人工细胞工厂设计构建 课件 第3章 代谢途径构建

代谢途径构建3.1游离表达设计与构建3.2染色体整合表达设计与构建3.3调控回路设计与构建代谢途径构建3.1游离表达设计与构建游离表达设计与构建代谢途径构建3.1.1串联表达3.1.2融合表达3.1.3酶复合体表达3.1.4模块表达3.1.5正交表达游离表达设计与构建代谢途径构建概念：将代谢途径编码基因克隆和组装在质粒载体上进行表达，也称为质粒表达。优点：独立表达，代谢强度高，目标产物产量高，构建速度快，表达、调控灵活。缺点：遗传稳定性较低，代谢负担重；需要筛选压、诱导剂，下游分离成本高。游离表达分类：串联表达、融合表达、复合体表达、模块化表达、正交化表达等方式。3.1游离表达设计与构建串联表达：将代谢途径中的多个基因组装在一起的表达模式，在质粒上进行表达，可分为单顺反子和多顺反子表达。单顺反子表达模式：一个启动子驱动一个基因转录，3端下游为一个终止子。多顺反子表达模式：一个启动子驱动多个基因转录，一个终止子以结束转录。每个基因的5端上游非翻译区都必需具备核糖体结合位点。基因ARBST基因ARBS基因BRBS基因CRBST3.1.1串联表达游离表达设计与构建代谢途径构建游离表达设计与构建代谢途径构建一般地，单顺反子表达强度高于多顺反子，而且距离启动子越远，多顺反子中的基因表达有衰减效应。通常是2-3个基因串联，一般不超过5个基因组成多顺反子。原核细胞工厂设计中常用多顺反子表达策略，真核细胞工厂中常用单顺反子表达。3.1.1串联表达游离表达设计与构建代谢途径构建概念：将一个酶与一个融合标签或另一个酶通过连接肽连接起来，翻译后形成融合酶。常见的融合标签：六聚组氨酸（6×His）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、硫氧还蛋白A（TrxA）、N利用基质A（NusA）、二硫键形成蛋白（DsbA）、绿色荧光蛋白（GFP）、泛素、小泛素相关修饰物(SUMO）。3.1.2融合表达融合表达的目的：增加真核生物来源蛋白及难表达蛋白的表达量、可溶性和稳定性，便于分离纯化和功能鉴定等。荧光蛋白则用于表征目标蛋白或酶的细胞定位或表达量。游离表达设计与构建代谢途径构建基于标签肽的融合表达的设计：将标签肽放在对目标酶功能没有影响的N端或C端，标签肽与目标酶之间插入蛋白酶识别和切割位点序列。一般情况下，在亲和层析技术分离纯化融合酶后，使用蛋白酶切除标签肽，进行生化和酶学分析。融合标签表达的缺点：标签分子量大，影响酶的活性。3.1.2融合表达游离表达设计与构建代谢途径构建连接肽融合表达模式：酶ACN酶BNC酶ANC酶BNC酶ANC酶BCN3.1.2融合表达连接肽的作用：本身不具备催化功能，用于构建融合酶体系，除了增加酶的可溶性、稳定性外，还能使融合酶在空间上相互靠近，缩短中间代谢物转运距离，有效提高产物产量、产率和转化率，适合于多酶催化的代谢途径重构。游离表达设计与构建代谢途径构建柔性连接肽：不能形成特定二级结构的连接肽，在融合酶中一般是以无规卷曲的形式存在。通常富含甘氨酸残基，最典型的连接肽是(GGGGS)n(一般n=3-4，n≤6)。增加重复单元的数目，结构域间的距离变化不大，但隔离效果在不同融合蛋白中变化较大，往往需要个性化设计。柔性连接肽的特点：增加蛋白的有效折叠和可溶性，使各催化结构域互不干扰，因此得到最广应用。缺点是(GGGGS)n

