抗寒剂的叶喷施用方法及其对水稻秧苗抗寒性的影响

抗寒剂的叶喷施用方法及其对水稻秧苗抗寒性的影响摘要：【研究目的】为了探明抗寒剂KHYE-1的叶喷施用方法及其对水稻秧苗抗寒性的影响。【方法】以早稻品种‘中嘉早17’为材料，用抗寒剂叶喷水稻秧苗并进行低温胁迫处理，用化学法、生化法测得生化数据。【结果】KHYE-1的最佳叶喷施用方法为叶喷浓度0.5%、叶喷次数为1次/天，连续3天、叶喷用量5.0g/盒；在低温胁迫下，KHYE-1叶喷处理使秧苗N、P、K含量及叶绿素SPAD值维持较高水平，可溶性糖和脯氨酸分别比CK提高了147.4%和72.0%，过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性分别比CK增加了80.2%、2.63%；与ABA相比，其整体效果优于ABA。【结论】抗寒剂KHYE-1能有效增强秧苗抵抗低温胁迫的能力。关键词：水稻；抗寒剂；叶面喷施；抗寒性；低温胁迫Studyonfoliarsprayingapplicationmethodofcold-resistantagentanditseffectoncoldresistanceofriceseedlingsAbstract:Forabetterunderstandingoffoliarsprayingapplicationmethodofcold-resistantagentanditseffectoncoldresistanceofriceseedlings.Thebiochemicalindexesofseedingspray-treatedwithcold-resistantagentonearlyricevariety‘Zhongjiazao17’werestudiedundercoldinjury.TheresultsshowedthatthebestapplicationmethodofKHYE-1was0.5%ofsprayconcentrations,sprayonetimeperdayfor3daysand5.0g/boxofspraydosage;ComparedwiththeCK,theN(Nitrogen),P(Phosphorus),K(Potassium)contentandchlorophyllSPADvalueofriceseedlingstreatedwithcold-resistantagentunderchillinginjurymaintainedadramaticallyhigherlevel,andthecontentofsolublesugarandprolineweremore147.4%and72.0%,peroxidase(POD)andcatalase(CAT)activitieswere80.2%and2.63%higher.Itwasindicatedthatthecold-resistantagentKHYE-1improvedtheresistanceabilityofriceseedlingsunderchillinginjury,andtheoveralleffectwasbetterthanABA.Keywords:rice;cold-resistantagent;foliarspraying;coldresistance;chillinginjury基金项目：科技部国家重点研发计划项目“双季稻全程机械化丰产节本增效关键技术”（2017YFD0301503），“项目名称”（2017YFD0301505）；作物种质创新与资源利用重点实验室（省部共建国家重点实验室培育基地）科学基金开放项目“植物源型抗寒剂提高水稻耐冷性状的分子机理研究”（19KFXM07）；湖南农业大学校级大学生研究性学习和创新性实验计划项目“水稻TCP21基因在胁迫响应过程中的表达和功能鉴定”（xcx19116）。第一作者简介：王翰盈，女，2000年出生，湖南常德人，本科。研究方向：水稻逆境分子生物学。