人工细胞工厂设计构建 课件 第9章人工嗜盐菌细胞工厂

人工嗜盐菌细胞工厂9.1概述9.2常用元件与构建工具

9.3聚羟基脂肪酸酯细胞工厂人工嗜盐菌细胞工厂9.1概述概述人工嗜盐菌细胞工厂9.1.1细胞结构与功能布局9.1.2基因组与遗传特点9.1.3生理与代谢特点9.1.4应用与进展细胞结构与功能布局盐单胞菌是一种嗜盐菌，其通常是杆状细菌，长度在1-3微米之间，菌落形态为其平板上的菌落形态为光滑而凸起的不透明的圆形菌落。细菌的胞内结构特点是会产生在电镜下呈现明亮的颗粒——PHA颗粒。盐单胞菌的特点人工嗜盐菌细胞工厂基因组与遗传特点遗传特点与密码子表人工嗜盐菌细胞工厂艾丁湖盐单胞菌已经完成了全基因组测序，基因组大小为4.09Mb，其GC含量为52.6%，在盐单胞菌属中，该GC含量属于相对较低的，这对于其后续的编辑是有利的。在密码子的使用情况上，艾丁湖盐单胞菌的密码子相对比较均衡，便于表达各种来源的基因。氨基酸密码子频率（‰）氨基酸密码子频率（‰）氨基酸密码子频率（‰）氨基酸密码子频率（‰）苯丙氨酸UUUUUC18.514.7酪氨酸UAUUAC11.411.1半胱氨酸UGCUGU21.011.2蛋氨酸AUG16.5色氨酸UGG20.2组氨酸CAUCAC15.716.2天冬氨酸GAUGAC15.911.5天冬酰胺AACAAU16.114.4脯氨酸CCGCCACCUCCC15.920.212.813.0谷氨酰胺CAGCAA19.518.0谷氨酸GAAGAG15.111.8赖氨酸AAAAAG18.417.0缬氨酸GUGGUUGUCGUA16.316.011.311.0丙氨酸GCGGCCGCAGCU24.723.821.123.9甘氨酸GGCGGUGGGGGA24.216.312.59.5苏氨酸ACCACGACUACA16.515.711.711.2亮氨酸CUGUUAUUGCUCCUUCUA19.513.618.511.816.111.0丝氨酸AGCUCGAGUUCCUCUUCA23.715.311.59.611.117.3精氨酸CGCCGUCGGCGAAGAAGG25.215.315.814.810.912.8异亮氨酸AUUAUCAUA14.915.811.7终止密码子UAAUGAUAG13.317.611.1生理与代谢特点天然耐盐——开放式发酵人工嗜盐菌细胞工厂艾丁湖盐单胞菌在1%-20%的NaCl浓度下生活，最适的盐浓度为6%。最适的pH为9.0。生长速度快，倍增时间为20-30min。可以开放式发酵，能够天然生产聚羟基脂肪酸酯。应用与进展生产聚羟基脂肪酸酯的细胞工厂人工嗜盐菌细胞工厂使用海水发酵，节省淡水资源；高盐抑制杂菌，可以进行开放式的、无需灭菌的发酵。目前，嗜盐菌底盘的应用集中于PHA领域。在PHA产品以外，也开发了如酸性小分子、胞外多糖、相容性溶质和一些特殊的蛋白质的生产等。9.2常用元件与构建工具9.2.1常用元件表达与调控元件9.2.2构建工具人工嗜盐菌细胞工厂常用的表达与调控元件pSEVA系列质粒人工嗜盐菌细胞工厂在标准欧洲载体结构（TheStandardEuropeanVectorArchitecture，SEVA）中，构建了一系列的穿梭质粒pSEVA系列质粒，其包含多种不同的抗性筛选标记基因、复制子、转移起始位点（oriT）和多克隆位点区等。在其多克隆位点区的上下游，还有一对验证引物，F24和R24，用于质粒构建后的鉴定工作。可通过接合转化的方式进行转化。大肠杆菌常表达启动子与诱导型启动子常用的表达与调控元件嗜盐菌艾丁湖盐单胞菌可以使用类T7诱导型启动子Pmmp1。Pmmp1启动子是来源于摩氏摩根菌噬菌体Mmp1（MorganellamorganiiphageMmp1）。Porin蛋白是一种在中度嗜盐菌中常见的细胞膜孔蛋白，其一般具有较高的表达量。以原始组成型启动子为基础，可设计构建不同强度Pporin启动子库。构建工具同源重组法与CRISPR/Cas9人工嗜盐菌细胞工厂盐单胞菌中的CRISPR/Cas9系统由双质粒组成。通过表达sgRNA序列和Cas9蛋白来对目标序列进行切割，进而实现同源重组介导的插入和删除。9.3聚羟基脂肪酸酯细胞工厂9.3.1理化性质9.3.2PHB细胞工厂9.3.3P(3HB-co-4HB)细胞工厂9.3.4P(3HB-co-3HV)细胞工厂9.3.5其他PHA细胞工厂人工嗜盐菌细胞工厂理化性质及应用PHA的理化性质及应用聚羟基脂肪酸酯细胞工厂聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates,PHA）是一类在过量碳源存在的不利生长条件下，由细菌合成并在胞内积累的微生物聚酯，被用作碳源和能量的储藏物质。

PHA的应用广泛，因为其具有良好的可降解性和生物相容性。PHB细胞工厂PHB细胞工厂的构建与优化在基因水平的操作上，想要提升PHB的产量可以从两方面入手，一是增加PHB的生产路径的通量；二是减少前体物质乙酰辅酶A向其他路径的流动。在发酵罐培养体系中，通常会将发酵分为细菌生长阶段和PHB含量累积阶段。在细菌生长阶段的发酵中，需要供给比较充足的氮源和碳源，一般最为通用的碳源是葡萄糖，使得菌体尽可能的生长。而在PHB含量累积阶段，则是需要限制氮源的供给，提供足够的碳源