具有舒展构象，有可能成为蛋白酶切割位点，导致融合蛋白的不稳定性。连接肽的分类3.1.2融合表达游离表达设计与构建代谢途径构建刚性连接肽：能形成相对稳定的二级结构的连接肽。如(EAAAK)n(一般n=2-5，n≤6)能形成α螺旋，增加重复单元数目，两个结构域之间的距离就越大。刚性连接肽的优点：提供相对稳定、可控的隔离效果，不是舒展构象，能减少了蛋白酶攻击，使得融合蛋白较为稳定。连接肽的分类3.1.2融合表达游离表达设计与构建代谢途径构建连接肽不能影响两个酶的各自的折叠空间结构；连接肽隔离两个酶活性中心的距离足够，不能使两个蛋白活性相互影响甚至受到抑制。过短的连接肽影响蛋白的正确折叠，容易形成无活性的蛋白聚体；过长的连接肽可能缠绕捆绑蛋白结构域，造成活性位点遮蔽，连接肽本身易被酶水解断裂。柔性连接肽适用于无相互作用的两种酶的融合表达，而刚性连接肽常用来固定两端蛋白的间距，保证功能域的完整，同时通过可调整连接肽的长度和组成获得最佳酶活性和稳定性。连接肽选择的基本原则：3.1.2融合表达游离表达设计与构建代谢途径构建对靶蛋白的N端或C端融合蛋白酶TEV的切割识别位点和蛋白降解标签，靶蛋白处于稳定状态。当蛋白酶表达后，蛋白酶识别位点被切割，降解标签裸露，靶蛋白转为不稳定状态，降低了靶蛋白丰度。蛋白水平调控的优点是比转录水平具有更短的响应时间和速度，缺点高ATP消耗。融合表达的其他应用：动态调控目标蛋白丰度。3.1.2融合表达游离表达设计与构建代谢途径构建酶复合体表达：以蛋白支架为骨架，通过蛋白-蛋白相互作用的设计，将分散的代谢途径酶在空间上募集在一起，自组装形成双功能甚至多功能酶复合体。酶复合体表达的优点：底物通道更短，级联催化的代谢效率更高；蛋白支架能特异性地高效结合，可用于两个或多个酶的空间组装；设计简便，通过改变蛋白支架上的结构域数量和位置，调控不同酶在复合体中的的相对比例，达到优化多个酶催化的代谢途径的目的。3.1.3酶复合体表达游离表达设计与构建代谢途径构建蛋白支架：一个非催化亚单位，由具有相互作用的两个及其以上的结构域组成。设计策略：不同结构域之间通过柔性连接肽进行融合表达，则形成蛋白质支架。增加配体数目，可调控两个酶化学计量比例。已报道的支架蛋白有GBD-SH3-PDZ、RIAD-RIDD等。酶A连接肽结构域（配体-连接肽)n酶B(n=1)(n=3)酶A酶B酶A酶B酶A酶A3.1.3酶复合体表达游离表达设计与构建代谢途径构建GBD-SH3-PDZ可用于三酶复合体表达。基于酶催化的反应顺序，酶A与GDB，酶B与SH3，酶C与PDZ配体融合表达。通过融合表达的不同配体与支架上的不同结构域的相互作用，三种酶按照反应顺序被固定在蛋白支架上。调控蛋白支架结构域的数量，优化三种酶的化学计量比，解决三酶表达量不平衡问题。酶A连接肽配体（连接肽-结构域A)x(连接肽-结构域B)y(连接肽-结构域C)z酶B连接肽配体酶C连接肽配体（x=y=z=1）（x=2，y=1，z=3）酶A酶B酶C结构域A结构域B结构域C酶A酶B酶C结构域A结构域B结构域C酶A酶C结构域A结构域C酶C结构域C3.1.3酶复合体表达游离表达设计与构建代谢途径构建RIAD-RIDD由1分子RIAD和二聚化的2分子RIDD组成，利用该支架可实现以2:1的比例进行双酶复合体表达。通过柔性连接肽，将酶A与RIDD，酶B与RIAD融合表达，复合体中酶A/酶B的数量比例为2:1。酶A连接肽-RIDD酶B(连接肽-RIAD)RIAD-连接肽

