人工细胞工厂设计构建 课件 第8章 人工枯草芽孢杆菌细胞工厂

人工枯草芽孢杆菌细胞工厂8.1概述8.2常用元件与构建工具8.3蛋白质产品细胞工厂8.4核苷细胞工厂8.5核黄素细胞工厂8.62,3-丁二醇细胞工厂人工枯草芽孢杆菌细胞工厂8.1概述概述8.1.1细胞结构与功能布局8.1.2基因组与遗传特点8.1.3生理与代谢特点8.1.4应用与研究进展人工枯草芽孢杆菌细胞工厂8.1.1细胞结构与功能布局枯草芽孢杆菌细胞形态与大小：菌落形态：

AB细胞呈杆状，长1.5-4.0μm，宽0.5-1.2μm，可产生鞭毛可产生椭圆形或圆形的内生芽孢，直径≤细胞宽度，通常端生在特定条件下，休眠芽孢可重新萌发回复营养细胞状态。污白色或淡黄色菌落，表面粗糙且不透明菌落边缘不规则，易扩张8.1.1细胞结构与功能布局枯草芽孢杆菌细胞膜壁结构：

AB细胞壁厚30-35nm，富有弹性的肽聚糖-磷壁酸网状聚合物构成细胞壁具有很高的新陈代谢或转换速率内侧新生细胞壁壁密度较高，外侧老细胞壁密度较低；细胞壁和细胞膜之间是厚度20-25nm的周质空间8.1.2基因组与遗传特点枯草芽孢杆菌1.基因组特点：

长度4.2Mb,GC含量43.5%4100个蛋白基因（含2852个y基因）,3.65Mb(86.5%)10个操纵子:rRNA(16,23和5S)12个操纵子和8个单基因:88个tRNA(33种)3个其他RNA（10S，4.5S和RnaseP）基因间区514.8M(12.2%)原噬菌体区占9.3%53.8Mb(1.3%)8.1.2基因组与遗传特点枯草芽孢杆菌2.密码子特点：

仅亮氨酸的CUA密码子使用频率偏低（5.6%），没有强烈的密码子偏爱性大部分基因的起始密码子为AUG，起始密码子翻译效率从高到低为AUG,UUG和GUGRBS的强度会影响起始密码子翻译效率的差别程度，存在弱RBS时，AUG的翻译效率约为GUG的7倍，而存在强RBS时，AUG的翻译效率约为GUG的3倍。终止密码子在使用频率上UAA>UGA>UAG。8.1.3生理和代谢特点枯草芽孢杆菌1.生长特点：

生长温度：可在14-50℃生长，其中最适生长温度为28-37℃。兼性厌氧：在添加硝酸盐或丙酮酸的基本盐培养基中通过无氧呼吸或厌氧发酵缓慢生长，最大细胞密度仅为大肠杆菌的10%~33%生长速度：好氧条件下，代时约20分钟（LB）和60分钟（SMM）营养缺陷：枯草芽孢杆菌168是L-色氨酸缺陷型菌株，MM中需添加适量的L-色氨酸才能生长。8.1.3生理和代谢特点枯草芽孢杆菌2.代谢特点：

具有发达的蛋白分泌系统，能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多种消化酶。营养需求简单，可高效利用更为廉价的淀粉、豆饼粉、蛋白粉和酵母粉等粗原料生长和发酵在葡萄糖等碳源充足时易产生溢流代谢产物乙酸、3-羟基丁酮和2,3-丁二醇在营养限制等不利环境条件下，它能及时感受环境变化而停止生长，诱导形成趋化性和感受态，分泌消化酶，吸收外源DNA以及产生抗生素，菌体会分化产生芽孢。可产生枯草杆菌肽、抗霉枯草菌素、丰原素等多种具有生物活性的次级代谢物或抗生素。8.1.3生理和代谢特点枯草芽孢杆菌8.1.4应用与研究进展枯草芽孢杆菌生物安全性良好、繁殖速度快、易于扩大培养，在多个领域有着广泛的应用：

