第二章-细胞工程基础

第二章细胞工程基础2.1分子生物学基础2.1.1基因的概念与结构2.1.2基因复制与基因表达2.1.3基因调控与基因突变2.1.4基因重组与基因操作2.2细胞生物学基础2.2.1细胞的概念2.2.2细胞的大小、形态及类型2.2.3细胞器2.2.4细胞的增殖与调控2.2.5细胞分化2.2.6细胞衰老与死亡2.3生物个体发育基础2.3.1组织和器官2.3.2生殖与发育2.4胚胎细胞工程基础2.4.1生殖细胞的发生2.4.2受精与早期胚胎发育2.1.1基因的概念与结构（3）原核生物的基因组：较小，双链环状DNA，无组蛋白，约1000个结构基因，重复序列少，具单一复制起点和基因重叠现象（一个基因中包含另一个基因的序列），操纵子（operon)为表达调控的单位。（4）真核生物的基因组：较大，多个复制起点，大量的重复序列，很少存在操纵子结构，出现多基因家族（结构和功能相关的基因发生多次重复），有假基因（多基因家族中的基因结构与结构基因类似，由于点突变等使其不能表达蛋白），多为断裂基因（内含子和外显子相间排列，符合GTAG法则），有侧翼序列（结构基因第一和最后一个外显子的外侧），其中含启动子（5‘端，不转录，被RNA聚合酶Ⅱ识别启动mRNA的转录，有三种保守序列：TATA、CAAT、GC）、增强子（激活启动子活性）和终止子（有AATAAA序列——添加poly(A)的信号、有3’端回文序列——发夹结构——终止信号），存在转座因子——自发地在基因组之内、之间转移——调节基因组下游基因的表达。2.1分子生物学基础

2.1.1基因的概念与结构（1）基因：染色体上具有特定功能的含有遗传信息的DNA片段，也是遗传的基本单位。（有的片段是结构基因：编码蛋白质；有的片段是编码rRNA或tRNA；有的是与复制和转录有关的调控系列）（2）基因组（genome)：某种生物其完整的一套单倍染色体包含的全部基因的总和。

2.1.2基因复制与基因表达1、复制：多个复制子(replicon),

常染色质（早）和异染色（晚），半保留复制，半不连续复制，冈崎片段，复制叉，RNA引物，前导（先行）链（leadingstrand）,

延迟（后行）链（laggingstrand),DNA合成方向5‘→3’，

3‘→5’模板链上连续合成DNA，

5‘→3’模板链上不连续合成DNA2、表达：转录、翻译转录：成为不均一核RNA(hnRNA)hnRNA加工成成熟的mRNA：

“戴帽”——5‘端加一个7-甲基鸟酸；

“加尾”——3’端AATAAA处加poly(A)（180-200个）；剪接——切除内含子、拼接外显子；链内某些碱基甲基化。差异剪接（differentialsplicing）：一种hnRNA经不同方式的加工，可产生编码不同蛋白质的mRNA。

2.1.3基因调控与基因突变

1、原核生物基因表达调控：主要功能单位：操纵子，主要水平：转录水平调节（也存在翻译水平的调控）。

2、真核生物基因表达调控：多环节进行——DNA、转录、转录后、翻译、翻译后等环节调控。

3、大肠杆菌基因表达的调控：操纵子：启动子（与RNA聚合酶结合启动转录）、操纵元件（特异的阻遏物结合区）；诱导型（乳糖）和阻遏型（色氨酸）操纵子；正调控蛋白和阻遏蛋白；顺式作用元件（cis-actingelement)—与结构基因表达有关的、能被基因调控蛋白特异性识别的DNA系列；基因特异性转录因子（genespecifictranscriptionfacter)——能与顺式作用元件特异性结合、调控基因转录启始过程的蛋白质。2.1.3基因调控与基因突变4、真核生物转录前的调控：DNA甲基化、组蛋白乙酰化、基因重排、基因扩增。5、真核生物转录水平调控：反式作用元件（trans-actingelement)——基因特异性转录因子其活性影响转录的起始。启动子系列中的TATA框——影响转录起点的精确性和转录的效率。