酶B连接肽-RIAD酶A酶A酶A酶A酶B酶A酶B酶A3.1.3酶复合体表达将酶B的N端C端分别与RIAD融合，则复合体中酶A/酶B的比例为4:1。反之，如果酶A与RIAD融合，酶B与RIDD融合，则可调控酶A/酶B的比例为1:2至1:4。游离表达设计与构建代谢途径构建模块表达：以模块为基本单元进行设计、构建、测试和优化代谢途径。模块表达的优点：(1)即插即用性，模块内部的不同基因可组合和替换，模块之间也可以组合和替换，具有很强的灵活性和可操作性。(2)易于发现代谢途径的瓶颈步骤，使用不同启动子、核糖结合位点等微调控模块内基因表达、使用不同拷贝数质粒协调模块间的表达，避免代谢不适配。(3)便于产品定制生产，是常用策略，特别适用于长途径的设计构建与优化。3.1.4模块表达游离表达设计与构建代谢途径构建代谢途径的模块化是为了代谢分工而划分的。模块化设计的要求：(1)模块是代谢途径中功能单元的集合，模块内部是相互关联的，模块之间的功能是相对独立的。(2)按照通用性原则进行标准化模块设计，使其具有兼容性和互换性，以便模块内部和模块之间的有效组合。(3)每个模块的输入底物或输出产物具有简便快捷的检测和分析方法，可单独表征模块的代谢效率。根据从底物到产物的生化反应，以关键中间代谢物为节点，对代谢途径进行模块划分和表达设计。3.1.4模块表达游离表达设计与构建代谢途径构建假设一条代谢途径由8基因组成，中间代谢物3、6的合成是途径的限制瓶颈，则可划分为三个模块。这三个模块可设计为单顺反子，使用不同启动子和不同的核糖体结合位点进行表达，分别检测分析中间代谢物3、6及终产物，以优化三个模块中每个基因的表达。在不同拷贝数的载体上，共表达三个模块，同时检测从底物到产物的生化代谢途径，协调模块间的表达强度，筛选出最适模块组合，实现整体代谢通量的最大化。底物酶A中间代谢物1酶B中间代谢物2酶C中间代谢物3酶D中间代谢物4酶E中间代谢物5酶F中建代谢物6酶G中间代谢物7酶H产物表达变量设计不同来源的同工基因调整基因表达顺序不同启动子不同RBS不同拷贝数第1模块第2模块第3模块基因ARBS基因BRBS基因CRBST基因DRBS基因ERBS基因FRBST基因GRBS基因HRBST第1模块第2模块第3模块游离表达设计与构建代谢途径构建正交表达：不依赖宿主细胞自身的转录、翻译、生长的表达模式。在大肠杆菌等微生物中，将T7RNA聚合酶基因整合在染色体上，用T7启动子驱动基因表达，与内源RNA聚合酶及其启动子驱动的基因表达形成正交关系，是最简单和常用的正交表达模式。T7RNA聚合酶的组成型表达对宿主有害，将T7启动子与lacO1组合形成受调控的杂合启动子3.1.5正交表达游离表达设计与构建代谢途径构建正交表达是将细胞生长与目标产物合成解偶联，使它们之间的相互作用和干扰最小化。以内源代谢物为节点，可构建正交途径。例1：以IPP和DMAPP为前体，表达橙花基焦磷酸合成酶（NPPS）和柠檬烯合成酶基因，形成正交柠檬烯途径。该途径与内源GPP用于细胞生长形成正交关系正交柠檬烯和橙花醇代谢途径IPP，DMAPPGPPNPP鲨烯葡萄糖细胞生长目标产物代谢途径NPPSGPPS橙花醇柠檬烯合成酶基础代谢途径柠檬烯3.1.5正交表达游离表达设计与构建代谢途径构建例2：以乙酰-CoA和丙二酰-CoA为前体，II型脂肪酸合酶（FAS）途径的代谢物为脂酰-ACP，而I型脂肪酸合酶的代谢物为脂酰-CoA，它们形成正交途径。用于在大肠杆菌和酵母中合成脂肪醇、长链烃、脂肪酸酯。正交脂肪酸途径乙酰-CoA，丙二酰-CoA脂酰-ACP脂肪烃脂酰-CoA脂肪酸葡萄糖细胞生长目标产物代谢途径I型FASII型FAS腊酯合酶醛基脱羧酶还原酶脂肪酸酯基础代谢途径脂肪醇3.1.5正交表达3.2染色体整合表达设计与构建染色体整合表达设计与构建代谢途径构建3.2.1染色体整合技术的原理3.2.2转座技术3.2.3单位点整合表达3.2.4多位点整合表达3.2.5多拷贝整合表达染色体整合表达设计与构建代谢途径构建染色体整合表达：将代谢途径编码基因整合到在染色体的位点上进行表达。