改善土壤微生物体系、降低土壤板结作为微生物肥料或菌剂防治植物病害、促进植物生长作为肠道益生菌用于动物饲料和保健食品，抑制有害细菌而防治肠道菌群失调广泛应用于淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等酶类和药物蛋白的生产研究最为深入和系统模式微生物之一，开发了各种高效的基因表达元件和基因组编辑技术，生产核黄素（维生素B2）、泛酸（维生素B5）、2,3-丁二醇，乙偶姻，异丁醇，γ-聚谷氨酸，N-乙酰葡萄糖胺等各种生物基化学品的一系列高性能人工细胞工厂被陆续开发和创制。8.2常用元件与构建工具常用元件8.2.1常用元件8.2.2常用质粒8.2.3遗传转化方法8.2.4构建工具人工枯草芽孢杆菌细胞工厂8.2.1常用元件-信号肽枯草芽孢杆菌N区：富含赖氨酸和精氨酸等带正电荷的氨基酸，可与细胞膜中带负电荷的磷酸基团及转位酶发生相互作用。H区：富含可形成α-螺旋的疏水性氨基酸残基，但中间部位通常含有破坏螺旋结构的甘氨酸或脯氨酸残基，这样可以形成发卡结构而插入细胞膜中，在蛋白质跨膜转位起始阶段发挥着重要作用。C区：富含丝氨酸等小分子氨基酸，是细胞膜中特定信号肽酶的识别序列。在蛋白质的跨膜运输过程中或运输完成后，信号肽肽酶在C区切割掉信号肽，蛋白质被释放至胞外并正常折叠。

枯草芽孢杆菌具有发达的蛋白质分泌系统，分泌大约300种蛋白质，非常适合于蛋白质的分泌生产。信号肽元件对蛋白质的分泌效率起着决定性作用，也对蛋白质的整体生产效率有着重要的影响。1.信号肽的结构和功能信号肽是一段位于蛋白质N端或C端介导其跨膜运输的氨基酸序列绝大部分为N端信号肽，长度多为15～36个氨基酸残基，包括氨基端区(N区)、疏水区(H区)和羧基端区(C区)枯草芽孢杆菌2.信号肽的分类I类信号肽Sec型:被I型信号肽酶识别和切割，大多数分泌蛋白质的信号肽以及一些定位在壁膜之间，或者前孢子双层膜之间的蛋白;通过Sec途径分泌I类信号肽Tat型:通过Tat途径分泌，通常含有两个连续的精氨酸基序II类信号肽：被II型信号肽酶识别和切割，主要存在于脂蛋白中，含有高度保守的脂质框，其中的cys残基被脂质化修饰并借助该基团锚定在细胞膜外侧III类信号肽：被IV型信号肽酶ComC识别和切割，存在于前菌毛蛋白中，在N区和H区之间切割，成熟的菌毛蛋白带有H区序列IV类信号肽：由特异性的转运细菌素和信息素的ABC运输蛋白切割，存在于细菌素和信息素中，无H区8.2.1常用元件-信号肽枯草芽孢杆菌3.信号肽元件的选择天然信号肽序列能被软件准确预测，其中最具代表性的SignalP可在线预测多个物种的信号肽及切割位点。对于枯草芽孢杆菌，该软件可以精确预测和区分I类和II类信号肽蛋白质自身的氨基酸序列对分泌效果也有重要影响，常用策略是构建具有不同信号肽的目标蛋白质表达库，从中筛选出对目标蛋白质的生产具有显著效果的信号肽。亲缘关系较近物种的异源信号肽元件也可以在枯草芽孢杆菌中用于蛋白的分泌生产。8.2.1常用元件-信号肽枯草芽孢杆菌1.枯草芽孢杆菌σ因子种类和功能

2.

σA型启动子特点与大肠杆菌σ70型启动子一样，均具有-10区（5’-TATAAT-3’）和-35区（5’-TTGACA-3’）两个高度保守序列大约45%的σA型启动子在-10区上游1bp的位置存在5’-TRTG-3’（R=G/A）的中度保守序列，即-16区。大肠杆菌中仅有不到10%的σ70型启动子在同一位置存在更短的5’-TG-3’保守序列，因此通常枯草芽孢杆菌的启动子能在大肠杆菌中高效转录，反之则不行。枯草芽孢杆菌至少有17种σ因子，它们识别具有不同序列特征的启动子σA识别看家基因的启动子，是构建枯草芽孢杆菌细胞工厂所需的主要启动子元件8.2.1常用元件–启动子枯草芽孢杆菌3.启动子的主要来源和分类自身的天然启动子噬菌体早期强启动子亲缘关系较近物种的异源天然启动子人工杂合启动子或人工启动子库这些启动子主要分为组成诱导型和组成型两类，为细胞工厂中基因表达水平的微调提供了各种不同转录强度的元件。8.2.1常用元件–启动子枯草芽孢杆菌4.诱导型启动子类型和特点（1）IPTG诱导启动子：在组成型强启动子下游加入大肠杆菌的lacO序列融合而成需要同时表达来自大肠杆菌的lacI，本底表达水平非常低，且其诱导表达不受葡萄糖代谢阻遏的影响Pspac是最早开发的IPTG诱导启动子，PSPO1+lacO，通常其诱导表达效率在20~100倍之间。Pgrac：PgroE+lacO，其诱导表达效率高达1300倍。PT7lac：T7启动子+lacO，需同时诱导表达T7RNA聚合酶基因，诱导效率超过10000倍。（2）木糖诱导启动子木糖异构酶基因xylA的启动子Pxyl的转录受木糖的诱导，包括其自身的Pxyl以及来自巨大芽孢杆菌的Pxyl。0.5%~0.8%的木糖可以充分诱导Pxyl的启动，诱导表达效率通常在100-250倍，且本底表达水平较低有的Pxyl中含有分解代谢响应元件而受到葡萄糖代谢阻遏的影响，无法在含葡萄糖的培养基中诱导8.2.1常用元件–启动子枯草芽孢杆菌（3）蔗糖诱导启动子：枯草芽孢杆菌中sacB和sacPA等蔗糖利用基因的转录受到蔗糖的诱导启动子的下游具有核糖核酸抗终止子序列（RAT(ribonucleicantiterminator，RAT),在有蔗糖的情况下，调控蛋白SacY和SacT

