人工细胞工厂设计构建 课件 第2章 代谢途径设计

代谢途径设计2.1概述2.2基于约束的代谢途径设计

2.3基于图论的代谢途径设计2.4逆生物合成代谢途径设计2.5代谢途径筛选原则与综合评价代谢途径设计2.1概述概述代谢途径设计2.1.1代谢途径设计的基本流程2.1.2代谢途径设计依赖的数据库代谢途径设计的基本流程概述代谢途径设计基本流程代谢途径设计依赖的数据库概述各种数据库提供了丰富的生化数据和信息资源酶与反应信息数据库代谢网络模型数据库生化反应与代谢数据库化合物数据库BRENDA、UniProt、ATLAS、ATLASx、ENZYME、eQuilibrator、dGPredictor、GotEnzymes、SABIO-RK、ExplorEnzBiGG、ModelSEED、BioModels、HumanMetabolicAtlas(HMA)KEGG、MetaCyc、Rhea、Reactome、BioCyc、MetaNetX、MetRxn、BKM-reactPubChem、ChEBI、CASCommonChemistry、CAMEOChemicals、HMDB、RxnFinder2.2基于约束的代谢途径设计基于约束的代谢途径设计代谢途径设计2.2.1基于约束的代谢途径设计原理2.2.2基于约束的代谢途径设计方法基于约束的代谢途径设计原理基于约束的代谢途径设计原理：将代谢网络表示为化学计量矩阵，基于代谢网络的计量学平衡，通过使用线性

规划的方式搜索解空间，计算满足特定约束条件下的物质、能量、还原力平衡

的最优代谢途径。方法：通量平衡分析(fluxbalanceanalysis，FBA)

以代谢网络计量矩阵和反应通量上下限作为约束，以生长或产物生成速率为优化目标，搜索满足物质、能量、还原力平衡的最优代谢途径。

基于约束的代谢途径设计原理基于约束的代谢途径设计FBA算法的组成基于约束的代谢途径设计方法基于约束的代谢途径设计基于特定底盘的途径设计和基于数据库的途径设计名称数据库/底盘途径筛选原则基于底盘的途径设计MapMaker/PathTracer底盘途径长度，元素转移OptMDFpathway底盘热力学，产物得率ECM底盘热力学，酶动力学CAVE底盘产物得率，途径长度OptStrain底盘、KEGG，产物得率，非天然反应数量，生长速率基于数据库的途径设计optStoicMetRxn途径长度，热力学，总代谢通量，化学计量BNICEKEGG、ATLAS途径长度，热力学，SimphenyBIGG途径长度，热力学，产物得率，已知代谢物/酶数量CFPBIGG途径长度comb-FBAMetaCyc、ATLAS产物得率，途径长度基于约束的代谢途径设计方法基于约束的代谢途径设计基于特定底盘的内源产品途径设计确定目标产品基因组尺度网络模型的选择途径的模拟设计与分析基于大肠杆菌基因组尺度网络模型iJO1366模拟设计P3HB最优代谢途径基于约束的代谢途径设计方法基于约束的代谢途径设计基于特定底盘的内源产品途径设计在线设计工具——CAVE整合质控途径设计途径可视化基于约束的代谢途径设计方法基于约束的代谢途径设计基于特定底盘的异源产品途径设计确定目标产品基因组尺度网络模型的选择计算结果分析及可视化在线设计工具——WPHP底物和目标产品的输入查询输入模块计算结果总结计算途径总结途径的可视化基于约束的代谢途径设计方法基于约束的代谢途径设计基于数据库的代谢途径设计

