DB32-T 5377-2026 人源心脏类器官在化学品毒性测试中的应用技术规范

人源心脏类器官在化学品毒性测试中的应用技术规范Technicalspecificationsfortheuseofhumanh2026-04-03发布2026-05-03实施江苏省市场监督管理局I前言 Ⅲ 12规范性引用文件 13术语和定义 14原理 25要求 26试验步骤 27结果评价 38试验报告和结果评定 3附录A(资料性)人源心脏类器官毒性测试的培养板布局与处理 4附录B(资料性)人源心脏类器官形态检测 6附录C(资料性)人源心脏类器官存活率检测 7附录D(资料性)人源心脏类器官收缩功能检测 8参考文献 9Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省卫生健康委员会提出并组织实施。本文件由江苏省卫生健康标准化技术委员会归口。本文件起草单位：南京医科大学、同济大学附属东方医院、苏州疾病预防控制中心。1人源心脏类器官在化学品毒性测试中的应用技术规范本文件给出了人源心脏类器官在化学品毒性测试中的原理和技术要求。本文件适用于人源心脏类器官在化学品毒性测试中的技术规范。下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文GB/T25915.5洁净室及相关受控环境第5部分：运行下列术语和定义适用于本文件。由人多能干细胞体外分化组装获得的，包含心肌细胞和多种心脏非心肌细胞在内的腔室化结构。注：其生理结构和功能与人类心脏高度相似，具有收通过实验方法评估化学品等对生物体潜在有害作用的过程。按照本文件试验可产生人源心脏类器官毒性反应的化学品。注：阳性对照的目的是显示适用试验系统的反应。含人源心脏类器官，不含试验化学品和试验化学品溶剂的参照组，试验期间置于与试验组相同的培按照本文件试验时不产生人源心脏类器官毒性反应的化学品。注：阴性对照的目的是显示细胞的背景反应。2经受与试验组相同的条件。心脏毒性。日常清洁等方面的洁净室运行规范。心肌组织内形成由心内膜衬里的腔室结构，同时包含散在分布的心脏成纤维细胞及内皮细胞，外部覆盖完整的心外膜组织。呈现强劲而规律的自主搏动。微生物指标宜按照GB/T40365进行检测，无微生物污染。将合格的人源心脏类器官接种于培养板中，每孔接种1个。培养板布局和处理宜参考附录A。根据待测化学品的实际使用浓度或人体内暴露浓度确定其最佳测试浓度范围，并在此范围内设置至少5个浓度梯度。同时设置溶剂对照、阳性对照、阴性对照和空白对照组。每组至少采用3个平行试验样本数。根据待测化学品毒性特点，经过至少24h培养后，按6.2～6.4确定毒性反应。人源心脏类器官形态检测宜参考附录B的规定。3人源心脏类器官存活率检测宜参考附录C的规定。人源心脏类器官收缩功能检测宜参考附录D的规定。7.1与空白组相比，检测数据下降大于30%被认为有人源心脏类器官毒性反应。试验报告应至少包括下列各项内容：a)试验机构名称和地址；b)试验操作者姓名；c)试验开始和结束日期；g)试验人签字或单位签章；h)结果评定所需的任何其他相关数据。应由有能力根据试验数据做出判定的人员进行结果的总体评定。任何人源心脏类器官毒性反应可能都是重要的。但是，这主要预示该化学品潜在的心脏毒性。4(资料性)人源心脏类器官毒性测试的培养板布局与处理本试验方案适用于96孔细胞培养板。其他孔数的多孔板可参考本方案。A.2试剂材料A.2.1磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersolution,PBS),无菌。A.2.2人源心脏类器官培养基，无菌。A.2.3具有疏水表面、透光良好的非再造聚苯乙烯细胞培养板，无菌。A.2.4阳性对照化学品：包括但不限于阿霉素。A.2.5阴性对照化学品：包括但不限于二甲基亚砜。A.2.6待测化学品。A.3仪器设备A.3.1超净工作台。A.3.2细胞培养箱：温度37℃±0.2℃,CO₂浓度5%±0.1%,相对饱和湿度≥95%。A.3.3微量移液器。A.4试验步骤A.4.1培养板宜使用96孔板，宜参考以下布局(见图A.1)。a)96孔板边缘孔不接种人源心脏类器官，每孔加入200μLPBS。b)将合格的人源心脏类器官接种于相应孔中，每孔接种1个类器官并加入200μL人源心脏类器官培养基。c)空白对照实验布局：96孔板中B行第7～9列区域。设置3个平行样本。d)阴性对照实验布局：96孔板中C行(溶剂对照)及D行的第7～9列区域。每组设置3个平行试验样本。e)阳性对照实验布局：96孔板中F行(溶剂对照)及G行的第7～9列区域。每组设置3个平行试验样本。f)待测化学品实验布局：96孔板中B行(溶剂对照)及C至G行(5个浓度梯度)的第2～4列区域。各浓度设置3个平行试验样本。A.4.2人源心脏类器官化学品处理：a)移除孔板中的培养基；b)根据图A.1布局，每孔加入200μL含特定浓度化学品的人源心脏类器官培养基；c)将孔板置于细胞培养箱中培养。5待测化学品组待测化学品组OOOOO溶剂对照B□□O浓度1C△△△O阴性对照组溶剂对照D▲O阴性对照组E■■OFO■▽▽▽O阳性对照组溶剂对照GO□O阳性对照组HOOOOOOOO○O□:待测化学品组溶剂对照■:待测化学品组浓度1

:空白对照组■:待测化学品组浓度2△:阴性对照组溶剂对照■:待测化学品组浓度3▲:阴性对照组■:待测化学品组浓度4▽:阳性对照组溶剂对照■:待测化学品组浓度56(资料性)人源心脏类器官形态检测B.1仪器设备倒置相差显微镜：具有4倍、10倍、20倍物镜。B.2试验步骤使用倒置相差显微镜拍摄人源心脏类器官图像，确保图像清晰且类器官边界与背景对比度高。B.3结果分析使用软件对所获取的图像进行综合分析，以测量人源心脏类器官的周长和/或面积。具体操作请参考软件使用说明。7(资料性)人源心脏类器官存活率检测C.1试剂材料C.1.1钙黄绿素(Calcein-AM)/碘化丙啶(PI)双荧光染色试剂。C.1.2磷酸盐缓冲液(Phosphatebuffersolution,PBS),无菌。C.2仪器设备C.2.2微量移液器。C.3试验步骤C.3.1配制Calcein-AM/PI工作液，使其浓度分别为2μmol/L和4.5μmol/L。C.3.2弃去每孔原有人源心脏类器官培养基，PBS冲洗三遍。PI标记死细胞，呈红色荧光，激发/发射波长为535/617nm。8(资料性)人源心脏类器官收缩功能检测D.1仪器设备倒置相差显微镜：具有4倍、10倍、20倍物镜。D.2试验步骤倒置相差显微镜连续拍摄人源心脏类器官，获取30s视