可分别结合在PsacB和PsacP的RAT序列上而产生抗终止子结构，从而让转录正常进行通常在培养基中添加2%的蔗糖可以充分诱导蔗糖启动子，其诱导表达效率通常在40-100倍PsacP对葡萄糖代谢阻遏敏感，而PsacB启动子不受此影响。（4）麦芽糖诱导启动子：麦芽糖利用的相关基因组成glv操纵子，其启动子Pglv在转录过程中受到阻遏蛋白GlvR的负调控，麦芽糖可解除调控而诱导glv操纵子的表达。浓度5%的麦芽糖可以充分诱导Pglv的启动，但其本底表达水平较高，诱导表达效率约为16倍。突变型的Pglv启动子显著降低了葡萄糖代谢阻遏对转录效率的影响，表达强度提高了约60%。8.2.1常用元件–启动子枯草芽孢杆菌（5）群体响应诱导启动子：Psrf启动子控制srf操纵子的转录，是一种在细胞密度较高时启动转录的群体响应启动子Psrf在细胞密度达到0.5-0.6（OD600）时高效启动，但其本底表达水平较高，诱导表达效率约为8倍人工改造的异源群体响应系统：来源于费氏弧菌的群体感应系统的PluxI启动子可在细胞密度达到0.3（OD600）时高效启动，其本底表达水平非常低，诱导表达效率高达200倍。有时候静态调控很难克服细胞生长的瓶颈而实现高效生产，而群体响应诱导启动子可以在细胞生长到一定密度时开始调控基因的表达水平，可以很好的解决上述问题。8.2.1常用元件–启动子（6）应激响应启动子：被

B识别的PgsiB启动子控制常规应激蛋白GsiB的转录，可以在48℃的高温、pH=6的酸性环境及4%的乙醇浓度等应激条件下诱导表达。Pdes启动子可以在25℃的低温诱导条件下启动转录，特别适合于易于在胞内聚集成包涵体的蛋白质的表达生产。枯草芽孢杆菌5.主要的组成型启动子及特点P43启动子：最早开发应用的强启动子，转录胞嘧啶/脱氧胞嘧啶脱氨酶编码基因，同时具有

A和

B的典型识别序列，在细胞生长的对数期和稳定期均有较高的表达强度，是一个天然的双启动子。PamyE启动子：amyE基因（编码1,4-α-葡聚糖水解酶）的启动子，突变型PamyE不受碳代谢阻遏的影响，在对数生长期及稳定期均具有较高转录强度，约为野生型PamyE启动子的5倍、P43启动子的70%。PliaG启动子：控制操纵子liaGFSR的转录，该操纵子是细胞壁膜应激响应系统中的相关基因。PliaG是一种转录水平非常稳定的弱组成型启动子。PlepA启动子：控制lepA操纵子的转录，该操纵子编码核糖体翻译的延伸因子EF4。PlepA是一种较弱的组成型启动子，其转录水平约为PliaG的3-4倍。Pveg启动子：控制veg基因的转录，该基因和孢子的形成相关。强组成型启动子，其转录水平约为PliaG的10-15倍，P43启动子的50%。8.2.1常用元件–启动子枯草芽孢杆菌通常原核微生物中不依赖于ρ因子的终止子具有较好的通用性对于强启动子控制的基因表达模块需要选择转录终止效率很高的终止子以防止通读来源于大肠杆菌的强终止子rrnBT1在枯草芽孢杆菌中也有很高的转录终止效率，可达95%以上来源于T7噬菌体的终止子在大肠杆菌中的转录终止效率达到80%以上，但在枯草芽孢杆菌中的效率只有约60%8.2.1常用元件–终止子枯草芽孢杆菌原核生物的RBS通常均具有高度保守序列GGAGG，枯草芽孢杆菌中的强RBS包含保守序列UAAGGAGG，其和核糖体结合的自由能

