼脂、70%酒精、无菌水、甘露醇、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、葡萄糖、硫酸铵、酵母浸粉、氯化钾、硫酸亚铁、硫酸锰、磷酸三钙、溴酚蓝。（4）培养基①普通培养基：甘露醇10.0g、磷酸二氢钾0.2g、七水合硫酸镁0.2g、氯化钠0.2g、二水合硫酸钙0.2g、碳酸钙5.0g、琼脂20.0g、水1L。②无机磷筛选培养基（固体）：葡萄糖10.0g、硫酸铵0.5g、酵母浸粉0.5g、氯化钠0.3g、氯化钾0.3g、硫酸镁0.3g、硫酸亚铁0.03g、硫酸锰0.03g、磷酸三钙5.0g、琼脂15g、0.4%溴酚蓝6ml、水1L。2.1.2实验方法（1）培养基配置用烧杯按成分配制培养基，然后分装入锥形瓶，加塞，包扎，再用高压蒸汽锅灭菌20min。灭菌完后在预先进行过紫外表面灭菌15min的紫外灯超净台上倒平板，待凝固后放入4℃冰箱中冷藏备用。（2）内生菌的活化把冰箱中冷藏的普通培养基和接种环等在紫外灯超净台上紫外表面灭菌15min。在超净台上点燃酒精灯并灼烧接种环，待接种环冷却后，在酒精灯火焰旁边用其将斜面保存的供试菌挑取出来，接种在普通固体培养基上，倒置平板于28℃恒温培养箱中培养。培养1—2天后，没有生长的供试菌重新活化，活化3次还没有生长的菌做放弃处理。（3）溶磷菌的初步筛选对在普通培养基上成功生长的菌进行初步筛选。把冰箱中冷藏的无机磷筛选培养基（固体）和接种环等在紫外灯超净台上紫外表面灭菌15min。在超净台上点燃酒精灯并灼烧接种环，待接种环冷却后，在酒精灯火焰旁边用接种环将活化成功的菌接种到无机磷筛选培养基上于28℃恒温培养箱中培养2天，可以成功生长的菌确定为本次实验的对象。（4）溶磷菌的分离实验采用的是平板划线分离法，步骤如下：①取平板做分区标记：在皿底将整个平板分为三个部分，分别按照顺序标记为A、B、C。②划线操作：在酒精灯火焰旁，用灼烧灭后的菌接种环挑取少量菌种在A区划三条平行的线，灼烧接种环；待接种环冷却后，用接种环从A区三条线的末尾往B区划三条平行的线，灼烧接种环；重复此步骤在C区也划出三条平行的线不能与起始A区三条线相连接。③培养1—2天后，检查是否有单个菌落产生，如没有，继续划线分离，得到单个菌落为止。2.2内生菌鉴定2.2.1实验器材PCR仪、离心机、电泳仪及电泳槽、紫外透射检测仪、水浴锅、移液枪及枪头、量筒、电子天平、250mL锥形瓶、1.5mL离心管、牙签、微波炉。2.2.2实验试剂（1）DNA提取试剂：lysisbuffer（2）PCR试剂：引物27F/1492R、RNase-freewater、PremixTaqTM。（3）1.5%琼脂糖凝胶：琼脂糖0.06g，0.5×TBE40mL。（4）DNAMarker、Green-DNADye染料。2.2.3分子生物学鉴定方法ADDINNE.Ref.{99FED0FA-01DD-4025-9B64-3D1A2C2F6460}[20]溶磷菌16SRNA鉴定，提取内生菌基因组总DNA，参照SaikkonenK的方法用细菌通用引物F27/R1492进行扩增ADDINNE.Ref.{651A3350-06E7-4728-B875-AD86C54790A0}[21]。上游引物27F：CCTACGGGAGGCACGAG，下游引物1492R：GTATTACCGCGGCTGCTGG。将PCR扩增出来的产物交由昆泰锐生物技术有限公司，参照HaUmarmJ的方法将测序结果用BLAST软件与GenBank中的相关属种的16SrRNA基因序列进行比对ADDINNE.Ref.{83A16B01-C80A-46DD-B645-51EBFFA8CFE3}[22]。内生菌基因组DNA的提取用移液枪向2mL的离心管中加入50μL裂解液，并挑取少量划线分离出单菌落的内生菌在裂解液中反复吹吸，使内生菌充分溶解在裂解液中。将离心管放入离心机中，以5000rpm的转速离心1min。将离心管放入80℃水浴锅中热水浴10min，再放入-80℃的冰箱中冷冻5min，最后再放入80℃水浴锅中热水浴5min。热水浴期间离心管可能会因为管内的气体受热膨胀而弹开，注意及时盖上，防止水进入离心管。水浴完成后将离心管放入4℃冰箱中保存。PCR扩增PCR标准体系如表2.1表2.1PCR标准体系组分含量模板DNA0.1-2μgTaqDNA聚合酶2.5μL引物各10-100pmolM1.5mmol/L10X扩增缓冲液10μL4种dNTP混合物各200μmol/L双蒸水或三蒸水加入至总体积为100μL总共100μL本次实验按照PCR标准体系配置总体积为50μL的PCR体系。