通信地址：410128长沙市芙蓉区农大路1号湖南农业大学生物科学技术学院，TelE-mail：1367960693@。通讯作者：张先文，男，1976年出生，湖南常德人，副教授，博士，研究方向：水稻逆境分子生物学。通信地址：410128长沙市芙蓉区农大路1号湖南农业大学生物科学技术学院，TelE-mail：xianwenzhang@。收稿日期：2020-04-20，修回日期：2020-06-09。0引言中国是水稻种植大国，低温冷害是水稻生产中的一种主要的常见灾害，中国南方稻区早稻和北方稻区育秧期间常遇低温危害，造成大量烂种死秧[1-2]，冷害会影响水稻等作物的生长代谢，使作物的生理活动受碍，严重时会使作物死亡造成农业大面积减产[3]。为了提高水稻对低温冷害的抵抗力，传统农业生产经常采取灌水[4]、覆盖法[5]等农艺措施调节，但收效甚微。研究与应用抗寒物质使之降低低温冷害对作物的危害、提高作物产量和作物生产的经济效益，具有重要意义。抗寒剂或者抗寒物质是指，在低温胁迫下能够稳定植物细胞膜结构，使其发生一系列的生理生化活动，从而增强其抗寒能力的药品、试剂或植物生长调节剂等的统称[6]。国外抗寒剂或抗寒物质的研究较我们早，并且在20世纪50、60年代就开始从生理水平探索作物的抗寒性能。Yamaki等[7]发现，植物受到寒冷袭击时，质膜的影响首当其冲。Kimball等[8]对牧草进行低温实验发现，叶绿体膜结构的稳定性与植物抗寒性成正相关。Robertson[9]利用脱落酸（ABA）研究植物的耐冷，结果表明，ABA可增强细胞活力，稳定细胞膜的结构，避免低温情况下，细胞膜遭到破坏，从而增强植物的抗寒性。Kurkela等[10]从拟南芥中，克隆出了一种ABA诱导的转录物，并证实该产物与抗寒性有关。Byun等[11]也提到了转录因子DaCBF7的表达与抗寒的关系。Lee等[12-13]将ABA和Tachigrance应用于低温胁迫下的水稻上预防水稻寒害，获得可观的进展。目前，国外植物抗寒剂在果树，蔬菜，花卉等方面应用较广泛。我国在20世纪80年代开始研究抗寒剂，黄伟峰等[14]以竹醋液为抗寒物质，能够显著提高茶树的抗寒性，稳定茶叶产量。何璐等[15]的研究表明在低温条件下，抗寒制剂对棉花幼苗的生长有促进作用。于永畅等[16]用ABA和PP333叶面喷施蕙兰叶片缓解冷害程度。在水稻抗寒研究方面，王修慧[17]、马伟[18]等利用外源激素或化学物质来提高水稻的抗寒能力；李训贞等[19]比较了用抗寒剂对水稻种子进行浸种和喷施水稻幼苗这2种施用方法，发现这2种方法都能有效减轻低温对水稻造成的伤害，且喷施方法效果更佳；朱志玉[20]发现沙引发和抗寒剂浸种处理能显著提高水稻品种的发芽势、发芽率以及幼苗的叶绿素及可溶性糖含量；张海清等[21]的研究表明，抗寒种衣剂能提高水稻体内可溶性蛋白质的含量，使水稻在低温胁迫下保持良好的代谢，不受冻害。熊远福、熊海蓉[22-23]等人利用中草药提取物处理水稻种子从而提高水稻的抗寒能力；可见，水稻作为我国的主要粮食作物研究其抗寒性能具有很好的应用前景。前人对水稻抗寒性能研究颇多，但在抗寒产品成型及相关的系统施用方法和全面的生理机理尚不透彻，更少涉及大田推广应用。本文以早稻品种‘中嘉早17’为材料，研究抗寒剂KHYE-1的叶喷施用方法，探讨低温胁迫下抗寒剂KHYE-1对水稻秧苗各项生化指标的影响，弄清其抗寒机理，为大田实验的研究与开展提供基础数据，以期为减轻水稻冷害提供新的理论支持和技术方法。1材料与方法1.1实验材料早稻种子：‘中嘉早17’，湖南省水稻科学研究所提供。抗寒剂：KHYE-1，浓度10%，W/V，以苍耳子提取物为抗寒成分，与成膜剂、乳化剂、防腐剂等助剂溶解混合配制而成，湖南农业大学研制。ABA叶喷溶液：浓度8mg/L。1.2实验方法1.2.1发芽与抗寒实验采用泥床发芽法，处理包括叶面喷施(T)和空白对照(CK)，每个处理3次重复，每个重复取100粒种子置于塑料发芽盒（规格13×19×12cm）内，于2019年3—10月在湖南农业大学温室中进行发芽试验[12]。