CAAT框和GC框（启动子元件，于TATA框上游DNA系列中）——CAAT框是RNA聚合酶结合的位点，与GC框一起决定转录的速度。增强子（调控基因上下游均可）——刺激转录活性和加快转录速度。反式作用元件（对基因的表达有正和负调控）的结构域——DNA结合域（锌指结构、同源异形结构域、亮氨酸拉链结构等）、转录活化结构域（酸性a螺旋结构域、富含脯氨酸结构域）。反应元件和沉默子的调控。2.1.3基因调控与基因突变6、基因变异：基因结构变异和表达异常，是生物变异、生物进化、疾病发生的基础。7、基因结构变异：DNA点突变、基因融合、染色体位移、大片段DNA缺失、基因扩增、基因插入、基因多态性等。8、基因突变：转换、颠倒、缺失、插入、易位、倒位、重排、碱基的异常修饰。9、遗传信息改变方式不同的突变：错义突变、无义突变、同义突变和移码突变。10、中性突变：错义突变发生于蛋白质的非必需区，不影响蛋白质的活性，也不表现出明显的形状变化。11、致死突变：突变影响蛋白质活性乃至其失活，并影响表型，若该基因是必须基因则是致死突变。12、静态性突变（较稳定的突变频率）和动态突变（多态性突变）13、单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）：基因组序列中单核苷酸改变使DNA系列的多态性显著增加的现象。人类基因组中，约300—500个碱基就会有一个SNP。2.1.4基因重组与基因操作1、基因重组：自然发生的DNA分子之间同源系列的相互交换；体外进行的基因操作。2、自然发生的基因重组：同源重组（无须特异的DNA序列，如同源染色体交换）、位点特异性重组（整合酶催化，发生于特异位点）、转座子（自发在基因组内和基因组间转移）、免疫球蛋白基因重排（免疫球蛋白由三个不连锁的基因群共同编码——重链基因、κ轻链基因、λ轻链基因——编码两条重链和两条轻链——每条链分为可变（V）区和稳定（C）区。胚胎时期由分隔存在的基因编码其V区和C区，B淋巴细胞发育过程中，这两个基因通过位移连接在一起——形成有功能的完整的免疫球蛋白基因。）。2.1.4基因重组与基因操作3、重组DNA技术：按需要将某一种生物体的基因或人工合成的基因经重组后引入另一种生物，使其能够表达并稳定地遗传给后代，从而大量合成该基因编码的蛋白质或定向改变生物遗传形状的技术。4、基因操作：重组DNA技术及其相关技术统称基因操作。5、重组DNA技术涉及：目的基因的获得、目的基因的改造、选择和修饰克隆载体、构建目的基因与载体连接的重组载体、重组载体导入宿主细胞、含有重组DNA的细胞的筛选等。供体、载体和受体是重组DNA技术的三大要素。按产业化应用归于上游技术。（将含有重组基因的特定细胞——基因工程菌或细胞，进行大规模培养和外源基因表达产物的分离纯化技术，统称下游技术）6、工具酶：限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA修饰酶。载体应具的特点：自我复制能力、较多的拷贝数、相对分子质量较小、有较多的限制性核酸内切酶位点、具可供筛选的标记、遗传稳定性较高。2.2细胞生物学基础2.2.1细胞的概念：1、细胞的发现：1665年（Hooke，英国)40——140倍的显微镜，观察木栓细胞壁，出版《显微图谱》，提出细胞的概念；活细胞的观察（Leeuwenhoek，荷兰）。细胞学说的提出：1838——1839年（Schleiden和Schwann)2、细胞生物学观点：结构功能统一、动态、进化的三观点。3、细胞生物学的学科地位：被认为是现代生命科学的四大前沿学科之一。人类基因组计划完成后，生命科学进入“后基因组时代”，功能基因组研究的主体内容将回归到细胞水平。2.2.2细胞的大小、形态及类型1、细胞的分子组成：（1）元素：原生质体的各元素在非生命界中都有，物质本源上是统一的，也说明了其进化关系。（2）分子组成：蛋白质核酸脂类碳水化合物2.2.2细胞的大小、形态及类型1、细胞的大小：最小的细胞——支原体：0.1~0.2μm；最大的细胞：鸵鸟卵细胞：20㎝。2、细胞的形态：多种多样。游离细胞：球或近球形；组织中的细胞为：椭球、立方、扁平、梭形、多角形。3、细胞的类型；原核与真核细胞；动物与植物细胞4、非细胞生物——病毒：2.2.2.4病毒在细胞工程、基因工程中的作用具DNA基因组或生活史中有DNA阶段的真核生物病毒在细胞工程和基因工程中具有重要作用：载体。1、具有能被细胞识别的启动子，能引导（基因工程中常用的）标记的表达，也使克隆的外源基因表达。2、病毒的高复制性：插入在病毒基因组中的外源基因，其数量显著增加，实现有效的扩增表达。3、病毒具有控制自身复制的顺式（cis）和反式（trans）作用因子，经基因操作改造后，这些因子可成为能在细胞内长时间拷贝并保持外源基因特性的复制型质粒。4、在复制过程中，病毒能高效稳定地整合到宿主细胞基因组中。故可提高外源基因导入宿主细胞基因组的效率。5、病毒的外壳蛋白能够识别细胞接受器，因此作为感染剂，外壳蛋白可将外源基因导入宿主细胞。2.2.3细胞器1、线粒体（mitochondria）：母系遗传，其DNA（mtDNA）碱基组成不同于核DNA，mtDNA复制早于核DNA，半保留复制，其起始和终止密码子有其特殊性。mtDNA基因组含有的基因：12SrRNA和16SrRNA、22种tRNA、与氧化磷酸化有关的13条多肽链。mtDNA突变与线粒体疾病。2.2.3细胞器