G=-99.1kJ.mol-1。核糖体结合能力不是越强越好起始密码子的间隔距离对翻译效率也有很重要的影响，通常间隔7-8bp时翻译效率最高，间隔5bp和4bp时翻译效率分别下降约75%和95%，间隔9或10bp翻译效率下降约20%8.2.1常用元件–RBS8.2.2常用质粒枯草芽孢杆菌1.游离型质粒滚环复制的广宿主质粒pUB110、pC194等，大量的单链DNA而影响质粒的结构稳定性滚环复制的内生质粒pTA1060、pLS11和pBC16等，很少形成单链DNAθ型模式自主复制质粒pSM19035等，低拷贝数，具有很高的结构和分离稳定性，但普遍较大而不易转化人工构建的穿梭质粒

pHB201、pHP13等，具有较高的分离稳定性和结构稳定性，双复制子，在大肠杆菌中拷贝数较高枯草芽孢杆菌2.整合型质粒整合型质粒是一类在枯草芽孢杆菌中不能自主复制，但可以借助质粒和基因组上同源序列之间的重组而整合在基因组特定位点的质粒。含有大肠杆菌识别的复制子一般带有1或2段基因组序列（同源区）有的携带报告基因8.2.2常用质粒枯草芽孢杆菌（1）单交换整合：带有待敲除基因部分序列（不含启动子的5’端序列或中部序列）的整合型质粒通过单交换方式插入基因组上的目的基因中而破坏其功能。用来构建目的基因的缺陷株，通过缺陷株的表型变化来研究目的基因的功能。如果整合型质粒中有完整的表达模块，则该表达模块也可以通过这种方式随着整个质粒全部整合入基因组进行表达。单交换整合方式的稳定性不如双交换整合，整合型质粒有可能通过同源重组而弹出基因组。（2）基因的双交换敲除和异位整合表达：利用双交换整合把目的基因或表达模块整合在基因组上的“中立”或非必需位点上表达，同时破坏基因组上的整合位点处的基因。8.2.2常用质粒枯草芽孢杆菌（3）报告基因的融合：利用整合型载体可以很方便地将报告基因整合在染色体上，从而研究目的基因在单拷贝的自然状态下的转录和表达水平。

（4）染色体上DNA序列的串联扩增：含有整合质粒的染色体进行复制时，其中一条子染色体因为偶然发生分子内重组而使整合质粒从该条子染色体上脱落下来，一旦脱落的质粒通过坎贝儿机制整合入另一条子染色体中，就导致了整合型质粒在该染色体上的串联扩增。随着扩增程度的增加，细胞内两条染色体之间在重复序列处的双交换重组也能导致其中一条染色体上重复序列扩增程度增加，而另一条染色体上的重复序列发生丢失。由于整合质粒中的抗性基因一起得到扩增，因此可以提高培养基中的抗生素浓度筛选整合质粒得到串联扩增的子细胞。通过这种方法可以实现目的基因在基因组上的多拷贝串联整合。8.2.2常用质粒枯草芽孢杆菌1.

Spizizen转化法

1958年，美国学者Spizizen发现。自然感受态细胞具备吸附DNA的能力，双链DNA在吸附位点被切割，其中一条DNA链被核酸酶水解，而另一条单链进入细胞中。后者可在胞内被修复为双链分子，之后在RecA依赖的同源重组系统的作用下通过分子内同源重组而环化，或者与基因组发生分子间同源重组而整合入基因组。过程：先将菌株在营养较丰富的培养基中培养，然后转接到营养较为贫瘠的Spizizen基本盐培养基中生长至t0时刻，有一部分细胞可以形成短暂的自然感受态，立即收集细胞和DNA混合后转化，也可以加入15%甘油后-80℃冻藏保存备用。特点：质粒单体的转化效率较低，对于质粒多聚体，通常为103-104个转化子/μgDNA不同菌株的t0时刻可能差别较大，对于生长速率变化较大的突变株，实现高效转化需重新绘制细胞生长曲线以精确确定t0时刻。过表达ComK可大幅度提高感受态细胞的比例8.2.3遗传转化方法枯草芽孢杆菌2.原生质体转化在高渗溶液中加入溶菌酶降解枯草芽孢杆菌的细胞壁以制备原生质体，将DNA和原生质体混合后加入聚乙二醇短暂破坏扰动细胞膜，可使DNA进入细胞，随后将转化后的原生质体涂布于再生培养基生长、筛选目的转化子。效率远高于Spizizen转化法，超螺旋质粒的转化效率高达4*107