实验中使用的PremixTaqTM包含了TaqDNA聚合酶、MG2+、10X扩增缓冲液、4种dNTP混合物，用Rnase-FreeWater代替双蒸水，所以实验中的PCR体系只含有PremixTaqTM、引物（R+F）、模板DNA、PCR反应体系成分及体积如表2.2所示：表2.2PCR反应成分体系及体积组分含量PremixTaqTM25μLRNase-freewater20μL引物（R+F）1μL+1μL模板3μL总共50μLPCR反应流程：①94℃预变性3min；②94℃变性30s；③56℃退火30s；④72℃延伸45s，②③④循环36次；⑤72℃延伸8min。（3）产物检测用移液枪取4.5μLPCR产物与1.5μLGreen-DNADye染料混合均匀，点入至1.5%琼脂糖凝胶的孔中进行凝胶电泳检测，将0.5×TBE溶液加入电泳槽中作电泳缓冲液电泳20min，电泳结束后在紫外透射仪下观察结果并记录。将扩增成功且目标条带较亮的样品送昆泰锐生物科技有限公司测序。将测序结果利用BioEdit软件进行质量过滤并进行拼接，然后通过BLAST进行对比，找寻匹配度强，得分高的比对结果。2.2.4生理生化实验（1）甲基红实验培养基：蛋白胨5g、葡萄糖5g、K2接种菌后在恒温培养箱中37℃培养2-4天检测试剂：甲基红指示剂原理：肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，分解葡萄糖过程中产生丙酮酸。在进一步分解的过程中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物使培养基PH值下降至pH4.5以下，在这个PH范围内可以使甲基红指示剂变红。（2）柠檬酸盐实验培养基：柠檬酸钠2g、K2HPO指示剂：1%溴百里酚蓝（乙醇溶液）1mL（配制培养基时将指示剂外的药品加热溶解过滤，严格调PH6.8-7.0，再加指示剂）原理：检测柠檬酸盐是否被利用，产气肠杆菌能利用柠檬酸盐作为碳源，产生碱性化合物，使培养基的PH升高，培养基中的溴百里酚蓝变为蓝色。（3）过氧化氢酶实验培养基：牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl5g、水1L、琼脂5g指示剂：3%过氧化氢溶液实验方法：在干净的培养皿中加入适量的3%过氧化氢溶液，用无菌牙签挑取固体培养基中的菌落置于过氧化氢液面下，观察是否有气泡产生。原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和氧气，继而出现气泡。革兰氏阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。（4）甘露醇发酵实验培养基：蛋白胨10g、NaCl5g、甘露醇10g、牛肉膏5g、溴麝香草酚蓝0.024g原理：致病性葡萄球菌多能发酵甘露醇产酸，使培养基由紫色变为黄色方法：将细菌接种于甘露醇发酵管中，37℃培养1-2天。2.3内生菌溶磷活性测定2.3.1实验材料（1）器材高压蒸汽灭菌锅、电子天平、刻度尺、滤纸、勺子、玻璃棒、烧杯（1000ml，100ml）、9cm培养皿、锥形瓶、接种环、酒精灯、恒温培养箱、冰箱、紫外灯超净工作平台、恒温摇床、移液枪、1000ml容量瓶、250ml容量瓶、量筒、离心机、摇床、紫外分光光度计、离心管。（2）试剂葡萄糖、碳酸钙、硫酸铵、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钾、氯化钠、硫酸锰、浓硫酸、钼酸铵、酒石酸锑钾、抗坏血酸、水。（3）培养基无机磷筛选培养基（液体）:葡萄糖10g、碳酸钙5g、5g磷酸钙、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.3g、硫酸亚铁0.3g、氯化钾0.3g、氯化钠0.3g、硫酸锰0.03g、无菌水1L。（4）供试P源ADDINNE.Ref.{7E5537A5-D6D6-4F1A-870D-67200CC253C8}[23]难溶磷酸盐：磷酸三钙（Ca3（PO4）2）、磷酸铁（FePO4）2.3.2实验方法（1）固体培养溶磷能力的测定ADDINNE.Ref.{FC43CC96-DA15-40AC-92D6-B6A35540E2B1}[9,24]将无机磷筛选配培养基（固体）和接种环等在紫外灯超净工作台上紫外表面灭菌15min，用酒精灯火焰灼烧灭菌后的接种环挑取少量分离划线出来的单菌落菌株接种到无机磷筛选培养基（固体）上（以不接种菌株作对照）。