优点：遗传稳定性高，不使用筛选压、诱导剂，减轻了细胞工厂的代谢负担，降低了生产成本。缺点：代谢途径基因拷贝数较低，代谢强度较弱，目标产物的产量相对较低。染色体整合表达是酵母等真核细胞工厂的主要表达方式：基于整合机理，可分为随机整合和定点整合；基于染色体的组织结构变化，可分为插入整合和替换整合；基于整合位点的特性，可分为单位点整合和多位点整合；基于整合的拷贝数，可分为单拷贝整合和多拷贝整合。3.2染色体整合表达设计与构建染色体整合表达设计与构建代谢途径构建基于供体DNA的染色体整合机理，可分为位点特异性重组技术、同源重组技术、转座技术。位点特异性重组：在特定位点上切割DNA和重新连接，形成重组DNA分子。同源重组：具有同源臂的两个DNA片段之间发生断裂、交换、修复，引发DNA序列的插入、敲除和组装等重组事件。转座技术：将不同的CRISPR-Cas和转座子或转座酶有效组合起来，构建人工转座元件，可用于代谢途径基因的染色体整合表达。3.2.1染色体整合技术原理染色体整合表达设计与构建代谢途径构建位点特异性重组技术位点特异性重组：在特定位点上切割DNA和重新连接，形成重组DNA分子。3.2.1染色体整合技术原理双组分的Cre-loxP系统：环化重组酶（Cre）特异识别loxP两端的反向重复序列，并在间隔区进行切割，细胞内连接酶负责重组分子的连接。两个loxP位点方向相同时，Cre切断间隔区，使loxP位点之间的DNA片段发生删除方向相反时，发生DNA片段的反转。缺点：Cre切口处残留34bp的loxP序列染色体整合表达设计与构建代谢途径构建Cre的同源蛋白vCre和sCre分别特异性识别vloxP和sloxP也可用于重组。噬菌体来源的重组酶Dre识别32bp的DNA序列rox，包含两个14bp反向回文序列和4bp间隔序列。Dre重组酶不能识别loxP位点，Cre重组酶也不能识别rox位点。同时使用Cre-loxP和Dre-rox，进行多重特异性重组。其他位点特异性重组系统3.2.1染色体整合技术原理染色体整合表达设计与构建代谢途径构建Flp-FRT系统：Flp-FRT系统的重组过程与Cre-loxP相似，不需要辅助因子，稳定性良好，应用广泛。野生型和突变型的Frt之间可同时使用。其他位点特异性重组系统3.2.1染色体整合技术原理噬菌体来源的整合酶：如ΦC31整合酶，能将供体DNA整合在细菌染色体附着位点上。构建含有ΦC31整合酶基因的整合表达载体，整合片段长度达100Kb，主要用于放线菌。染色体整合表达设计与构建代谢途径构建同源重组技术同源重组：具有同源臂的两个DNA片段之间发生断裂、交换、修复，引发DNA序列的插入、敲除和组装等重组事件。离体同源重组技术可用于代谢途径基因表达盒、多个表达盒组装、表达盒与质粒骨架的组装。同源重组能力强的微生物，如酿酒酵母，利用自身DNA修复的多种酶，向细胞内导入多个DNA片段和线性骨架质粒，可在胞内完成多个DNA片段的组装。3.2.1染色体整合技术原理染色体整合表达设计与构建代谢途径构建（1）线性双链DNA末端被核酸外切酶切割，形成粘性末端；（2）退火使相邻DNA片段的末端碱基配对，形成重组双链；（3）在DNA聚合酶催化下，修补单链的空缺；（4）DNA连接酶催化相邻两个碱基的磷酸二酯键连接，形成完整的重组分子。