个转化子/μgDNA，但线状DNA分子比超螺旋DNA分子的转化效率低2个数量级。3.电转化革兰氏阳性菌有较厚的细胞壁，因此电转化效率远低于大肠杆菌等革兰氏阴性菌株。通常革兰氏阳性菌对高强度电场更敏感，因此使用的较低的电场强度。电转化枯草芽孢杆菌时通常需要加入蔗糖、山梨醇和甘油等渗透压保护剂在优化条件下枯草芽孢杆菌的电转化效率可达106个转化子/μgDNA。通常质粒越大则转化效率越低，大小在10-12kb的质粒的，转化效率约103个转化子/μgDNA。8.2.3遗传转化方法枯草芽孢杆菌反向筛选技术

通过正向筛选标记基因筛选在基因组上特定位点插入DNA片段（含修饰序列、正向筛选标记和反向筛选标记基因）的转化子，随后培养繁殖所筛选的转化子并通过反向筛选标记基因筛选将两种标记基因及多余DNA序列从基因组上弹出的子代细胞，实现对基因组的无痕修饰。

（1）upp基因：编码编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶（UPRTase），催化尿嘧啶生成尿苷单磷酸，5-氟尿嘧啶是嘧啶类似物，可以被UPRTase催化生成胸苷酸合成酶的强烈抑制剂5-F-dUMP，造成枯草芽胞杆菌死亡。（2）mazF基因：大肠杆菌的mazF基因编码一种核酸内切酶，切割mRNA的ACA序列，从而对细胞产生毒性。利用IPTG诱导型启动子Pspac控制mazF的表达，在含有IPTG的培养基中，mazF表达使细胞致死。（3）hewl基因：鸡卵溶菌酶基因hewl对芽胞杆菌属有很好的杀灭效果。它的抑菌作用不仅仅是由溶菌酶效果导致的，还与它的强阳离子性和疏水性有关系。可以使用温敏性启动子PR控制hewl的表达。（4）通过调控型启动子控制正向筛选基因的表达，抑制该启动子转录的负调控基因就变成了反向筛选标记基因。8.2.4构建工具枯草芽孢杆菌位点特异性重组

主要应用于抗性基因的消除，其中Cre/loxP系统和Xer/dif系统都已经被用来开发抗性标记消除系统。Cre/loxP系统包含新霉素抗性基因及左右旁侧有两个同向排列loxP位点的重组盒子（lox71-neo-lox66）。在重组盒子整合在染色体上之后，利用温敏型质粒表达Cre重组酶，在两个同向的loxP位点之间发生重组，从而将标记基因移除。每一次利用位点特异性重组都会在基因组上留下一个loxP疤痕，因此如果对基因组进行多轮的操作，留下的多个识别位点会之间可能会发生重组，降低基因组的稳定性。通常采用突变的lox71和lox66位点，它们分别在loxP位点的左半部分和右半部分有突变。这些突变单独存在并不会影响它们的重组功能，但是lox71和lox66位点发生重组之后形成的lox72位点同时含有左右两部分的突变，与Cre酶亲和力很低，从而提高遗传稳定性。8.2.4构建工具枯草芽孢杆菌λRed重组系统