28℃恒温培养5天，观察有无溶磷圈生成，并用刻度尺测定菌落直径（d）、溶磷圈直径（D）大小。根据溶磷圈直径与菌落直径的比值（D/d）大小初步确定该菌株溶磷能力的强弱。同时观察菌落的形状、边缘、表面。（2）液体培养基溶磷能力的测定ADDINNE.Ref.{9EDF11B8-185D-4C0B-8A69-6FA67979242A}[23]配制无机磷筛选培养基（液体），基础成分不变的条件下分别以5g的磷酸钙、磷酸铁、磷酸钙和磷酸铁1:1混合物为无机磷源，每个锥形瓶中倒入100ml培养液。同时用锥形瓶配制100ml0.7%的生理盐水。配置完成后加塞，包扎，再用高压蒸汽锅灭菌20min。用无菌牙签挑取分离开的单菌落菌株加入到1mL无菌生理盐水中制备成菌悬液，充分吹打混匀后接种到于100mL筛选培养基（液体），以不接种菌的培养基作为空白对照，每种菌样品每种无机磷源分别设置3组重复试验。在150r/min、28℃的恒温摇床中培养5d。（3）溶磷效果的测定方法：钼锑抗比色法ADDINNE.Ref.{A467E519-A560-4608-9C8F-0C5F222353C6}[25]取1mL培养物转移至无菌的2mL离心管中，以10000r/min的转速离心10min，取上清液100微升，加入5mL钼锑抗显色液，定容至50mL，反应30min，测OD700值。（4）溶液配制①磷标准储存液：0.2197+0.001g于110℃干燥2h在干燥器放凉的磷酸二氢钾（KH2PO4），用水溶解后移至1000ml容量瓶中，加5ml硫酸（1+1），用水稀释至刻度线。（1mL此标准液含有50.0毫克磷）②磷标准使用液（现用现配）：10.0ml的磷标准储存液移至250ml容量瓶中，用水稀释至刻度线。（1ml此标准液含有2.0毫克磷）③钼锑抗显色剂：20g钼酸铵溶于300ml水配制5g/L的酒石酸锑钾溶液180.6ml浓硫酸溶解于400ml水将稀释的浓硫酸加入钼酸铵溶液，再加入100ml酒石酸锑钾溶液，最终定容至1L。取100mL钼锑抗混合液加入1.5g左旋抗坏血酸溶解，即为钼锑抗显色剂（现用现配）（5）标准曲线的绘制分别取磷标准储存液1.00ml、3.00ml、5.00ml于3个50毫升离心管中，加入5ml钼锑抗显色剂，加水定容至50ml。

第三章结果与讨论3.1溶磷内生细菌的鉴定3.1.116SrRNA基因扩增将通过PCR扩增出来的产物与Green-DNADye混合，点入至1.5%琼脂糖凝胶中进行凝胶电泳检测，部分扩增的结果如图3.1，图中最左边位置条带为DNAMarker，扩增条带大部分都处于1500bp左右。图3.1部分电泳结果PCR过程是整个实验的关键步骤，此次实验所用体系是经过多次实验的对比后确定下来的最适体系，可以得到更好的实验结果。实验中，为了保证Taq酶的活性，实验步骤全部是在冰面进行的；为了确保细菌全部裂解DNA，裂解过程经历了巨大温差，即热水浴后冷水浴再热水浴，也就是通过大的温差变化来增强其裂解程度。3.1.2测序以及序列比对将PCR扩增结果送至公司测序，将测序过的序列使用BIOEDIT正向、反向序列拼接，并通过BLAST进行对比，找寻匹配度强，得分高的比对结果。部分序列和对比示意图如图，图3.3为16SrDNA部分基因序列图谱，图3.4为BLAST对比示意图。图3.316SrDNA部分基因序列图谱图3.4为BLAST对比示意图3.2溶磷内生细菌的溶磷能力3.2.1实验结果（1）分子生物学鉴定编号拉丁文名中文名属1Brevundimonasnasdae短波单胞菌短波单胞菌属2Acinetobacterlwoffii鲁氏不动杆菌不动杆菌属3Bacillusaryabhttai阿氏芽胞杆菌芽孢杆菌属4Pseudomonasazotoformans偶氮假单胞菌假单胞菌属5Pseudomonasfluorescens荧光假单胞菌假单胞菌属6Pseudomonasmarginalis边缘假单胞菌假单胞菌属7Paenibacillusmucilaginosus胶质类芽孢杆菌类芽孢杆菌属（2）溶磷能力检测①通过对单菌落的观察和测量，统计结果如表3.1表3.1单菌落观察统计结果编号形状边缘表面数值（cm）比值（D/d）1不规则不规则不光滑菌落（d）1.801.19溶磷圈（D）2.152圆形整齐光滑菌落（d）1.201.58溶磷圈（D）1.903不规则不规则不光滑菌落（d）1.701.24溶磷圈（D）2.104圆形整齐光滑菌落（d）0.801