培养至秧苗有2叶1心，除了对照CK外，各处理T的秧苗分别用抗寒剂进行叶面喷施，继续培养2天后放入光照培养箱内，在7~8℃低温下处理36h，采样后测定秧苗体内的脯氨酸含量等抗寒性能指标。1.2.2抗寒剂施用方法实验实验设计浓度、用量、次数筛选研究。（1）在叶喷用量为5.0g/盒，次数为1次下进行叶喷浓度筛选，浓度设计为0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，筛选出最佳浓度。（2）在最佳浓度，次数为1次下进行叶喷用量筛选，用量设计为3.0g/盒、5.0g/盒、7.0g/盒，筛选出最佳用量。（3）在最佳浓度和最佳用量下进行叶喷次数筛选，次数设计为1次，即每天一次、连续1天；2次，即每天一次连续2天；3次即每天一次连续3天，筛选出最佳次数。本实验依照1.2.1所述方法进行发芽与抗寒实验，以脯氨酸含量高低作为秧苗抗寒性大小的考察指标。1.2.3抗寒剂对秧苗素质及生化指标的影响实验据实验1.2.2的实验结果，用抗寒剂KHYE-1在最佳浓度、用量、次数下对秧苗进行叶面喷施，按实验1.2.1进行抗寒实验，测定KHYE-1叶喷处理后秧苗茎基宽、总根数、百株鲜重、百株干重等苗素质，测定苗体N、P、K含量、脯氨酸含量、叶绿素SPAD值、可溶性糖含量、POD和CAT酶活性等生化指标，并与常用抗寒物质ABA在相同用量、次数下的叶喷效果进行比较。苗素质及苗体氮、磷、钾含量的测定：参照颜启传等[24]的方法，测定秧苗茎基宽、总根数、百株鲜重、百株干重等苗素质。将烘干后的茎叶（地上部）粉碎，按鲍士旦[25]所述H2SO4-CuSO4消化-凯式定氮法、H2SO4-CuSO4消化-钒钼磷比色法、H2SO4-CuSO4消化-原子吸收法使用Thermo-M6型原子吸收分光光度计，分别测定苗体N、P、K含量。脯氨酸、叶绿素及可溶性总糖含量的测定：按张殿忠等所述的方法[26]测定苗体内脯氨酸的含量。使用SPAD502叶绿素仪测定苗体叶绿素SPAD值。按白玉璋[27]所述的蒽酮比色法测定苗体内可溶性总糖的含量。苗体酶活性的测定：按张宪政等[28]所述愈创木酚法和高锰酸钾滴定法分别测定POD和CAT酶活性。2结果与分析2.1抗寒剂叶喷浓度筛选KHYE-1抗寒剂叶喷浓度筛选实验结果如表1所示，随着抗寒剂叶喷浓度的逐渐上升，秧苗体内脯氨酸的含量呈现先增后减趋势，在抗寒剂叶喷浓度为0.5%时达到最大值，比CK增加了157.5%，与CK及其他浓度相比差异显著。在抗寒剂叶喷浓度为0.6%时，则脯氨酸含量较0.5%反而略有下降，脯氨酸究其原因可能是抗寒剂浓度过高，则对脯氨酸的积累起一定的抑制作用[29]。由此可见，叶喷浓度在0.2%~0.5%之间均能提高秧苗的抗寒性，但以浓度为0.5%时，效果最优。表1不同叶喷浓度下脯氨酸的含量(μg/gDW)处理叶喷浓度/%00.50.6CK114.9eE—————KHYE-1—196.5cdCD216.9cBC240.1bB295.9aA175.8dD注：数据后小写英文字母不同者表示处理间差异显著(α=0.05)，大写英文字母不同者表示差异极显著(α=0.01)，下同。2.2抗寒剂叶喷用量筛选KHYE-1抗寒剂叶喷用量筛选实验结果从表2可知，随着抗寒剂叶喷用量的上升，秧苗体内脯氨酸含量先增后减，在抗寒剂叶喷用量为5.0g/盒时达到最大值，比CK增加了92.3%，与CK及其他用量相比差异显著。在叶喷用量为7.0g/盒时，脯氨酸含量较5.0g/盒反而略有下降，其原因可能是用量太大对秧苗内脯氨酸的积累起一定的抑制作用[29]。可见，抗寒剂叶喷用量以5.0g/盒为宜。表2不同叶喷用量下脯氨酸的含量(μg/gDW)处理叶喷用量/(g/盒)03.05.07.0CK131.3dD———KHYE-1—211.4bB252.5aA183.9cC2.3抗寒剂叶喷次数筛选HHYE-1抗寒剂叶喷次数筛选实验结果如表3所示，随着叶喷次数的增加，秧苗体内脯氨酸含量逐渐增加，叶喷3次的脯氨酸含量比CK增加了69.8%，与CK及其他次数相比差异显著。叶喷次数更多其抗寒效果可能会更好，但其成本也相应提高。故综合抗寒效果、经济效益和人力成本等因素考虑，叶喷次数以3次为优。