包含Exo，Beta和Gam三个蛋白质，既可以介导双链DNA（dsDNA）的重组，也可以介导单链DNA（ssDNA）的重组。ssDNA的重组仅需要Beta蛋白的参与，在理想状态下重组效率可以达到约30%。可实现DNA小片段插入、删除和点突变等修饰。利用长度仅为70bp的ssDNA就能实现高效重组，设计靶向滞后链的ssDNA，以及在合成ssDNA时对末端的数个碱基进行硫代修饰可以显著的提高重组率，这些结果与λRed系统在大肠杆菌中的应用结果类似。与大肠杆菌不同的是，λRed系统无法在枯草芽孢杆菌中高效介导dsDNA重组，一个可能的原因是Gam蛋白无法有效的抑制枯草芽胞杆菌的AddAB核酸酶系统。8.2.4构建工具枯草芽孢杆菌CRISPR基因编辑系统(1)单质粒CRISPR-Cas9系统：该系统仅含有1个编辑质粒，包括gRNA表达模块和Cas9表达模块，是第一种在枯草芽孢杆菌中应用的CRISPR系统。代表性的编辑质粒是pJOE8999，含有pUC质粒复制子和温敏型的pE194ts复制子的穿梭质粒，采用枯草芽孢杆菌甘露糖诱导启动子控制Cas9基因的表达，而sgRNA由半人工合成的强启动子PvanABK控制表达。供体DNA片段需要通过PCR制备后插入pJOE8999中。效果：对25kb片段的删除效率达到89%，4kb片段的删除效率约97%，对trpC2突变的回复（插入ATT）效率达到100%。(2)双质粒CRISPR-Cas9：双质粒系统由Cas9表达质粒和gRNA表达质粒组成，在编辑完成后可以消除gRNA表达质粒并在下轮基因修饰中引入新的gRNA表达质粒，因此可以进行快速的循环基因修饰。pHCas9和pAD123组成的双质粒系统中，前者含有Pgrac-cas9表达模块，后者用于表达sgRNA和插入供体DNA片段。效果：对单基因敲除、点突变和基因插入的效率分别达到100%，68%和97%，对于25kb的长片段敲除效率高达80%。8.2.4构建工具枯草芽孢杆菌(3)CRISPR-Cas9n系统：Cas9具有两个核酸结构域RuvC和HNH，分别具有切割双链DNA的模板链和编码链的功能，当失活其中一个结构域后变成只能进行单链切割的Cas9n。Cas9n施加给宿主细胞的生长压力较小，单链切口易于修复而且脱靶几率较小，在多位点编辑中具有一定的优势。在pBSCas9n和pDonor组成的双质粒系统中，前者用于表达Cas9n和gRNA，而后者用于插入供体DNA片段。效果：1-6kb片段的敲除和1-2kb片段的插入效率90%以上，8kb和20kbDNA片段的敲除效率为82%和24%。单、双和三位点的修饰效率分别约100%，90%和50%。(4)CRISPR-Cas12a/Cpf1系统：Cas12a又称为Cpf1，这种Cas蛋白只需要crRNA就可以靶向目标DNA序列，因此设计的gRNA更为简短。它识别靶向区域上游富含T的PAM位点，并在PAM位点的远端切割DNA，形成粘末端。Cas12a可以将多个crRNA串联在一起的阵列切割成crRNA单元，因此在多位点编辑上更为便捷。在pHT-XCR6和pcrF11组成的双质粒系统中，前者用于表达Cas12a和突变的NgAgo，后者用于表达gRNA或crRNA阵列，以及插入供体DNA。效果：单基因插入以及双基因共敲除的效率均达到100%，在6个不同位点进行点突变的共编辑效率也高达100%。8.2.4构建工具8.3蛋白质细胞工厂8.3.1优化表达系统8.3.2优化信号肽8.3.3增加蛋白质转运通道8.3.4

过表达信号肽酶8.3.5协调分子伴侣的表达水平人工枯草芽孢杆菌细胞工厂8.3蛋白质细胞工厂枯草芽孢杆菌8.3.1优化表达系统策略1：非分泌表达的蛋白质产品高强度低本底的诱导启动子翻译强度高的RBS序列稳定的表达载体

策略2：分泌表达的蛋白质产品高强度的组成型启动子利用低拷贝数质粒或在基因组上整合表达避免使用抗生素抗性基因，具有更好的安全性8.3.2优化信号肽建立枯草芽孢杆菌或其近亲菌株的信号肽库，从库中筛选特定蛋白产品的最佳信号肽，是提高异源蛋白质生产水平的重要手段。除了从天然信号肽中筛选之外，在分泌效果较好的信号肽基础上进行饱和突变，筛选分泌性能显著提高的突变信号肽也是一种重要的策略。8.3蛋白质细胞工厂枯草芽孢杆菌8.3.3增加蛋白质转运通道在胞内蛋白高表达的基础上，负责蛋白质跨膜运输的转运蛋白就可能成为分泌表达的限制因素枯草芽孢杆菌主要分泌系统为Sec系统，它包括SecA，SecYEG和SecDF三个组分：其中SecA是一种ATP酶，相当于为Sec系统提供能量的马达，SecYEG和SecDF形成完整的跨膜转运通道。适当提高通道蛋白表达量可以提高分泌效率。例如，在枯草芽孢杆菌中过表达SecYEG可使来源于解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的分泌量增加300%，显著减少了其在胞内的积累量。在高表达枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA的基础上，过表达SecDF可使其分泌表达量提高28%。8.3.4过表达信号肽肽酶在跨膜运输过程中，蛋白质的信号肽被信号肽肽酶切割下来，随后信号肽被进一步分解。如果信号肽没有切割，将会影响蛋白在胞外的正确折叠。因此，在蛋白质表达量很高的情况下，信号肽肽酶表达水平的不足将影响胞外正确折叠的蛋白质产量。8.3蛋白质细胞工厂枯草芽孢杆菌8.3.5协调分子伴侣的表达水平枯草芽孢杆菌中主要有两种类型的胞内分子伴侣，其编码基因构成两个操纵子：dnaK操纵子hrcA–grpE–dnaK–dnaJ–orf35–orf28–orf50

