人工细胞工厂设计构建 课件 第12章 人工解脂耶氏酵母细胞工厂

人工解脂耶氏酵母细胞工厂12.1概述12.2常用元件与构建工具

12.3油脂细胞工厂12.4β-胡萝卜素细胞工厂12.5小节人工解脂耶氏酵母细胞工厂12.1概述概述人工解脂耶氏酵母细胞工厂12.1.1细胞结构与功能布局12.1.2基因组与遗传特点12.1.3生理与代谢特点12.1.4应用与进展细胞结构与功能布局解脂耶氏酵母解脂耶氏酵母是酵母目子囊菌酵母，天然具有脂肪和蛋白分解能力1942年被发现且并未指出有性生殖，被命名为解脂假丝酵母;1960年，发现了解脂酵母的有性生殖，先后将其重新命名为解脂拟内孢霉和解脂复膜孢酵母，最终定名为解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）。荷兰代尔夫特微生物实验室的DavidYarrow确定了这个属，用其姓进行了拉丁属名（Yarrowia）的命名。目前已被美国食品与药品监督管理局认证为公认安全的微生物。

解脂耶氏酵母是一种二型性真菌，可形成酵母细胞、假菌丝和有隔膜的菌丝。单细胞大小为3~5×5~11μm，长形细胞可达20μm，且成对或者小簇状单独出现。菌丝体由宽为3~5μm，长可达几毫米的有隔膜的菌丝组成。

细胞结构与功能布局解脂耶氏酵母解脂耶氏酵母的一个典型特征是其具有一个较突出的胞内脂质体。脂质体是一种储存中性脂质的细胞器脂质体主要由三酰甘油酯和甾醇酯组成，脂质体的整个结构被嵌入蛋白质的磷脂单层所包裹。作为解脂耶氏酵母储存能量的结构，脂质体可通过三酰甘油酯的脂肪酶和甾醇酯的水解酶将脂肪酸从脂质体中释放出来，从而满足解脂耶氏酵母对碳源和能源供应的需求。通常在不利条件下（氮限制或氧气供应不足等）诱导产生大小为0.65-2.5μm基因组与遗传特点同种微生物不同菌株的基因组间仍存在较多差异基因解脂耶氏酵母常用的解脂耶氏酵母有4个来源，（1）从法国巴黎下水道中分离的W29（MatA）野生型菌株及其衍生菌株（2）从德国莱比锡土壤分离出来的野生型菌株H222（MatA）（3）波兰野生型A101和美国野生型CBS6124-2。解脂耶氏酵母中应用范围较广的参考菌株为CLIB122（MatB），也是最早完成全基因组测序和注释的菌株，该菌株经过W29和CBS6124-2的多次回交获得，且敲除了碱性胞外蛋白酶基因（AEP）。CLIB122基因组大小约为20.5Mb，由6条染色体（A-F）和一条线粒体染色体组成（47.9kb）；基因7144个，预测编码蛋白6472个。基因组与遗传特点CLIB122基因组中包括5967个蛋白编码序列（2945919密码子）解脂耶氏酵母解脂耶氏酵母CLIB122基因组中密码子使用表（‰）编码基因的平均GC含量为53.65%，含内含子基因的比例为15%；在61个有义密码子中，24个密码子的使用频率低于1%，属于稀有密码子；解脂耶氏酵母的密码子偏好性类似于黑曲霉，而不同于酿酒酵母；每个基因的长度大约为3Kb，基因密度约为46.3%，远低于酿酒酵母70.3%的基因密度。基因组与遗传特点解脂耶氏酵母的核糖体RNA（rRNA）组织在2个簇的重复单元中。解脂耶氏酵母每个单元由编码35-45S前体rRNA的转录单元和非转录间隔区（nontranscribedspacer，NTS）组成，间隔区没有5SrRNA的基因；两个单元长度不同，分别为7.7,8.7kb，原因为内部转录间隔区（internaltranscribedspacer，ITS）的长度不同；解脂耶氏酵母rDNA的外部转录区（externaltranscribedspacer，ETS）相当短（约500bp）。