.63溶磷圈（D）1.305圆形整齐光滑菌落（d）0.751.67溶磷圈（D）1.256不规则整齐光滑菌落（d）0.901.78溶磷圈（D）1.607不规则整齐光滑菌落（d）1.301.00溶磷圈（D）1.30②样品紫外分光光度计测量（OD700）结果如表3.2表3.2各溶磷内生细菌OD700测量值编号磷酸钙磷酸铁Fe+Ca10.0070.0070.0080.0080.0070.0150.0080.0090.01220.0110.0230.0150.0280.0100.0110.0160.0290.01530.0070.0180.0070.0120.0070.0070.0070.0100.00940.0270.0110.0080.0300.0260.0220.0090.0080.00950.0110.0230.0150.0120.0130.0430.0170.0120.01360.0150.0100.0110.0090.0080.0070.0110.070.00870.0090.0080.0110.0130.0110.0070.0070.0100.011空白0.0060.0090.0090.0070.0060.0740.0080.0070.007③标准磷使用液紫外分光光度计测量（OD700）结果如表3.3表3.3标准磷使用液OD700测量值磷标准使用液（mL）0135磷浓度（μg/mL）00.040.120.20OD70000.0260.0690.102注：1.00毫升标准磷使用液含有2.0微克磷，定容为50毫升④根据测量得到的标准磷使用液的OD700值绘制磷浓度标准曲线如图3.1图3.1磷含量标准曲线（注：理论上标准曲线应该为经过坐标原点的正比例函数曲线，实验中存在误差所以导致曲线并没有经过坐标原点）⑤根据标准磷浓度曲线和测量得到的溶磷内生细菌OD700的值计算各样本菌的溶磷量如表3.4（单位：（mg/L））表3.4各溶磷内生细菌的溶磷量编号磷酸钙①②③平均磷酸铁①②③平均（Fe+Ca)①②③平均13.53.543.743.57.55.044.564.82511.557.21455.58.2814.57.510.033.593.55.363.53.54.33.554.54.3413.55.547.7151311134.544.54.355.511.57.58.266.521.511.38.566.57.067.555.56.04.543.54.05.53.544.374.545.54.76.55.53.55.23.555.54.7空白34.54.54.03.533.53.343.53.53.7（3）生理生化实验表3.5生理生化实验结果编号甲基红实验柠檬酸盐实验过氧化氢实验甘露醇实验1××√×2√×√×3××√√4√×√√×5××√√×6√×√×7√×√×3.2.2实验分析根据7株菌的16SrRNA的测序结果BLAST后得到的菌名，与实验之前已知的菌名存在部分不同的现象，可能是菌株在保存的过程中受到污染所致。本次实验鉴定出的菌株为1号：短波单胞菌（Brevundimonasnasdae）、2号：鲁氏不动杆菌（Acinetobacterlwoffii）、3号：阿氏芽胞杆菌（Bacillusaryabhttai）、4号：偶氮假单胞菌（Pseudomonasazotoformans）、5号：荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）、6号：边缘假单胞菌（Pseudomonasmarginalis）、7号：胶质类芽孢杆菌（Paenibacillusmucilaginosus）通过图表3.1可以直观地看出溶磷圈（D）和菌落（d）两者的比值大小关系，其中的2、4、5、6号溶磷内生细菌在溶磷方面的效果更明显。另外3株溶磷内生细菌虽然有溶磷能力，但是作用效果并不是非常显著。同时，经过定量的对溶磷内生细菌的溶磷量进行测定后，也可以证实2、4、5、6号内生菌的溶磷效果更好，分别为鲁氏不动杆菌（Acinetobacterlwoffii）、偶氮假单胞菌（Pseudomonasazotoformans）、荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）和边缘假单胞菌（Pseudomonasmarginalis）。对于不同的难溶磷酸盐，内生溶磷细菌的溶磷表现有差别，但是大部分差别不是很大，差别较大的是4号：偶氮假单胞菌（Pseudomonasazotoformans）和5号：荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens），两种内生菌对磷酸铁的溶解量明显大于对磷酸钙的溶解量。