离体同源重组组装的过程3.2.1染色体整合技术原理染色体整合表达设计与构建代谢途径构建（1）染色体DNA断裂出现缺口（2）含有筛选标记基因的供体DNA与染色体同源交换和重组，引发染色体基因的敲除和替换，供体DNA被整合到染色体的同源位点上（3）回收或丢失筛选标记基因后，获得染色体基因敲除的人工细胞工厂多轮迭代，可敲除染色体上的多个基因。染色体基因敲除的基本过程3.2.1染色体整合技术原理染色体整合表达设计与构建代谢途径构建染色体断裂的方式：一种是宿主细胞染色体复制或修复期间形成的断裂切口；一种是设计小向导RNA（sgRNA）序列，通过II型Cas核酸内切酶切割染色体产生切口。断裂效果多，重组效率高修复机制：同源末端连接机制，同源重组效率高；非同源末端修复机制，同源重组效率低；酿酒酵母等真核细胞，自身同源重组能力强，较容易实现染色体基因敲除和整合表解脂酵母是非同源末端连接机制，可通过增加同源臂长度和敲除非同源重组相关基因，提高供体DNA整合和基因敲除的构建效率。。同源重组能力差的原核细胞：通过表达噬菌体来源的相关重组酶、ΦC31整合酶等，促进供体DNA的整合和基因敲除。3.2.1染色体整合技术原理同源重组效率的影响因素：染色体整合表达设计与构建代谢途径构建根据宿主细胞同源重组能力、转化的难易程度，选择线性DNA片段或质粒作为供体DNA常用重叠延伸PCR、离体无缝多片段组装或胞内多片段组装的方法，构建供体DNA：上游同源臂－代谢途径基因－筛选标记－下游同源臂为了丢失或回收筛选标记基因，还需要在其上下游设计重组酶（常用Cre和Flp）的识别和切割位点（loxP和FRT）。该方法的缺点是有重组酶切割后的序列残留，即属于有痕整合。供体ＤＮＡ片段或质粒的制备3.2.1染色体整合技术原理染色体整合表达设计与构建代谢途径构建第一次是单交换，将质粒所有序列都插入整合到染色体上。第二次是双交换，存在两种情况：上游同源臂间的重组会使染色体恢复到野生型；下游同源臂间的重组会消除质粒元件，获得代谢途径基因整合的细胞。3.2.1染色体整合技术原理两次交换过程：染色体整合表达设计与构建代谢途径构建3.2.2转座技术转座子：一类可移动遗传元件，由末端反向重复序列和转座相关基因组成。转座子的构成：较短的插入序列元件只含有末端重复序列和转座基因。较长的复合转座子还携带cas基因、crispr序列、抗性标记基因等。转座子基本结构转座技术：利用转座子的机制进行染色体整合的生物技术。将不同的CRISPR-Cas和转座子或转座酶有效组合起来，构建人工转座元件，可用于代谢途径基因的染色体整合表达。通过gRNA靶向整合位点，由转座酶介导插入整合，增加在代谢途径基因组染色体上的拷贝数。染色体整合表达设计与构建代谢途径构建设计构建gRNA和Cas核酸酶表达载体、转座酶基因表达载体。在代谢途径基因上游和下游分别设计转座子的两个末端同源序列，构建供体载体。如果代谢途径基因不长，利用天然转座子编码CRISPR-Cas的特性，可将转座酶和Cas系统、代谢途径基因集成在一个表达载体上。3.2.2转座技术染色体整合表达设计与构建代谢途径构建转座酶亚基TnsB、TnsC和TniQ形成复合物，相互作用引发转座。gRNA靶向链和非靶向链都能插入，但倾向于靶向链方向整合。3.2.2转座技术优点：可整合30Kb以上的代谢途径基因，适合于长途径的整合表达。缺点：插入位点处发生复制，上游末端序列比预期多6bp。染色体整合表达设计与构建代谢途径构建转座技术是不依赖于同源重组的位点特异性整合。