呈现出非典型的核糖体DNA单元，有几个rRNA基因簇分散在不同的染色体上。基因组与遗传特点解脂耶氏酵母的细胞核和线粒体特征与其他酵母有很大不同解脂耶氏酵母解脂耶氏酵母的细胞核基因组的浮力密度为1.709g/cm3，熔点Tm为90.5℃。其线粒体基因组的GC含量为24.9%，浮力密度为1.687g/cm3，熔点Tm为79.5℃。电镜观察显示解脂耶氏酵母的线粒体是一个圆形结构，轮廓长度为14.5μm。其线粒体轮廓长度和GC含量与酿酒酵母（25μm,24.5%）和粟酒裂殖酵母（8.5μm,29.6%）相比有很大的不同。生理与代谢特点底物谱较广，能够利用亲水性或疏水性的物质作为碳源。解脂耶氏酵母亲水性碳源包括糖类（如葡萄糖、果糖、甘露糖）、多元醇（甘油、赤藓糖醇）、有机酸等；疏水性碳源主要有烷烃、烯烃、脂肪酸等。解脂耶氏酵母可利用的氮源包括无机氮源（铵盐）和有机氮源（尿素、酵母提取物、蛋白胨等）。其他碳源：能耐受0.4%的乙酸钠，3%乙醇，木糖。解脂耶氏酵母具有16种酰基甘油脂肪酶、12种细胞色素P450单加氧酶（用于烃和脂肪酸氧化）、14种脂肪酸转运蛋白、38种天冬氨酰蛋白酶和15种丝氨酸蛋白酶，由此可通过分泌脂肪酶和酯酶水解脂质，并通过末端β-氧化和ω-氧化途径吸收碳氢化合物和脂肪酸。其体内具有特异性烷烃摄取系统，从而能够通过主动运输系统吸收并利用正烷烃和1-烯烃。碳源来源广泛疏水碳源利用能力强生理与代谢特点解脂耶氏酵母已成为一种重要的底盘微生物，受到广泛关注解脂耶氏酵母1.典型的二型性酵母，其细胞形态可以在酵母型与假菌丝型之间进行转换2.一种严格的好氧菌，克勒勃屈利（Crabtree）阴性，且基本不产乙醇3.具有独特的柠檬酸穿梭途径，使其胞内的前体物质乙酰辅酶A含量较高，适合脂质、萜烯、脂肪酸及其衍生物等化合物的生成4.分解油脂及烷烃类化合物，在修复废油污染等环境方面发挥重要作用5.对不利环境耐受度较高，具有pH耐受范围广、耐高盐、底物利用谱广等优势生理与代谢特点应用与进展被人工设计构建细胞工厂，用于生产各种生物基化学品解脂耶氏酵母20世纪50年代，英国某公司将其应用于生产单细胞蛋白，应用于饲料。20世纪70年代，美国某公司开发解脂耶氏酵母实现柠檬酸的大规模生产。经典案例12.2常用元件与构建工具人工解脂耶氏酵母细胞工厂12.2.1常用元件12.2.2表达载体12.2.3构建工具常用元件解脂耶氏酵母中常用的元件包括启动子、终止子、筛选标记解脂耶氏酵母最早分离鉴定并广泛应用的启动子是PXPR2和PTEF；使用内含子介导的增强（intron-mediatedenhancement，IME）策略，可增强解脂耶氏酵母的启动子强度。PTEFin的表达强度比无内含子的PTEF高17倍，PFBA1in的表达强度比PFBA1高5倍；人工设计上游激活序列(UAS)和核心启动子来生成有强表达活性的杂合启动子，PHP4D。启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列常用元件解脂耶氏酵母终止子通常是基因3’末端（即终止密码子如TAG）下游的一段可以发挥终止其mRNA的转录作用的较短序列，一般含有(富T)、TA(T)GT、(富AT)、TTT和TTTTTATA)特征序列解脂耶氏酵母中常用的元件包括启动子、终止子、筛选标记解脂耶氏酵母中的XPR2和LIP2基因的内源性终止子通常用于异源基因的表达；酿酒酵母中的终止子TCYC1也可在解脂耶氏酵母中发挥作用，这表明了终止子具有跨物种的高度可移性；合成型终止子工程也得到快速发展，合成型终止子通常比天然终止子序列更短（35-70bp）、效果更好。