表3不同叶喷次数下脯氨酸的含量(μg/gDW)处理叶喷次数0123CK139.2cC———KHYE-1—195.4bB203.9bB236.3aA2.4抗寒剂对低温胁迫下秧苗素质及苗体N、P、K含量的影响由表4可知，茎基宽、总根数、鲜重、干重等苗素质测定结果均为KHYE-1优于ABA优于CK，且在茎基宽、总根数、鲜重三项指标上，KHYE-1处理显著优于ABA，极显著优于CK。抗寒剂KHYE-1不仅能提高秧苗茎基宽，使其变得强壮，还能促进秧苗根系生长，有利于植物吸收土壤中的水分和养分，从而增强秧苗的抗寒能力，在逆境条件下促使秧苗保持良好的生长状态。从数据可以综合说明抗寒剂KHYE-1的使用增强了水稻苗素质，有利于植物生长；且效果优于ABA。表4水稻秧苗素质处理茎基宽/(cm/10株)总根数/(条/株)鲜重/(g∕100株)干重/(g/100株)CK2.54cB8.5cC24.2485cC5.4350bAKHYE-13.10aA12.3aA31.3288aA6.6417aAABA2.86bA10.2bB28.0987bB5.7921abA由表5可知，与CK相比，用KHYE-1与ABA处理秧苗，均能提高秧苗体内N、P、K含量。KHYE-1处理的N、P、K含量比CK分别提高了27.6%、43.0%和10.9%，差异显著；ABA处理的N、P、K含量比CK分别提高了14.5%、30.0%和6.0%，差异显著；而KHYE-1与ABA之间比较，差异显著，以KHYE-1的效果为佳；由此表明KHYE-1与ABA都能缓解低温对秧苗的伤害，加强对N、P、K等营养物质的吸收，促进秧苗的营养生长，其KHYE-1效果显著优于ABA。表5苗体N、P、K含量处理N含量/(%，DW)P含量/(%，DW)K含量/(%，DW)CK0.076cB0.100cB0.0267bAKHYE-10.097aA0.143aA0.0296aAABA0.087bAB0.130bA0.0283abA2.5抗寒剂对苗体脯氨酸、叶绿素及可溶性总糖含量的影响由表6可知，KHYE-1抗寒剂叶喷处理使苗体脯氨酸、叶绿素及可溶性总糖含量比CK分别提高了120.0%、30.3%和104.1%，差异极显著；比ABA分别提高了72.3%、5.2%和35.8%，差异显著；而ABA溶液叶喷处理后上述各项指标也比CK分别提高了27.7%、23.9%和50.3%。结果表明KHYE-1与ABA都能提高秧苗的抗寒性，且KHYE-1效果优于ABA。表6苗体脯氨酸、叶绿素及可溶性糖含量处理脯氨酸含量/(μg/gDW)叶绿素SPAD值可溶性糖含量/(%，DW)CK135.0bB10.9bB3.66cCKHYE-1297.0aA14.2aA7.47aAABA172.4bB13.5aAB5.50bB2.6抗寒剂对苗体POD和CAT酶活性影响由表7可知，KHYE-1抗寒剂叶喷处理使苗体POD和CAT酶活性比CK分别增加了58.4%和29.7%，差异显著，ABA溶液叶喷处理使苗体POD和CAT酶活性比CK分别增加了36.1%和30.6%。就POD酶活性而言，KHYE-1效果显著优于ABA，就CAT酶活性而言，KHYE-1效果略低于ABA但并无显著差异，表明KHYE-1与ABA都能提高秧苗的抗寒性，且KHYE-1效果整体优于ABA。表7苗体POD和CAT酶活性处理POD/(ΔOD470nm/gFW/min)CAT/(mg/gFW/min)CK46.25cB8.87bAKHYE-173.26aA11.50aAABA62.95bA11.58aA3讨论秧苗素质的提高能促进秧苗生长以及植株对营养元素的吸收，使秧苗体内N、P、K含量增加，有增产增质的效果。N、P、K是植物生长发育最主要的营养元素，是作物生产的基础条件[30]。氮是构成蛋白质的主要成分，对茎叶的生长和果实的发育有重要作用，是与产量最密切的营养元素。磷能加强光合作用和碳水化合物的合成与运转，是氮素代谢过程中酶的组成成分之一，具有提早成熟、增加产量和改善品质的作用[30]。