基于数据库的代谢途径设计是从包含多物种反应的数据库中搜索产品的代谢途径，搜索空间更大，更容易获得产品的新代谢途径。主要设计原则是通过元素平衡、电荷平衡、热力学可行性等约束识别最佳的整体化学计量，通过网络化学计量、反应方向性、交换反应通量等约束最小化反应数目或总代谢通量，以满足第一步得到的最佳的整体化学计量。基于约束的代谢途径设计方法基于约束的代谢途径设计基于数据库的代谢途径设计工具设计工具数据库途径筛选原则optStoicMetRxn途径长度，热力学，总代谢通量，化学计量BNICEKEGG、ATLAS途径长度，热力学，SimphenyBIGG途径长度，热力学，产物得率，已知代谢物/酶数量CFPBIGG途径长度comb-FBAMetaCyc、ATLAS产物得率，途径长度PathPredKEGG、RPAIR途径长度，化合物相似性novoPathFinderKEGG、ChEBI、BIGG、Rhea途径长度，热力学，产物得率SimIndex/SimZymeModelSEED、BRENDA化合物相似性，途径长度基于约束的代谢途径设计方法基于约束的代谢途径设计基于数据库的代谢途径设计基于不同方法的甲醇同化途径预测结果新的乙醛酸同化途径（glycolaldehydeassimilation,GAA）途径2.3基于图论的代谢途径设计基于图论的代谢途径设计代谢途径设计2.3.1基于图论方法进行代谢途径设计的原理2.3.2基于图论的代谢途径设计方法基于图论的代谢途径设计基于图论方法进行途径设计的原理基于图论的拓扑学方法进行代谢途径的设计，通过将代谢网络表示为图，节点和边表示代谢物或反应，利用相关算法预测底物到产物的所有可行途径。优势：便于对代谢网络的全局结构特征进行分析更快地搜索两个代谢物间转化的最短途径计算量显著降低基于图论的代谢途径设计基于图论的代谢途径设计的方法设计工具数据库搜索算法网络表示方法流通代谢物处理方式途径排序原则FMMKEGGBreadth-firstsearch复合图移除途径图数量-KEGGDFS二分图代谢网络加权途径权值PHTKEGGBFSwithHOHL复合图结构相似性结构相似度与途径长度ReTraceKEGGHeuristicsearch二分图原子映射原子守恒和途径长度-KEGGJimenez'sk-shortestpaths二分图组合方法Wilcoxon配对符号秩检验与途径长度PATHcre8KEGGYen'slooplessk-shortestpathwithA*heuristic二分图移除热力学，化合物毒性，产物消耗，酶拷贝数LPATKEGGBPAT-M二分图组合方法原子守恒和途径长度MREKEGGYen'slooplessk-shortestpath复合图组合方法热力学和宿主的基因AGPathFinderKEGGCAGTG复合图组合方法反应热力学和化合物相似性BPFinderKEGGBPFinder复合图组合方法化合物相似性，热力学可行性和保守原子团基于图论的代谢途径设计依据对流动代谢物的处理方式不同，分为5类：1.流通代谢物移除2.代谢网络加权3.代谢物结构相似性4.原子映射5.组合方法基于图论的代谢途径设计的方法基于图论的代谢途径设计的方法流通代谢物移除流通代谢物最常用的处理方法是直接从网络中去除，但该方法导致流通代谢物作为主代谢物参与的途径也一并被去除。因此，流通代谢物不能被简单地定义并从网络中排除，而是由其在具体反应中的功能决定的。流通代谢物可按照在反应中的功能成对去除，如用于转移氨基的α-酮戊二酸和谷氨酸代谢物对，转氢的NADH和NAD代谢物对，以及转移磷酸基团的ATP和ADP代谢物对。这些代谢物对在反应中的功能只是将一些基团转移而并不参与反应中主代谢物的碳骨架转化，因此可以被成对去除。基于图论的代谢途径设计的方法流通代谢物移除PATHcre8工具，可根据KEGG数据库中代谢物参与反应的数目筛选出43个流通代谢物，之后再将代谢网络转化为代谢物图时直接去除这些流通代谢物以减少无意义的连接。虽然通过这种方式可以一定程度上减少无生物学意义途径的产生，但是该方法还存在无法识别主次代谢物的局限PATHcre8预测的苯丙氨酸合成白藜芦醇的最优途径基于图论的代谢途径设计代谢网络加权为了避免预先定义流通代谢物，可用代谢网络的加权进行处理。