优点：不需选择标记基因，可多轮整合提高拷贝数10个以上;缺点：转座系统或转座体的组分多，设计构建相对复杂；同时由于转座子的移动性，人工细胞工厂的遗传稳定性受限。3.2.2转座技术转座技术与同源重组技术的比较染色体整合表达设计与构建代谢途径构建3.2.3单位点整合表达基于同源重组的单位点插入整合表达过程与基因敲除类似：染色体双链断裂供体DNA与染色体发生同源重组整合筛选标记基因的回收单位点整合表达：将代谢途径基因整合在染色体的一个位点上表达。染色体整合表达设计与构建代谢途径构建是影响染色体整合表达的主要因素，染色体上不同位点的基因表达强度不同，表达差异达数百倍。大肠杆菌中，距离复制原点oriC位点越近，基因表达水平越高，而距离复制终止子越近，基因表达水平越低。真核微生物中，距离自主复制序列越近，基因表达越强，对整合表达也有正效应，而距离着丝粒或端粒，则降低基因表达。整合位点对细胞生长也有影响。3.2.3单位点整合表达整合位点的选择染色体整合表达设计与构建代谢途径构建染色体的热位点或中性位点：染色体整合对细胞工厂的遗传和生长影响要小或无影响，有利于代谢途径基因的高效表达，不能被削弱或沉默。非必需基因、基因间序列、竞争性途径基因、负调控基因、天然整合位点等是候选整合位点。对于原核细胞，基因框内敲除和代谢途径基因整合同步进行，以避免引起整合位点后染色体基因表达的极性效应。3.2.3单位点整合表达整合位点的选择染色体整合表达设计与构建代谢途径构建细胞之间及处细胞周期不完全相同，导致不同整合克隆之间的产物合成能力存在有差异，对整合克隆进行表达检测，筛选出高产的整合表达细胞工厂。同源重组修复机制主要发生在细胞周期的S期，较短的同源臂能实现较高的整合效率。非同源末端连接介导的染色体修复机制，主要发生在细胞周期的G1和G2期，整合的效率较低，需要较长的同源臂。随着整合代谢途径基因的数量和长度增加，整合效率随着下降。整合效率的影响因素3.2.3单位点整合表达染色体整合表达设计与构建代谢途径构建3.2.4多位点整合表达第一种策略是离散不同位点迭代整合表达。在染色体A位点整合后，再在B位点整合，依次将整个代谢途径基因整合在不同位点上。该策略的优点是遗传稳定性较高，缺点是构建细胞工厂的周期长。多位点整合表达：将代谢途径基因整合在染色体的多个位点上，进行表达。多位点整合表达主要有两种策略。染色体整合表达设计与构建代谢途径构建优点：构建细胞工厂的时间短缺点：设计构建CRIPSR-Cas系统复杂，随着整合位点的增加，代谢途径基因的整合效率急剧下降。选择具有低毒性和高切割活性的Cas蛋白有助于提高整合效率。第二种策略是不同位点的多重整合表达。设计多个gRNA序列靶向不同的染色体位点，通过CRISPR-Cas蛋白介导，一次性将整个代谢途径基因整合在多个位点上。3.2.4多位点整合表达染色体整合表达设计与构建代谢途径构建3.2.5多拷贝整合表达多拷贝整合表达：代谢途径基因以多拷贝形式整合在染色体上，通过基因的剂量效应，强化表达。整合策略1：单位点的离散迭代整合或多重整合，多拷贝有限，设计和构建繁琐、耗时费力，整合效率低。整合策略2：多基因序列、重复序列作为整合位点，一步操作多拷贝整合。酿酒酵母等真核细胞：选择分散分布在染色体上的反转座子Ty元件的长末端重复序列和rDNA基因，作为多拷贝整合位点。染色体整合表达设计与构建代谢途径构建酿酒酵母含有大约250个δ位点，其中约200个是独立的或不完整Ty的δ位点。设计靶向δ位点的sgRNA，表达Cas。插入整合20-30kb的代谢途径基因，高达数十拷贝。