在解脂耶氏酵母中，对终止子的研究远少于启动子。设计新的终止子，在提高转录效率的同时，可减少转录单位与基因组发生同源重组的风险常用元件解脂耶氏酵母中常用的元件包括启动子、终止子、筛选标记解脂耶氏酵母常用营养缺陷标记为氨基酸或核苷酸代谢基因，如Po1系列菌株是亮氨酸（LEU2）或尿嘧啶（URA3）营养缺陷型；对潮霉素B、诺尔丝菌素和博莱霉素等抗生素不耐受，抗生素标签可用于显性标记；一些与碳源分解代谢相关的基因具有不参与基本代谢途径的优势，可用于解脂耶氏酵母筛选标记，如酿酒酵母来源的SUC2基因、参与赤藓糖醇分解代谢的EYK1基因、乙酰胺酶基因（YlAMD1）等。URA-Blaster介导的基因组编辑工具原理：URA-Blaster系统是利用URA3基因编码酶催化5‑氟乳清酸（5-FOA）脱羧，生成对细胞有毒性的5-氟尿嘧啶的原理，使基因组中整合的HisG-URA3-HisG片段发生同源重组，回收URA3筛选标记URA-Blaster：含有URA3基因及两端重复的HisGDNA序列的结构要点：阳性克隆在YPD平板上生长形成菌落而尿嘧啶营养缺陷型基础培养基（SD-Ura）平板上不生长，复筛URA3标记回收筛选标记的回收在菌株改造过程中是至关重要的解脂耶氏酵母常用元件（A）含有ARS/CEN/mtORI的游离载体；（B）ylAC示意图；（C）zeta依赖性整合表达载体。解脂耶氏酵母表达载体解脂耶氏酵母中没有发现天然内源性质粒，因此，将解脂耶氏酵母染色体自主复制序列（ARS）或着丝粒元件（CEN）以及线粒体DNA复制序列（mtORI）分别与质粒连接，构建解脂耶氏酵母中自主复制的游离型质粒，用于异源基因的表达。游离型载体具有操作便捷、转化效率，但是拷贝数低（1-3个质粒/细胞）、丢失率高整合型载体能持续存在和稳定的表达，是解脂耶氏酵母中的首选策略。解脂耶氏酵母常用表达载体构建工具PiggyBac转座系统原理：基于PiggyBac转座酶（最初从粉纹夜蛾中分离出来）设计，该系统将转座酶根据解脂耶氏酵母密码子优化，由高活性的PiggyBac转座酶及其TTAA特异性转座子构成。解脂耶氏酵母当两侧连接PiggyBac的反向末端重复序列（invertedterminalrepeat,ITR）时，PiggyBac转座酶识别两端的ITR序列并在TTAA位点切割，DNA序列（即选择标记或表达盒）可从复制型载体剪切并随机插入到解脂耶氏酵母基因组中。CRISPR-Cas9系统解脂耶氏酵母的CRISPR/Cas系统主要由两种元件组成：Cas9蛋白和相应的sgRNA。通常使用强组成型启动子PTEFin或PHP8D启动Cas9蛋白的表达;使用SV40作为核定位信号置于Cas蛋白的下游，通过连接肽（TCTCGAGCCGAC）与Cas9蛋白融合表达。解脂耶氏酵母构建工具Ⅱ型RNA聚合酶（PolⅡ）启动子以及5个人工设计的III型RNA聚合酶（PolIII）杂交启动子，能启动sgRNA的转录。其中杂交启动子SCR1′-tRNAGly效果最佳，CRISPR/Cas9对基因的编辑效率最高。该系统基于同源重组修复的编辑效率达64%，而当KU70基因被破坏时，基于同源重组修复的编辑效率可达100%。杂交启动子SCR1′-tRNAGly表达sgRNA、启动子PUAS1B8-TEF(136)表达Cas9的质粒pCRISPRyl是解脂耶氏酵母基因组编辑的新工具。12.3油脂细胞工厂人工解脂耶氏酵母细胞工厂12.3.1微生物油脂12.3.2油脂细胞工厂设计12.3.3油脂细胞工厂构建12.3.4发酵工艺优化微生物油脂微生物油脂又称单细胞油脂，从产油微生物中获取油脂细胞工厂解脂耶氏酵母高山被孢霉卷枝毛霉螺旋藻产油微生物微生物油脂生产公司微生物油脂应用微生物油的脂肪酸组成和植物油相近,以C16