2、叶绿体（chloroplast）：

ctDNA(cpDNA)：不含5-甲基胞嘧啶，合成60多种蛋白质，每一叶绿体有约12个ctDNA分子。3、内质网（endoplasmicreticulum,ER)：膜性管状或囊状结构。糙面内质网（roughendoplasmicreticulum,rER）：膜的外表面附有核糖体。合成酶原、抗体、肽类激素等外输性蛋白质，储存、运输、分隔新合成的蛋白质。滑面内质网（smoothendoplasmicreticulum,sER）：小泡、短管状。脂类合成、糖原分解、解毒等作用。2.2.3细胞器4、高尔基复合体（Goigicomplex）：扁平囊、泡组成。凸（形成）面膜厚与内质网相近，凹（分泌、成熟）面膜厚与质膜相近。功能：分泌糖蛋白和其他糖蛋白的修饰、加工、分装，糖类合成，内质网产物的分选、发送。5、溶酶体（lysosome)：存于所有动物细胞中，植物细胞中有类似溶酶体的细胞器——圆球体和中央大液泡。初级溶酶体、次级溶酶体、残余体（不含水解酶）。异噬泡、自噬泡、胞内多余分泌颗粒。酸性磷酸酶。功能：？6、过氧化物酶体（peroxisome）：特征酶：过氧化氢酶。功能：分解、调节、控制过氧化氢，防止细胞中毒。2.2.3细胞器7、中心体（centrosome）：中心粒与周围物质共同组成。短筒状，筒壁由9组三联管构成。为纺锤丝微管的组织中心。8、细胞骨架（cytoskeleton)：有蛋白质纤维（微管、微丝、中间纤维）组成，几乎参与细胞生命活动的方方面面。以前认为是真核细胞特有的结构，但自从在原核细胞中发现类似的骨架蛋白成分来，此观点面临新的挑战。微管(microtubule)：由其组成的细胞器？特异药物：秋水仙素、紫衫醇？微丝（microlilament）：肌动蛋白组成。特异性药物：细胞松弛素B和D。D、鬼笔环肽？中间丝（inttermediatefilament）：成分复杂：角质纤维蛋白、神经纤维蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白、波形纤维蛋白、核层蛋白等。功能：维持细胞的形态、细胞的位移、胞内颗粒的运动、核定位及细胞间的连接。2.2.3细胞器9、细胞核：核膜、核仁、染色质、核基质。核膜（nuclearmembrane)：核内膜：核质面附着有致密的纤维（25nm,主要为多肽）。核外膜：类似于、相连于内质网。核孔复合体：8+1对颗粒和细丝组成。染色质(chromatin)：常染色质（euchromatin)：大部于核中央，少部分于核孔内侧和核仁内。异染色质（heterochromatin）：于核周围，呈颗粒和团块。核仁：间期核中，呈圆或卵圆形。包括纤维中心（核仁丝5~10nm）、致密纤维成分（含正在转录的rRNA）和颗粒成分（成熟的核糖体亚单位前体颗粒）。2.2.4细胞的增殖与调控1、细胞分裂：（1）无丝分裂（直接分裂，directdivision）：胞核拉长，核中间断裂，胞质一分为二。低等动物、植物胚乳发育、动物上皮组织、疏松结缔组织、肌肉组织、肝细胞有无丝分裂。优势：分裂快、能耗少、分裂中细胞功能继续发挥——利于细胞对外界环境变化作出迅速反应。缺陷：遗传物质不能有效均等分配。（2）有丝分裂（mitosis)：有丝分裂器：星体、纺锤体、染色体。染色体移动之动力——