酿酒酵母的δ位点整合过程：3.2.5多拷贝整合表达染色体整合表达设计与构建代谢途径构建酿酒酵母的rDNA基因高度重复，但rDNA内存在细胞必需基因。在不影响功能的前提下，具有高效重组和稳定的rDNA序列和基因间区作为候选的可整合多位点。酿酒酵母的rDNA位点整合过程：3.2.5多拷贝整合表达染色体整合表达设计与构建代谢途径构建原核细胞中染色体重复序列少，整合位点可选择两端具有反向重复序列的IS元件。应用同源重组技术，进行多拷贝整合表达。设计多个gRNA靶向不同的染色体位点，多拷贝的染色体整合表达。3.2.5多拷贝整合表达3.3调控回路设计与构建调控回路设计与构建代谢途径构建3.3.1代谢途径调控的基本模式3.3.2静态代谢途径调控回路3.3.3动态代谢途径调控回路3.3.4核糖开关调控调控回路设计与构建代谢途径构建3.3.1代谢途径调控的基本模式代谢途径调控回路的组成：调控信号的输入模块、信号传感模块、信号执行与输出模块。调控信号输入模块是向发酵体系直接添加化学诱导剂、使用温度和光等物理工艺条件。信号传感模块通常是转录因子，它与输入的调控信号发生相互作用。信号执行与输出主要发生在基因转录调控和RNA调控等两个基本层次上。代谢途径构建阻遏蛋白与启动子结合，代谢途径基因不转录，处于关闭状态。添加诱导剂后，解除阻遏，代谢途径基因启动转录，处于开启状态。3.3.1代谢途径调控的基本模式转录阻遏蛋白-诱导剂模式调控回路设计与构建代谢途径构建3.3.1代谢途径调控的基本模式转录激活蛋白-诱导剂模式转录因子不结合与启动子，代谢途径基因不转录，处于关闭状态。添加诱导剂后，转录因子促进RNA聚合酶与启动子的结合，代谢途径基因启动转录，处于开启状态。调控回路设计与构建调控回路设计与构建代谢途径构建静态代谢途径：代谢途径置于开启或关闭的某一种状态的静止模式，不依赖于细胞生长及其环境变化而改变代谢的运行状态，如启动子、RBS、gRNA调控。动态代谢调控回路：代谢途径置于开启和关闭的交替模式，随着细胞内外的变化而快速改变代谢的运行状态。根据代谢运行状态，可分为静态代谢途径调控回路和动态代谢途径调控回路。3.3.1代谢途径调控的基本模式调控回路设计与构建代谢途径构建3.3.2静态代谢途径调控回路静态代谢调控有两种方式，一种是组成型表达，另一种是开关。使用组成型启动子是最简单的静态代谢调控模式。静态代谢途径回路开关由转录因子表达盒、诱导启动子组成，调控代谢途径基因的开启或关闭。在无信号输入时，代谢途径基因处于关闭状态。在细胞生长的某一个阶段，输入调控信号，开启目标代谢途径基因转录表达。输入的信号包括化学物质和物理因子，相应地，基于输入信号的类型，可分为化学开关和物理开关。调控回路设计与构建代谢途径构建化学开关：输入IPTG，启动转录3.3.2静态代谢途径调控回路其他化学物质：抗生素及其衍生物，四环素和氧化四环素、红霉素、乳酸链球菌素等。碳源：阿拉伯糖、鼠李糖、红霉糖、半乳糖、甲醇、乙醇、甲烷等。酸碱变化的pH开关。碳源类诱导剂与微生物生长培养基中的葡萄糖之间存在吸收的竞争关系，葡萄糖往往会削弱此类诱导剂的代谢调控效果。调控回路设计与构建代谢途径构建3.3.2静态代谢途径调控回路化学诱导剂通常在细胞生长的对数中期或后期加入到培养基中，其使用浓度与细胞密度、转录因子数量具有一定的正比例关系。化学开关的优点：使用方便，通过流加操作进入发酵罐，诱导效应快，1-2小时内实现表达。缺点：增加了发酵物料成本，如果使用抗生素诱导，还增加了环境保护的成本。化学开关调控回路设计与构建代谢途径构建温度开关：升高温度，开启代谢途径3.3.2静态代谢途径调控回路阻遏蛋白CI857与温度敏感L/R启动子是应用最广泛的温度开关。