和C18为主,如油酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸不饱和脂肪酸DHAEPAARA膳食生物柴油奶粉添加剂微生物油脂解脂耶氏酵母是典型的产油酵母，油脂最高可占细胞干重的90%以上油脂细胞工厂FDA认证可安全用于工业化生产全基因组已经测序并可获得遗传背景清晰，基因操作手段成熟可利用底物范围广能积累超过干重90%的油脂优势甘油三酯油脂细胞工厂设计油脂细胞工厂解脂耶氏酵母天然存在脂肪酸合成、积累和降解途径4.降解途径3.脂肪酸积累2.脂肪酸合成1.乙酰辅酶A合成油脂细胞工厂构建油脂细胞工厂增加乙酰辅酶A反应池是增强脂质合成的常见策略乙酰辅酶A丙二酰辅酶AFAS脂酰辅酶A甘油三酯乙酰辅酶A是微生物油脂合成必需前体；内源乙酰辅酶A合成受到严格的氮限制；CitrateACL乙酰辅酶A来源于柠檬酸转运系统：线粒体→细胞质油脂细胞工厂乙酰辅酶A工程策略：内源、异源乙酰辅酶A再生途径的改造1.丙酮酸-乙酸途径丙酮酸脱羧酶PDC、醛脱氢酶ALDH,乙酰辅酶A合酶ACS2.丙酮酸-醛途径丙酮酸脱羧酶PDC和CoA-乙酰化醛脱氢酶AAD3.丙酮酸甲酸裂解酶途径丙酮酸甲酸裂解酶PFL4.乙酰辅酶A穿梭途径肉碱乙酰转移酶CAT25.非氧化戊糖-磷酸途径磷酸酮醇酶PK和磷酸转乙酰酶PTA内源反应异源反应油脂细胞工厂构建油脂细胞工厂油脂合成（糖酵解和脂肪酸延长途径）需要持续的NADPH供应大部分NADPH来源于磷酸戊糖途径1.磷酸戊糖途径葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因ZWF12.丙酮酸-草酰乙酸-苹果酸转氢苹果酸酶基因MCE23.NADH-NADPH转氢酶途径大肠杆菌来源转氢酶基因PntAB/UdhA内源反应异源反应NADPH是维持细胞氧化还原稳态的关键因子策略胞质NADPH工程油脂细胞工厂构建油脂细胞工厂碳饥饿条件下微生物油脂可以作为替代能源维持细胞代谢抑制脂肪酸降解策略过氧化物酶体内的β-氧化是脂肪酸降解的主要方式具体步骤策略PEX10敲除三酰甘油脂肪酶ylTGL4敲除酰基辅酶氧化酶POX1-POX6，多功能酶MFE敲除过氧化物酶体必须转录因子生物发生因子PEX10通过以上三种策略可以极大的缓解由β氧化导致的脂肪酸降解减少游离脂肪酸的生成减少游离脂肪酸的β氧化破坏过氧化物酶体的生成策略1策略2策略3油脂细胞工厂构建油脂细胞工厂脂质积累会导致活性氧（ROS）增加，引发各种细胞应激反应。氧化应激防御工程ROS会引发DNA损伤，细胞周期停滞，细胞凋亡改变和细胞膜损伤细胞内ROS的来源是线粒体（主要来源）、内质网（ER）、过氧化物酶体、微粒体脂氧合酶和环加氧酶，与ROS生成过程有关ROS生成ROS引发损伤构建NADPH再生途径、氧化应激防御途径、醛解毒途径的解脂耶氏酵母能够更好地抵抗氧化压力，细胞形态呈现单细胞、圆球形，细胞的油脂含量提升幅度明显。油脂细胞工厂构建油脂细胞工厂转录因子调节能保证脂质合成和积累过程中相关基因的高效表达转录因子工程1.敲除蔗糖非发酵蛋白激酶Snf1：实现酵母从生长期过渡到产油期策略2.