？（两极远离、微管滑动和解聚）（3）减数分裂（meiosis）：前期I：细线期、偶线期（联会，Z-DNA）、粗线期（P-DNA）、双线期(灯刷染色体，lampbrushchromosome)、终变期。Z-DNA？

P-DNA？lampbrushchromosome？（4）减数分裂的意义？（5）有丝分裂与减数分裂的比较？2.2.4细胞的增殖与调控2、细胞周期及其调控：（1）细胞周期；G1、S、G2、M期（2）细胞周期调控：

1971年（Masui等）发现成熟促进因子（maturation-promotingfactor,MPF）,1977年科学家发现第一个细胞分裂周期基因（Cdk基因），随后发现细胞周期蛋白（cyclin）,1988年（Lohka）纯化了MPF。

MPF：由Cdk1（催化亚基）和cyclinB（调节亚基）组成。

P53、P21椰油调节作用。泛素——蛋白酶水解系统水解参与细胞周期的特定蛋白质。MG1SG2G0Cdk1-cyclinBCdk4-cyclinDCdk6-cyclinDCdk2-cyclinECdk2-cyclinACdk1-cyclinA细胞周期各时相调控分子MPF组图2.2.5细胞分化1、细胞分化的概念：细胞分化（celldifferentiation）：同型的胚胎细胞，在细胞分裂、发育过程中，形态结构、生化组成、生理过程上产生专一性和特异性的现象，称细胞分化。是细胞功能和形态逐渐转化、产生稳定组织差异的过程。2、细胞的全能性（totipotency）：生物的每一个细胞经过分裂和分化后，仍然保持发育成完整个体的潜在能力，这种特性称细胞的全能性。证明：植物单细胞培养成完整植株，哺乳动物体细胞核移植克隆。细胞的全能性为开展细胞工程研究提供了广阔空间。3、细胞分化的分子基础：细胞决定（determination）：细胞的分化可被识别之前，细胞沿着特定方向变化的能力已经被提前赋予了，这种现象称细胞决定。是细胞分化潜能逐渐受限的过程。分化的本质：细胞按一定的时空顺序差异基因表达（differentialgeneexpress）。奢侈基因（luxurygene）,持家基因（house-keepinggene）。2.2.5细胞分化4、影响细胞分化的因素：