在30℃下，关闭代谢途径基因转录；而37-42℃下CI857不稳定，失去阻遏功能，从启动子上解离，开启基因表达。优点是容易实施，与现有的发酵罐相适应，无需改造设备。缺点是温控应答时间慢，如果在40℃以上诱导，细胞产生热激效应，蛋白错误折叠和形成含体，不利于细胞生长和产物合成，同时增加能耗和生产成本。调控回路设计与构建代谢途径构建3.3.2静态代谢途径调控回路氧开关：厌氧开启代谢途径氧开关由低氧启动子和转录因子组成，如大肠杆菌nar启动子-FNR转录因子调控回路，好氧条件下关闭基因表达，在厌氧条件下，具有启动代谢途径基因表达的功能。氧控开关的优点是适应现有发酵过程，减少供氧、降低生产成本。适合于厌氧或微氧发酵产品，如乳酸、琥珀酸、丙二醇、丁二醇、丙氨酸等。调控回路设计与构建代谢途径构建(特定波长)光开关：开启代谢途径光开关由光敏转录因子（光受体）和光敏启动子组成。由光敏转录因子VP16-El222【小写字母l，不是大写I】与光敏启动子c120组成的回路中，在450nm蓝光下，转录因子El222结合黄素核苷酸后，吸收蓝光促进光氧电结构域相互作用，形成二聚化功能蛋白，结合到启动子c120上，激活基因表达。优点是响应速度快，1分钟光照即可起效，可逆、容易施加和去除，对系统干扰少。缺点是需要改造现有发酵罐，增加光照设备，高细胞密度限制透光性和均一性，影响光控开关的效应。3.3.2静态代谢途径调控回路调控回路设计与构建代谢途径构建3.3.3动态代谢途径调控回路基于细胞内代谢物水平和发酵环境信号的实时变化，将动态代谢途径调控回路分为代谢物开关和群体响应开关。代谢物开关：依赖于中间代谢物或产物浓度变化对代谢途径进行实时动态调控的回路，由响应代谢物的转录因子、启动子和代谢物组成。代谢物开关的优点：防止中间代谢物积累引起的细胞毒性和反馈抑制，平衡代谢通量分配，减少细胞工厂的碳源和能源的浪费和代谢负担，从而提高目标产物合成效率。调控回路设计与构建代谢途径构建FapR的N端结合fapO形成复合物，阻遏代谢途径基因转录。C端结合又能与丙二酰-CoA结合使复合物解离，解除FapR的阻遏作用。FapR与gap启动子的上游激活序列（uas）结合，激活gap启动子。用FapR上调的gap启动子和下调的T7fapO启动子可设计构建丙二酰-CoA动态双向开关，可调控细胞稳定期的丙二酰-CoA含量。3.3.3动态代谢途径调控回路丙二酰-CoA开关：由转录阻遏蛋白FapR与操纵基因fapO组成。调控回路设计与构建代谢途径构建在该调控模型中，根据不同类型细胞工厂和不同产物，设计不同数量的串联fapO或串联uas，可更加精准地动态调控丙二酰-CoA开关。丙二酰-CoA开关可应用于细胞生长和丙二酰-CoA衍生物合成的平衡调控中。其他代谢物开关：酰基-CoA、乙酰-磷酸、丙酮酸、3-羟基丙酸、1-丁醇、6-磷酸葡糖胺、衣康酸、法尼烯焦磷酸、麦角固醇、对香豆酸、香兰酸、柚皮素、白藜芦醇等代谢物和产物应答的启动子和转录因子，用于构建其动态开关。3.3.3动态代谢途径调控回路调控回路设计与构建代谢途径构建群体感应：根据细胞浓度变化赋予特定细菌生理行为的一种现象。具有群体感应的细菌能合成并释放自诱导物，其浓度与群体浓度是正偶联关系。自诱导物也称为群体感应的信号分子。当自体诱导物浓度达到一定阈值时，与转录因子结合形成复合体，结合到启动子区域，调控特定基因的转录表达，使细菌产生特定行为。已经发现了多种群体感应信号分子，常见是酰基高丝氨酸内酯（AHL），由Esa系统、Las