以及groE操纵子groES–groEL。在胞内蛋白质产品过量表达时，进一步过表达这些分子伴侣可以提高分泌效率。

过表达GroE系列伴侣蛋白的使β-甘露聚糖酶的分泌表达量增加了125%，过表达DnaK系列伴侣蛋白使α-淀粉酶AmyL和AmyS的分泌量分别增加了160%和173%。帮助分泌出来的蛋白质正确折叠的胞外分子伴侣，包括PrsA，硫醇-二硫氧化还原酶和前肽等。其中PrsA是一种锚定在外膜上的脂蛋白，可以促进蛋白质在胞外的正确折叠。

在高表达枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA的基础上，过表达PrsA使其分泌表达量提高了49%，SecDF和PrsA的共表达使LipA分泌表达量提高了59%枯草芽孢杆菌含有BdbA、BdbB、BdbC和BdbD等一系列硫醇-二硫氧化还原酶，它们在外膜上具有促进二硫键形成的氧化酶活性，对于含二硫键蛋白质的正确折叠具有重要作用。适当提高这些酶的表达量可以提高含二硫键蛋白质在胞外正确折叠的效率和产量。8.4核苷细胞工厂8.4.1核苷的理化性质及应用8.4.2尿苷生物合成途径8.4.3尿苷细胞工厂设计与构建8.4.4发酵工艺优化人工枯草芽孢杆菌细胞工厂8.4.1核苷的理化性质和应用枯草芽孢杆菌1.理化性质核苷根据碱基的不同可分为嘧啶核苷和嘌呤核苷，核糖分子的碳原子（C1）与嘧啶分子的氮原子（N1）或嘌呤分子的氮原子（N9）形成糖苷键，生成核苷。若是脱氧核糖的碳原子与嘧啶或嘌呤的氮原子形成糖苷键，则称脱氧核糖核苷。常见的核苷包括尿嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、胸腺嘧啶核苷、次黄嘌呤核苷。此外，若核糖或脱氧核糖与稀有碱基缩合则称稀有核苷；若不符合上述成键方式还有其他种类核苷，如假尿嘧啶核苷等等。大多数种类核苷为无色的高熔点结晶，易溶于热水，难溶于冷水，嘧啶核苷比嘌呤核苷更易溶于水，难溶于有机溶剂。其中，腺苷、胞苷呈弱碱性，尿苷呈弱酸性。熔点大多在160-240℃之间。胞（嘧啶核）苷（cytidine）枯草芽孢杆菌2.主要应用：核苷是核酸的主要成分，参与细胞生长代谢、能量存储与转化及信号传导等重要生长环节，是一类细胞内不可或缺的重要生化物质。在食品行业，核苷可作为重要的食品营养剂和食品添加剂。例如肌苷（次黄嘌呤核苷）是第二代食品增鲜剂——呈味核苷酸二钠的主要原料，具有很大的市场需求。在医药领域中，已有肌苷二醛、无环鸟苷及异丙肌苷等众多核苷类药物临床应用于中枢神经、泌尿、代谢和心血管等的疾病的治疗。另外，核苷和核苷酸类药品在抗病毒、抗肿瘤等方面的疗效显著。已研究开发了碘苷、利巴韦林、阿昔洛韦等多种产品。目前已上市的核苷类抗病毒药物占总数的一半以上。2021年全球核苷酸需求量约为5万吨，产品销售额(包含寡核苷酸和单体)约为5亿美元。8.4.1核苷的理化性质和应用8.4.2尿苷生物合成途径枯草芽孢杆菌包括从头合成和补救合成两条途径，补救合成途径需要尿嘧啶作为原料，生产成本较高，相比之下，从头合成途径生产尿苷更加经济可行。嘧啶从头合成的相关基因组成嘧啶操纵子（pyroperon），由一个σA识别的启动子转录，包含了pyrR、pyrP、pyrB、pyrC、pyrAA、pyrAB、pyrK、pyrD、pyrF和pyrE十个基因，共编码八种酶蛋白和一种阻遏蛋白，其中pyrAA和pyrAB分别编码氨甲酰磷酸合成酶的小亚基和大亚基，pyrR编码的阻遏蛋白PyrR调控嘧啶操纵子的转录