(1)胞外信号分子的诱导作用（一部分细胞对周围细胞的分化诱导）：如成纤维细胞生长因子（FGF）、转化生长因子(TGF)。（2）激素的诱导：（3）细胞质的不均一性：如卵和受精卵。（4）“位置效应”：细胞在组织和机体内的位置影响其分化。（5）外部环境条件对分化的影响：如早期胚胎中，胚胎表面的细胞→滋养外胚层，内部的细胞→内细胞团（将形成胚胎）。动物卵细胞未经排卵而被激活，将在卵巢中异位发育成畸胎瘤。2.2.6细胞的衰老与死亡1、细胞衰老（cellularaging,cellsenescence)：（1）概念：细胞的形态、结构和生理功能出现逐渐退行性变化的现象，称细胞衰老。是机体衰老、老年病的发病基础。本质是细胞是有寿命的。（2）Hayflick界限（Hayflick等，1961）：细胞，特别是培养细胞是有寿命的，其增殖能力有一定的界限。主要体现在细胞分裂的有限性。人二倍体细胞40~60次传代。培养细胞的传代次数与动物的寿命呈正相关：小鼠寿命3年，细胞可传12代；鸡30年，25代；龟200年，140代。细胞传代数与细胞来源个体的年龄呈负相关：如新生儿的细胞可传20~40代，成年人的成纤维细胞20~30代。（3）细胞衰老的特征：人类的衰老特征：头发变白，牙齿脱落，肌肉松弛，血管硬化，感觉迟钝和记忆力减退等。细胞的衰老特征：水分减少，硬度增加，代谢趋缓，出现脂褐质（不溶性的脂蛋白颗粒），核固缩，细胞膜变厚，膜的流动性下降，膜性细胞器减少并肿胀崩解等。2.2.6细胞的衰老与死亡2、细胞衰老的理论：导致细胞衰老的原因——“程序假说”、“错误累积假说”（1）“程序假说”：人类的细胞分裂50~60次后便停止分裂，机体组织便呈现出衰老和机能低下的状态。端粒（染色体两端的特殊序列）—控制细胞分裂次数的时钟——随着细胞的分裂而变短，短到一定长度的细胞便停止分裂。（2）“错误累积假说”：因紫外线、活性氧和有害物质的损害，DNA会发生异常变化，DNA在复制时就会产生错误。随着错误的累积，则产生异常蛋白质，细胞机能低下、不能继续分裂，呈现衰老迹象。癌细胞可“无限”重复分裂，不会衰老，其原因成为不让正常细胞衰老的重要研究线索。2.2.6细胞的衰老与死亡3、衰老的研究进展：P16

基因、端粒长度的控制。（1）P16

基因：细胞衰老的主导基因。细胞周期负调控因子。抑制细胞周期蛋白依赖激酶CDK4和CDK6，使细胞周期停滞于G1期。我国科学家的原创性贡献。P16

基因导入人成纤维细胞，其衰老加快，将其反义重组载体导入则抑制P16

，细胞较长时间维持在年轻态，细胞增殖和DNA修复能力加强。P16

基因在衰老过程中持续高表达（高于年轻细胞10~20倍）。（2）端粒（telomere）和端粒酶（telomerase）：端粒：染色体两端的特化结构。富含G的短的串联重复序列DNA组成。一个基因组中的所有端粒都由相同的重复序列组成（不同物种则不同）。脊椎动物中的保守序列是TTAGGG，串联重复500~3000次，长度2kb~20kb。作用：染色体的完整性和个体性，与染色体在核内的空间分布及同源染色体配对有关。端粒酶：是核糖核蛋白复合物，逆转录酶活性。以物种专一RNA作摸板，将合成的端粒重复序列再加到染色体3‘端。2.2.6细胞的衰老与死亡端粒和端粒酶与衰老的关系：端粒：有分裂计时器的作用。体内外的体细胞每分裂一次，端粒的重复序列就缩短一些。端粒酶活性：人生殖细胞和干细胞具有而体细胞不具有；永生细胞及恶性肿瘤细胞具有。在正常人体细胞中，制造这种酶的基因处于完全关闭的状态。癌细胞和生殖细胞中能发现这种酶，所以细胞分裂能无限的进行下去。有关思考：（1）端粒酶可延长细胞寿命，但不能长生不老。（2）“错误的累积”？（3）不发生分裂的（神经、心肌）细胞的寿命？（4）mtDNA的突变？（5）应是体内外多种因素的综合作用导致衰老。2.2.6

细胞的衰老与死亡4、细胞死亡(celldeath)：坏死(nedrosis)和凋亡(apoptosis)

（1）细胞死亡的标志：死亡的细胞：膨胀、染色质不可逆凝缩、pH下降、细胞溶解。调亡的突出特征之一：钙镁依赖性核酸内切酶被激活—DNA的有控裂解——电泳时形成“梯形带状电泳图谱”；微绒毛消失、染色质固缩沿核膜分布、钙离子升高、转谷氨酰胺酶高。（2）细胞死亡的机制：原癌基因c-myc加生长刺激物→细胞繁殖，无生长刺激物则启动细胞凋亡程序；原癌基因bcl-2（26kDa的蛋白质）抑制细胞凋亡不刺激分裂；26kDa的蛋白质抑制辐射、对抗激素、细胞因子、抗体等对细胞凋亡的启动作用；肿瘤抑制基因

p53的诱导表达提高凋亡率。（3）细胞凋亡：或程序性细胞死亡（programmedcelldeath,PCD）与坏死不同，是细胞自主性的受基因调控的细胞死亡形式，贯穿个体生长、发育、死亡全过程，是维持机体正常生命活动的基本方式。三类基因参与细胞凋亡：促进凋亡的基因、抑制凋亡的基因、在凋亡中表达的基因（密切相关）。胞内钙离子快速持续增高，是凋亡的信号之一。2.2.6细胞的衰老与死亡