对于磷酸铁磷酸钙混合作为磷源的情况下，除了2号：鲁氏不动杆菌（Acinetobacterlwoffii）外均无太大变化，2号内生菌在磷酸铁和磷酸钙混合条件下的溶磷能力更强，但是具体的原因还需要后续实验加以探究。3.4本次实验不足之处（1）本次实验用的溶磷内生细菌已经在4℃的冰箱中保存了一段时间，可能会导致部分菌被污染，部分菌由于保存不当丢失或者没有活化成功以及不排除存在无法培养的溶磷内生细菌的情况，所以本次实验所用到的菌不能代表天蓝苜蓿和黄鹌菜两种植物根系的所有溶磷内生细菌。（2）由于时间和条件等原因并未对溶磷内生细菌的最佳溶磷条件进行深入研究，主要可以从培养基初始pH、温度、摇床的转速、接种量等方面探究溶磷菌的最适条件。通过查资料可以大概了解到培养基初始pH值对培养基中的水溶性磷影响较大，在pH值7～8的条件下溶磷效果较好，在摇床转速为120～160r/min的情况下，培养基中溶磷量较高。（3）接种溶磷内生细菌的时候没有严格配制菌悬液，只是用无菌牙签或者枪头挑取单菌落，所以在溶磷内生细菌的接种量上可能存在较大差别，实验结果只能反映出不同溶磷内生细菌溶磷能力，不能作为准确的溶磷量。（4）实验过程中为了辅助鉴定溶磷内生细菌，进行了一些生理生化实验，但由于时间等原因也只是做了一部分。更多的生理生化实验可以使对判断溶磷内生细菌的菌种更准确。（5）实验过程中由于样本较多，实验时间有限，只能用了一个温控较差的摇床，对温度控制的范围过大，对实验结果可能会产生较大影象

第四章结论与展望4.1结论（1）菌种鉴定结果如下表编号拉丁文名中文名1Brevundimonasnasdae短波单胞菌2Acinetobacterlwoffii鲁氏不动杆菌3Bacillusaryabhttai阿氏芽胞杆菌4Pseudomonasazotoformans偶氮假单胞菌5Pseudomonasfluorescens荧光假单胞菌6Pseudomonasmarginalis边缘假单胞菌7Paenibacillusmucilaginosus胶质类芽孢杆菌（2）内生溶磷菌溶磷能力以磷酸钙为磷源时，2号：鲁氏不动杆菌（Acinetobacterlwoffii）、4号：偶氮假单胞菌（Pseudomonasazotoformans）、5号：荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）、6号：边缘假单胞菌（Pseudomonasmarginalis）四株内生菌的溶磷能力更强，其中有3株为假单胞菌；以磷酸铁为磷源时，2号：鲁氏不动杆菌（Acinetobacterlwoffii）、4号：偶氮假单胞菌（Pseudomonasazotoformans）、5号：荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）三株内生菌的溶磷能力更强；以磷酸铁和磷酸钙混合作为磷源时，2号：鲁氏不动杆菌（Acinetobacterlwoffii）表现出更加强大溶磷能力。实验中的7株溶磷内生细菌，表现出来的溶磷能力有一定的差距，其中溶磷能力较强的是2号：鲁氏不动杆菌（Acinetobacterlwoffii）、4号：偶氮假单胞菌（Pseudomonasazotoformans）、5号：荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）。4.2前景展望因为实验和经费有限，实验步骤还有很多不够完善的地方：（1）实验中没有再次采样，用到的内生菌样本是之前实验提取出来的，其中有部分失活或者存在污染等问题；（2）没有用高通量测序方法研究植物样本的根际、叶际以及内生的细菌群落多样性和结构进行研究；（3）实验的完整性不足，只是对内生溶磷菌的初步探究，它们溶磷能力和溶磷量还需要进一步探索。（4）溶磷只是内生菌的一个方面的功能，还有分泌IAA（生长激素）等许多对植物体非常有益的作用，需要从多个方面继续挖掘菌种的优秀功能。（5）内生固氮菌相比于豆科植物根瘤菌固氮，更具有应用价值，因为内生菌的寄主范围广，这些内生固氮菌与宿主植物互利共生，不仅可以提高宿主对氮元素的吸收和利用，还可以通过调节其他微量生长因子来促进植物的生长和发育，提高植物的抗逆性和抗病性，提高植物的适应性。内生固氮菌的这些功能，可以应用于农业中提高农作物的成活率和促进生长，应用于环