。8.4.2尿苷生物合成途径枯草芽孢杆菌8.4.4尿苷细胞工厂的设计和构建枯草芽孢杆菌嘧啶操纵子转录调控的解除及过表达。解除嘧啶合成途径中关键酶受到的反馈抑制。PRPP合成酶、氨甲酰磷酸合成酶强化尿苷酸向尿苷的转化下调前体竞争旁路代谢通量：高丝氨酸脱氢酶基因（hom），argF、argG、argH等减少尿苷降解或阻断尿苷向胞内运输途径8.5核黄素细胞工厂8.5.1核黄素的理化性质及应用8.5.2核黄素合成途径8.5.3核黄素细胞工厂的设计和构建8.5.4发酵工艺优化人工枯草芽孢杆菌细胞工厂8.5.1核黄素的理化性质及应用枯草芽孢杆菌（1）理化性质核黄素(Riboflavin简写为RF)，俗称维生素B2，化学分子式为C17H20O6N4，分子量为376.37g/mol核黄素是一种黄色的天然水溶性维生素，可溶于氯化钠溶液，易溶于低浓度的氢氧化钠溶液，不溶于乙醚、氯仿、苯和丙酮等有机溶剂。在碱性溶液中，核黄素的溶解度较大，但不稳定且容易降解，在酸性溶液中较为稳定。光照和紫外线照射会导致核黄素发生不可逆的分解。核黄素通常磷酸化为黄素单核苷酸FMN，然后进一步腺苷酰化为黄素腺嘌呤二核苷酸FAD，两者是核黄素的活性形式，作为黄素类辅酶辅因子参与多种生化反应枯草芽孢杆菌主要应用在营养方面，核黄素具有促进机体生长发育，增强铁吸收并保持指甲和毛发的正常生长等功能。在医疗方面，核黄素在癌症的辅助治疗中发挥作用，激活免疫系统杀死肿瘤细胞。补充核黄素可增强巨噬细胞的功能，减少由金黄色葡萄球菌感染引起的炎。核黄素也用于饲料添加剂、化妆品以及微生物燃料电池。核黄素主要通过微生物发酵法工业化生产，其产量和需求量逐年平稳增长，目前产量约1.1万吨/年，需求量约1.0万吨/年。

8.5.1核黄素的理化性质及应用枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌中基因ribA编码双功能酶，其3’端编码GTP环水解酶II，5’端编码羟基丁酮磷酸合酶，分别催化前体物鸟嘌呤-5’-三磷酸(GTP)和5-磷酸核酮糖。鸟嘌呤-5’-三磷酸(GTP)在GTP环水解酶II（基因ribA编码）催化下开环水解生成2,5-二氨基-6-核糖氨基-4(3H)-嘧啶酮-5-磷酸（DARPP）DARPP在嘧啶脱氨酶（基因ribD编码）作用下脱去嘧啶环第二位的氨基生成5-氨基-6-核糖氨基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮-5-磷酸（ARPP）。在嘧啶还原酶（基因ribD编码）催化下，消耗NADPH，将ARPP的呋喃核糖基还原开环形成5-氨基-6-核糖醇氨基-2,4(1H，3H)-嘧啶二酮-5-磷酸（ArPP）。ArPP被非特异性磷酸酶催化，水解除去磷酸基团生成5-氨基-6-核糖醇氨基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮（ArP）；5-磷酸核酮糖在羟基丁酮磷酸合酶（基因ribA编码）催化下生成C4单位L-3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸(DHBP)DHBP与Arp在二氧四氢蝶啶合成酶即核黄素合成酶的β亚基（基因ribH编码）作用下，生成6.7-二甲基-8-核糖醇基-2,4—二氧四氢蝶啶(DRL)

两分子的DRL在核黄素合酶α亚基（基因ribE编码）作用下生成核黄素。8.5.2核黄素的合成途径枯草芽孢杆菌8.5.2核黄素的合成途径8.5.3核黄素细胞工厂的设计和构建枯草芽孢杆菌核黄素操纵子改造优化；核黄素下游合成途径的弱化；嘌呤合成途径改造优化；核苷酸转换途径改造优化；糖异生途径改造优化；磷酸戊糖途径改造优化结合经典的诱变选育技术和上述策略可大幅度提高枯草芽孢杆菌的核黄素产量，达到约27g/L，已经应用于核黄素的商业化生产。8.62,3-丁二醇细胞工厂8.6.12,3-丁二醇的理化性质及应用8.6.22,3-丁二醇合成途径8.6.32,3-丁二醇细胞工厂的设计和构建8.6.4发酵工艺优化人工枯草芽孢杆菌细胞工厂8.6.12,3-丁二醇的理化性质及应用枯草芽孢杆菌1.理化性质：又称2,3-双羟基丁烷或二亚甲基二醇。分子式为C4H10O2，CAS号为513-85-9，分子量为90.12。常温下为无色结晶固体或粘稠无色液体，熔点23-27℃，沸点179-182℃，相