（4）研究细胞死亡的意义：细胞死亡：外界因素和环境变化所致；“程序性细胞死亡”。“程序性细胞死亡”：“自杀行为”，似乎按预先编制的“程序”进行。意义：该死亡的细胞没有死亡，可能导致细胞恶性增长，形成肿瘤；不该死亡的细胞过多死亡，可导致机体功能缺损（如艾滋病毒攻击淋巴细胞）；了解细胞死亡的机理，可干预细胞死亡，治疗疾病；细胞工程中期望延长培养细胞的存活时间，从而提高产物的表达量。2.3生物个体发育基础

个体发育：个体发生、发展和变化的总称。包括胚胎发育和胚后发育两个阶段。胚胎发育：受精卵在卵膜或母体内分裂、分化、发展，形成幼小个体的过程。胚后发育：幼体从卵膜孵化或从母体分娩后，经幼年、成年、老年到衰老的过程。发育生物学：？2.3生物个体发育基础2.3.1组织和器官受精卵经分裂分化，形成不同的细胞群。细胞群和细胞间质→组织（tissue），不同组织有机结合→器官(organ)，执行特殊功能的不同器官结合在一起→系统(sistem)。高等生物各组织器官紧密结合、相互联系、协调统一。

2.3.1.1植物的组织器官：（1）植物的组织：分生组织和永久组织。分生组织：保持分裂能力和未分化状态的细胞团。

2.3生物个体发育基础2.3.1.1植物的组织和器官植物的初生分生组织：顶端（根尖和茎尖）植物的次生分生组织：已成熟的薄壁组织恢复分裂能力转化而来。如侧生分生组织（形成层）。永久组织：细胞经分化，逐步丧失分裂能力具特定功能的细胞群。主要包括：基本组织（薄壁组织、厚壁组织、厚角组织等）、机械组织、保护组织、输导组织和分泌组织。（2）植物的器官：营养器官：根、茎、叶。功能？生殖器官：花、果实（裸子植物无）和种子。功能？2.3生物个体发育基础2.3.1.2动物的组织系统（1）动物的组织：上皮组织：排列紧密，覆于体表和体内囊、管、腔的内表面。结缔组织：细胞间质丰富，细胞分散。如血夜、淋巴、骨骼等。肌肉组织：肌肉细胞组成。横纹肌、平滑肌、心肌。神经组织：神经元和神经胶质细胞组成。（2）动物的系统：体被、骨骼、肌肉、消化、呼吸、循环、泌尿、生殖和内分泌10大系统。各系统的器官与功能？2.3.2生殖与发育

(ReproductionandDevelopment)

2.3.2.1生殖：无性生殖（asexualreproduction）：裂殖、出芽、断裂、形成孢子及营养繁殖等形式。有性生殖（sexualreproduction）：两个亲本参与，有生殖细胞形成。卵式生殖是有性生殖的最高形式。个体的变异性和多样性增加了，物种适应范围扩大了。（1）生殖细胞的发生过程：减数分裂？减数分裂的意义？（2）受精（fertilization）：动物体内和体外受精、避免异种和多精受精。植物？被子植物的双受精？2.3.2生殖与发育2.3.2.2发育：（1）胚胎发育：卵裂和桑葚胚、囊胚、原肠胚期、神经轴胚（胚体背部中轴器官——脊索和神经管；滋养层细胞→绒毛膜；内胚层→卵黄囊和羊膜腔，外胚层→神经管）、器官发生。（2）胚后发育：生长发育（生长——体积和重量的增加，发育——结构和功能的变化）、衰老、死亡。2.4胚胎细胞工程基础