钾能促进植株茎秆健壮，增强植株抗寒能力，钾素供应不足时，碳水化合物代谢受到干扰，光合作用受抑制，因此，缺钾时植株抗逆能力减弱，易受病害侵袭。N、P、K含量高低可作为植株是否缺肥的一个重要诊断[31]。本试验结果表明，在低温胁迫下，KHYE-1抗寒剂能够维持秧苗较高的苗素质和较高的N、P、K含量，为保持秧苗正常的营养吸收和生长、增强秧苗的抗逆性提供了保障。脯氨酸作为植物体内一种渗透调节物质，是可溶性溶质中唯一可以保护植物免受单线态氧和自由基伤害的分子，从而保护膜的稳定性；逆境解除后，脯氨酸也可作为碳源和氮源为植物恢复提供能量[32-33]。叶绿素是植株进行光合作用的重要物质保障，其含量的高低关系到植株体内有机物质合成能力的强弱，叶绿素的提高表明水稻植株的光合作用增强，体内干物质的量增加[30]。可溶性糖在植物细胞体内具有渗透调节作用，糖在低温下积累，可提高细胞液浓度，降低细胞液的冰点，缓冲细胞质过度脱水，保护细胞质胶体不至遇冷凝固，因而可增强植物的抗寒性[34]。脯氨酸和可溶性糖可作为植株对逆境抵抗能力的一个重要指标，其含量的高低可直接反映出植株抗逆性的强弱[31]。本试验结果表明，在低温胁迫下，抗寒剂KHYP-1能显著提高秧苗体内脯氨酸、可溶性糖等渗透调节物质的积累，增加叶绿素含量，促进秧苗营养生长，切实增强秧苗的抗逆能力。POD、CAT和SOD三种酶被称为植物组织的保护酶系统。正常情况下，活性氧的产生和清除处于一种动态平衡，不会引起伤害。但当处于逆境条件时，细胞自由基产生和清除的平衡遭到破坏而出现活性氧的积累，高水平的活性氧可能加剧膜脂过氧化和膜蛋白聚合，从而破坏膜结构和功能，这种累计超过一定的阈值，就会发生膜伤害，甚至导致植物死亡[33]。在这个保护酶系统中SOD能够歧化O2-·为O2和H2O2，而POD和CAT则催化H2O2形成H2O，通过SOD、POD和CAT的协同作用，可有效降低自由基的积累及阻遏O2-·、H2O2通过FentonHaber-Weiss反应向破坏极强的·OH转化，使细胞内的自由基维持在一个较低的水平[35-36]。从而避免或减轻了自由基对生物大分子的降解破坏及对生物膜的损害，使植物抗逆性提高。本试验结果表明，KHYP-1抗寒剂延缓了CAT及POD酶活性的下降，减轻了自由基对生物大分子的降解破坏及对生物膜的损害，增强了水稻秧苗细胞的抗寒性，表现出了显著的抗寒效果。本试验仅对KHYE-1抗寒剂进行了室内发芽试验，结果显示KHYE-1叶喷处理能有效提高水稻秧苗素质，使秧苗NPK含量及叶绿素SPAD值维持较高水平，并通过提高水稻苗体内脯氨酸、可溶性糖等生化指标的含量，增加苗体内POD、CAT等保护酶活性，增强了秧苗抵抗低温胁迫的能力，为减轻水稻冷害提供一定理论依据。下一步将进行大田栽培试验，更全面地了解该抗寒剂对水稻育秧和抽穗时期遇低温冷害的防治效果。4结论通过试验确定了KHYE-1抗寒剂的最佳叶喷施用方法为叶喷浓度0.5%、叶喷用量5.0g/盒及叶喷次数3次。与对照相比，其脯氨酸含量分别提高了157.5%、92.3%、69.8%，抗寒效果显著。KHYE-1抗寒剂处理水稻秧苗，能有效提高低温胁迫下秧苗素质及苗体N、P、K含量，其N、P、K含量较CK分别提高了27.6%、43.0%、10.9%，起到了壮苗的效果；脯氨酸、叶绿素及可溶性总糖含量较CK分别提高了120.0%、30.3%和104.1%，脯氨酸是植物体内一种渗透调节物质，在水溶液中可以形成亲水胶体，其含量的增多使秧苗内可溶性蛋白质增加，使植物具有一定的抗寒性和保护作用[37]。叶绿素含量的增加提高了秧苗的光合生产能力，能够在植物细胞内吸收光能将二氧化碳和水转化成糖类，糖的积累提高了细胞液浓度，使细胞液冰点降低，保护细胞质胶体不至遇冷凝固，因而可增强植物的抗寒性；POD和CAT酶活性分别增加了58.4%和29.7%，通过POD、CAT等保护酶的协同作用，有效避免或减轻了低温胁迫下活性氧的积累及其对生物膜的损害，使植物抗逆性提高。其整体效果优于ABA，且与CK差异显著。参考文献[1] 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