敲除琥珀酸半醛脱氢酶Uga2：导致α-酮戊二酸的积累，破坏TCA循环平衡3.敲除全局转录因子Mga2：导致柠檬酸通量降低，TCA循环减弱转录因子调控可帮助代谢模块的碳通量重分配，鉴定新的转录因子是未来提高脂质合成的重要方案！油脂细胞工厂构建油脂细胞工厂适应性实验室进化（ALE）指在实验室条件下，借助人工选择压力实现微生物的定向进化，筛选优良性状个体的一种方法适应性进化基于细胞密度ALE策略尼罗红染色平板细胞密度低1甲基磺酸乙酯EMS抑制剂用于获得解脂耶氏酵母菌株突变文库2.尼罗红染色平板用于脂滴染色，直观表征油脂含量优势：1）能在不减少生物量的情况下，增加了脂质的产量；2）培养过程无需控制缺氮条件；3）筛选操作简单，便于富集正向突变。3.发酵气相数据具体油脂含量油脂细胞工厂构建油脂细胞工厂适应性进化基于无碳培养基筛选ALE策略通过适应性进化策略，协调解脂耶氏酵母细胞生长与脂质积累，提高菌株脂质含量马铃薯葡萄糖培养基PDB（70g/L葡萄糖）无碳培养基1.细胞增殖阶段2.细胞筛选阶段大菌落油脂含量能比起始菌株高30%结合基因测序解析机制油脂细胞工厂构建发酵工艺优化培养基成分及发酵条件优化对促进油脂合成十分有效油脂细胞工厂1.培养基及其控制C/N摩尔比调整在11.9-47.62.温度及其控制最优温度为26-28℃，低于32℃3.pH及其控制最佳pH为5-7，细胞形态较好4.溶解氧及其控制低转速，如常用100rpm,低于300rpmC/N控制温度，pH，溶解氧DO在线监测未来方向动态监测生物量，脂质含量人工神经网络（ANN）动态监测技术为发酵调控提供新方向12.4β-胡萝卜素细胞工厂人工解脂耶氏酵母细胞工厂12.4.1β-胡萝卜素理化性质及应用12.4.2β-胡萝卜素细胞工厂设计12.4.3β-胡萝卜素细胞工厂构建12.4.4发酵工艺优化β-胡萝卜素理化性质及应用β-胡萝卜素细胞工厂β-胡萝卜素的基本结构分子式：C40H56分子量：536.88熔点：176-182℃深红紫至暗红色植物来源β-胡萝卜素细胞工厂β-胡萝卜素的理化性质在弱碱情况下较稳定溶于氯仿、己烷及植物油对光、热及氧不稳定不溶于水，甘油①②③④β-胡萝卜素理化性质及应用β-胡萝卜素细胞工厂β-胡萝卜素的应用作为营养补充剂可被人体吸收具有抗氧化作用具有增强人体免疫力的作用对视力和健康具有保护作用β-胡萝卜素理化性质及应用β-胡萝卜素细胞工厂设计β-胡萝卜素细胞工厂β-胡萝卜素的生物合成途径下游β-胡萝卜素生成途径两分子的GGPP被八氢番茄红素合酶（由CrtB基因编码）催化生成八氢番茄红素。八氢番茄红素由八氢番茄红素脱氢酶（由CrtI或CarB基因编码）脱水产生番茄红素，最后番茄红素通过番茄红素环化酶（基因CrtY）转化为β-胡萝卜素。上游MVA途径以乙酰辅酶A为前体，通过MVA途径生成香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）解脂耶氏酵母没有内源的β-胡萝卜素合成途径β-胡萝卜素细胞工厂常用的构建方法利用GoldenGate构建元件文库利用HR或NHEJ法构建菌株文库β-胡萝卜素细胞工厂构建β-胡萝卜素细胞工厂基于生物合成途径的改造（一）1.增加甲羟戊酸途径的通量过表达关键限速酶包括HMGR等2.重塑FPP的代谢通量截短内源性ERG9启动子/采用响应性启动子下调角鲨烯合成3.调节脂质代谢增加细胞内脂质含量敲除β-氧化途径基因包括PEX10等β-胡萝卜素细胞工厂构建β-胡萝卜素细胞工厂基于生物合成途径的改造（二）IUP途径的引入为其他萜类化合物细胞工厂的开发提供了借鉴