胚胎工程（embryoengineering）或胚胎生物工程（embryo

bioengineering）：人为干预配子或胚胎，使其环境因素、发育模式或局部组织功能发生量与质的变化，并为人们所利用的一类技术。胚胎体外发育研究取得了一系列的进展，已产生一批很实用的胚胎生物工程技术，业已显示较好的广泛应用前景。2.4胚胎细胞工程基础2.4.1生殖细胞的发生：

1、生殖细胞的来源：哺乳动物的原始生殖细胞（primoordialgermcell,PGC）变形运动→背肠系膜→定位生殖腺原基（中肾内侧与背肠系膜间的生殖脊）→生殖细胞（精子和卵子）。

PGC定向迁移的机理：（1）生殖脊的吸引；（2）迁移途径周围细胞的细胞外基质（如纤连蛋白，fibronectin,FN）的作用；（3）迁移途径周围细胞的一些细胞生长因子的作用。生殖脊→雄性的睾丸和雌性的卵巢。2.4胚胎细胞工程基础2.4.1生殖细胞的发生：2、精子的发生及其结构调整：（1）精子发生：精原细胞（紧靠曲细精管的基膜）的增殖和更新→精母细胞，复制一次→初级精母细胞，经减分Ⅰ→次级精母细胞，经减分Ⅱ→1n的精子细胞，经变态→精子。有严格的同源群现象和周期性变化规律（生精上皮周期）。由基膜向管腔依次排列：生精细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞、分化中的精子。2.4胚胎细胞工程基础2.4.1生殖细胞的发生：2、精子的发生及其结构调整：（2）精子形成：精子细胞分化成精子时：体积减小；染色体包装更严密，与遗传传递无直接关系的RNA和非组蛋白等从核中被替代；核蛋白成分明显变化，碱性蛋白与DNA结合；高尔基体→精子顶体；中心粒位移；细胞质丢失，精子获得高度运动能力。2.4胚胎细胞工程基础2.4.1生殖细胞的发生：2、精子的发生及其结构调整：（3）精子发生的调控：激素与细胞因子：LH、FSH（垂体分泌）、睾丸酮（睾丸间质细胞分泌）促进精子发生。生长因子如IGF、TGF、EGF、NGF等（自分泌和旁分泌的作用）局部调节精子发生中的细胞增殖、减数分裂和分化。基因调控：睾丸特异性基因，如原癌基因C-kit、减数分裂基因SCP3等，表达，控制精子设法。2.4胚胎细胞工程基础2.4.1生殖细胞的发生：3、卵子发生、结构及调整：（1）卵子发生：哺乳动物新生胎儿即有一定数量处于前期Ⅰ的卵母细胞。性成熟后，卵母细胞开始生长发育，部分成熟，其余退化。因此，由于卵泡闭锁退化，卵母细胞数不断下降（精原细胞分裂永不间断）。2.4胚胎细胞工程基础

胎儿期PGC形成卵原细胞。出生前后，卵原细胞分化，进入前期Ⅰ成为初级卵母细胞。性成熟后，在神经和激素的诱导下，完成减数分裂Ⅰ成为次级卵母细胞，并继续完成减数分裂Ⅱ成为成熟卵母细胞（卵子）。卵泡：原始卵泡（新生儿卵巢皮质层中）、生长卵泡（性成熟起原始卵泡生长发育而成，包括初级和次级卵泡）、成熟卵泡（卵泡不断增大，卵泡液增多，卵泡壁变薄，卵巢表面突出）。2.4胚胎细胞工程基础2.4.1生殖细胞的发生：3、卵子发生、结构及调整：（2）卵子的结构：各种哺乳动物卵子大小差别大一般60~90微米。光镜下，小鼠、大鼠、兔、人的卵子较透明，猪、犬的非常暗。基本结构相似：有透明带、放射冠、特有的细胞质结构和核。

特有的细胞质结构？意义？应用？2.4胚胎细胞工程基础2.4.1生殖细胞的发生：3、卵子发生、结构及调整：（3）卵子发生的调控和基因表达：调控：促性腺激素释放素（下丘脑）→垂体→促性腺激素（FSH、LH）→性腺卵巢→卵子生长和排卵，分泌孕酮和雌激素。基因表达：卵母细胞及其雌体体细胞合成大量的RNA、蛋白质、核糖体等不均等分布于卵母细胞质中，支持和调控卵裂与早期胚胎发育。其他：钙调节素、MPF、cAMP、CSF等。2.4胚