将代谢网络表示为一个加权图，对每个代谢物分配一个权重参数，其值为代谢物在网络中参与的反应数目。通过搜索算法，找到权重最小的一条或多条途径。目前报道了两套用于比较的数据集，一套为KEGG数据库和aMAZE中的已知56条途径，另一套为EcoCyc数据库和大肠杆菌中的已知92条途径。利用这两套数据集和搜索算法，与原网络和移除流通代谢物的网络比较，加权网络的途径设计准确性最高。但加权代谢网络设计的局限性是流通代谢物仍会出现在部分途径中，有些中心代谢物（如丙酮酸）也会被分配较高权重。因此，加权代谢网络设计只能部分解决流通代谢物的问题。基于图论的代谢途径设计借助代谢物结构信息的策略，也可避免预先定义流通代谢物。如PHT（pathwayhuntertool，PTH），使用来自CDK（chemistrydevelopmentkit，CDK）的指纹算法，将二维的化学结构信息转换为一维的二进制流，通过指纹进行快速的代谢物结构相似性搜索。同时，通过代谢物的原子量和Tanimoto算法得到归一化评分函数，计算两个分子之间的相似性，从而避免途径中假阳性连接，使设计结果更具生物学意义。由于不是所有代谢物都有结构信息，因此该方法设计会丢失部分合成途径，但整体设计结果的准确性比流通代谢物移除、加权代谢网络有很大的提升。代谢物结构相似性基于图论的代谢途径设计依据代谢物的结构信息，基于KEGG数据库反应数据，搭建了反应物对数据库RPAIR，用于描述底物到产物之间的原子转移。使用分子对齐的化学结构比较方法，提取得到9125个反应物对信息，并将其分为5种类型，分别描述底物、氧化还原酶辅因子、转移酶的转移基团、连接酶的三磷酸核苷、分解酶和水解酶等酶的无机化合物的变化。根据此数据库，开发途径设计方法就能在很大程度上避免无生物学意义的连接。代谢物结构相似性基于图论的代谢途径设计ReTrace是第一个利用原子映射信息查找分支途径的工具，该工具基于Arita的ARM方法原则，即认为一个有生物学意义的途径应该至少将一个原子从底物转移到产物中。ReTrace在Arita方法基础上进行了改进，通过确保底物到产物之间原子转移数量最大，来发现两者之间的最短合成途径，并将这些最短途径进行组合以发现分支途径和高得分途径。原子映射原子映射示例基于图论的代谢途径设计相较于单一的处理方法，组合方法在途径设计中更受欢迎且效果更佳。Faust等在Croes的代谢网络加权方法基础上进行了改进，通过结合加权网络和RPAIR数据库中包含的KEGG反应中反应对的注释，实现了更为精准的预测：MRE方法通过加权的方式构建宿主依赖的代谢网络，并将此概率的对数值作为权重赋予到代谢物图的边上，从而在进行途径设计时可以区分内源和外源反应。AGPathFinder方法，通过原子团的映射数据进行途径搜索，并引入反应热力学信息和代谢物结构信息作为约束，使得计算所得途径更具生物学意义。Tervo等尝试将图论方法与约束方法结合，提出了MapMaker和PathTracer方法。其中MapMaker用于确定碳转移，方便结果分析；PathTracer用于途径设计，可以找到两个代谢物间最短最可行的途径。组合方法2.4逆生物合成代谢途径设计逆生物合成代谢途径设计代谢途径设计2.4.1逆生物合成代谢途径设计的原理2.4.2逆生物合成代谢途径设计的方法逆生物合成代谢途径设计的原理逆生物合成代谢途径设计原理：逆合成代谢途径设计是从目标分子结构出发，采用逆合成算法，设计目标化合物的代谢途径。逆合成算法的核心是利用计算机分析官能团转换、键的切断或酶的作用，将目标化合物转变为简单的化合物，使其与微生物细胞的代谢物、前体相匹配，直到基础化合物（如葡萄糖等）。主要分为途径的预测和途径的筛选两个模块。其核心是利用计算机分析如何“换团”或“断键”并将目标化合物分解成更简单的化合物，将分解的化合物与微生物体内化合物相匹配。逆生物合成代谢途径设计的方法按照不同寻找前体化合物的方法可分为两类：在数据库中检索，这种方法利用已知代谢反应预测反应寻找前体化合物，使用这种方法的工具有DESHARKY和Metabolictinker等；基于反应规则来寻找前体化合物，这种方法可以产生新化合物，预测新反应，如RetroPath、RetroPath2.0和RetroPathRL等。逆生物合成代谢途径设计

生物合成途径相由多个单步反应的组合而成，因此其预测关键在于对某一特定化合物的单步生物合成反应的预测。对于单步生物合成反应的预测，一般认为酶可以催化与底物具有相似化学结构的化合物，因此可借鉴已报道生化反应的转化模式及相应的酶序列来预测与底物具有相似结构化合物发生的新生化反应。

逆生物合成代谢途径设计逆生物合成代谢途径设计的方法在反应数据库中检索与前体化合物相关的反应，提取反应规则。识别目标分子，确定目标分子的类型，是烷烃、单官能团化合物，还是多官能团化合物等。对目标分子进行逆向剖析，根据目标分子的结构特点，对其进行官能团转换或碳架改造。利用提取的反应规则进行反应预测。逆生物合成代谢途径设计逆生物合成代谢途径设计的方法工具反应规则来源反应规则数PathPredKEGGRPAIR1979ReversePathwayEngineering(THERESA)BioPath3516RetroPathMetaCyc3000(d=4)5000(d=14)BNICEKEGG，ATLAS722RetroPath2.0MetaNetX6900(d=2)19000(d=16)PrecursorFinder依靠反应检索280000RetSynthMetaCyc-RetroPathRLRetroRules146000常见逆生物合成代谢途径设计方法逆生物合成代谢途径设计逆生物合成代谢途径设计的方法利用RetroPath2.0实现对目标分子的代谢途径设计需要的输入有三个，分别是Source、Rules、Sink：Source是RetroPath2.0所针对的要被反应规则作用的化合物，即将用作预测反应起点的化合物。在逆合成代谢途径设计中，Source是目标化合物，途径的终点。Rules即反应规则，描述了底物向产物转化时，相关反应的键合模式的变化，模拟了代谢途径中各个酶的作用，因此其应尽可能对系统中可能发生的所有反应进行编码。在逆合成代谢途径设计中，Rules将不断作用于目标化合物与中间代谢物，寻找前体化合物，直至寻找到起始化合物。Sink是系统中事先给定的起始化合物集合，即途径的起点，当逆合成算法寻找到Sink中的代谢物时会停止搜索。在逆合成代谢途径设计中，Sink为代谢途径起点的所有化合物的列表。逆生物合成代谢途径设计逆生物合成代谢途径设计的方法苯乙烯合成途径对苯二甲酸合成途径逆生物合成代谢途径设计逆生物合成代谢途径设计的方法2.5代谢途径筛选原则与综合评价代谢途径筛选原则与综合评价代谢途径设计代谢途径筛选原则与综合评价代谢途径设计（1）化学计量可行性

（5）代谢物毒性（2）热力学可行性

（6）途径长度（3）动力学可行性

（7）酶的可用性（4）目标产品的理论得率（1）化学计量可行性

为了评估化学计量学可行性，每条预测途径都被引入到底盘基因组尺度代谢网络模型中，通过通量平衡分析对目标化合物的合成进行优化计算，用于确定在宿主生物体中可用的共底物或辅因子的途径，也用于排除在宿主体内由于产生不可再利用的副产物等导致的不可行途径。此外，在该过程中还可以计算出底物的理论碳得率，其可作为排序标准。总体化学计量转换(如aA+cC<=>bB+dD)可以抽象出包括代谢物、离子和自由能在内的化学变化的整体元素平衡表。代谢途径设计代谢途径筛选原则与综合评价（2）热力学可行性

为了评估热力学可行性，需要收集或计算代谢途径中反应的热力学数据。吉布斯自由能变化ΔG表示反应的热力学势能变化，决定了酶促反应的方向性和效率，是检测和选择预测途径热力学可行性及评估生物合成途径热力学驱动力的重要手段。代谢途径设计代谢途径筛选原则与综合评价（3）动力学可行性

为了评估途径的动力学可行性，需要建立所设计途径的动力学模型，包括：定义代谢网络，定义运动速率表达式，分配参数值，根据测量值或报告数据定义代谢产物和酶水平的初始浓度，用完整的动力学模型进行仿真并计算通过途径的通量。代谢途径设计代谢途径筛选原则与综合评价（4）目标产品的理论得率

大部分代谢产物，如核苷酸、芳香族氨基酸等，由于其合成途径复杂，涉及副产物及多个前体，很难通过简单观察或手工计算得到其理论得率。此外，在产品合成过程中还涉及能量（如ATP）和还原力的产生和消耗，需要额外消耗底物产生能量和还原力，或通过某种途径消耗掉多余的能量还原力，这使得产物得率的计算更为复杂。因此需要通过构建底盘宿主内源化合物及相关反应对应的化学计量矩阵来建立基因组规模代谢网络模型，并利用FBA算法计算途径在目标底盘宿主中化合物的理论得率，且常以得率最大化为优化目标来选择途径。代谢途径设计代谢途径筛选原则与综合评价（5）