《生物制药导论》 课件 第四章-生物药物分析

生物制药导论第四章生物药物分析生物药物分析的性质与任务生物药物分析：以分析化学、微生物学、生物化学、免疫学等多学科交叉为基础，研究生物药物质量控制和分析方法的学科基本任务：分析鉴定生物药物有效成分、化学结构，测定主要成分的生物活性、制剂中的细菌内毒素、相关物质及其降解产物含量等，全面控制产品的质量，保障患者用药的安全性。生物药物分析的质量检定内容理化检定：包括物理性状检查、蛋白质含量测定、防腐剂含量测定、纯度及鉴别试验等。安全性检定：包括外源性污染检查、杀菌灭活和脱毒检查、过敏性物质检查等。含量（生物效价）检定。生物药物分析技术以待测物质在特定能量作用下发生内部能级跃迁为基础建立的定性或定量分析方法，定量分析的理论基础为Lamber-Beer（朗伯-比尔）定律。光谱分析法利用物质对紫外光区（200~800nm）光辐射的吸收特性建立的定量方法。灵敏度：10-7~10-4g·mL-1适用范围：不饱和有机化合物紫外-可见吸收光谱法：①直接荧光分析法②间接荧光分析法又分为荧光衍生法和荧光猝灭法③其他荧光分析法荧光免疫分析、荧光探针标记等。荧光分析法：利用荧光物质的荧光发射波长和强度进行定性定量分析的方法。灵敏度：比紫外-可见分光光度法高2~4个数量级高效液相色谱法键合相色谱法不同组分因与固定相之间极性强弱不同而分离，根据固定相的极性强弱可分为正相键合相色谱法和反相键合相色谱法。液-固吸附色谱法利用样品组分与固定相的吸附作用不同而分离。固定相可分为极性和非极性两大类。离子对色谱法

将一种（或多种）与溶质分子电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物来控制溶质离子的保留行为。离子交换色谱法

离子交换树脂作为固定相，离子交换树脂上可交换的离子与流动相中具有相同电荷的样品离子发生可逆交换，利用不同组分离子对树脂的亲和力不同实现分离。亲和色谱法

将相互间具有高度特异亲和性的两种物质之一作为固定相，利用与固定相不同程度的亲和性，使各组分分离。体积排阻色谱法依据相对分子质量的大小对待测物进行分离，常用于分离相对分子质量大的化合物。电泳分析法指带电供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性介质中，在电场的作用下，向对应的电极方向按各自的速度泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量(%)的方法。根据支持介质的不同可分为纸电泳法、醋酸纤维素薄膜电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和毛细管电泳法。DNA电泳谱图质谱分析法质谱是指在高能粒子束（电子、离子、分子等）作用下，将待测样品电离为带电离子，带电离子在电场或磁场的作用下，按照质荷比m/z进行分离，并依次排列而成的谱图。苯乙酮的质谱图酶分析法以酶为分析对象，根据需要对生物药物生产过程中所使用的酶和生物药物样品所含的酶进行含量或活力测定以酶为分析工具或试剂，测定生物样品中用一般理化方法难以测定的物质主要包括：终点法、反应速率法和酶循环放大法。生物学活性分析分子水平活性分析法基于分子间特异性、非共价和可逆相互作用建立的分析方法，主要基于生物药物与某种物质的结合或生物药物本身的化学反应，具有便于操作、精确、稳定等特点。常用方法：酶联免疫吸附法、分子相互作用分析法。生物学活性分析细胞水平活性分析法通过研究生物药物与特定细胞的相互作用，可从药物与细胞表面抗原的结合、药物对胞内信号通路的激活/阻断作用、药物对细胞生长的促进/抑制作用等方面对药物的生物学活性进行评价。常用方法：细胞水平结合活性、细胞增殖法、细胞毒性法、细胞因子分泌测定法、报告基因法等生物学活性分析动物水平活性分析法利用动物体内某些指标的变化测定药物生物学活性的动物实验方法，属生物检定法。常用方法：直接测定法、质反应测定法和量反应平行线法生物药物分析方法抗体药物分析抗体药物是一类通过人工合成的抗体来治疗疾病的药物，通过与目标分子特异性结合从而达到治疗的目的。抗体药物的质量管理分为原液和成品检定。成品检定是在原液检定的基础上，增设立制剂相关的检查项目，如制品外观（如颜色、澄清度、可见异物等）、复溶时间、装量差异、无菌检查等。原液检定项目包含抗体药物的鉴别、纯度和杂质、蛋白质含量、活性检测、宿主蛋白残留量、细菌内毒素等。其中，鉴别项包含N-末端氨基酸序列、糖基化修饰、等电点等结构相关确证项目。氨基酸序列测定常用肽图分析，其余各项多用电泳或色谱技术，如糖基化修饰常用毛细管电泳（CE）或高效液相色谱（HPLC）法等。核酸（mRNA）药物分析测序方法包括高通量测序技术（HTS）、SANGER测序、逆转录PCR(RT-PCR)等完整性检测方法主要是电泳法，包括毛细管电泳、毛细管凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳等。mRNA的转录具有很高的变异性，而其序列的正确性是其执行翻译功能的基本前提，因此有必要对mRNA进行测序以保证其序列的正确性和完整性抗生素类药物的分析抗生素化学结构的不同，可将其分为：β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类和其他抗生素（多肽类、酰胺醇类等）。鉴别、检查、含量测定生物药物分析新技术与新方法冷冻电镜技术Nat.Chem.Biol.,2020,16,231-239

单颗粒冷冻电镜技术利用的是电子显微镜的成像性质，通过将生物大分子的溶液样品快速投入至冷却到液氮温度的液态乙烷中，得到冰层厚度合适的冷冻样品，然后对冰层中均匀分布的生物大分子颗粒进行拍照。通过算法对拍到的上千张不同角度的二维照片进行分析，最终得到蛋白结构。荧光纳米探针技术常用策略：荧光猝灭荧光免疫分析荧光共振能量转移Nat.Mater.,2005,4,

826-831

生物芯片技术广义：可以检测生物信号、处理分析生物信息的芯片技术。狭义：将生物分子（寡核苷酸、互补DNA、多肽、蛋白质等），固定在固体芯片表面等载体上，并根据生物分子间特异相互作用，实现对核酸、蛋白质等生物分子检测的技术。

主要包括：基因芯片（DNA芯片）、蛋白质芯片、微流控芯片等质谱成像技术通过一些原位电离源，如解吸电喷雾电离源（DESI）、基质辅助激光解吸电离源（MALDI），与质谱相联，通过可视化的成像软件，使得被检测到的荷质比，根据含量不同通过不同强度的色彩呈现，进而提供化合物的位置信息。生物药物的质量控制生物药物的质量控制特点结构确认的不完全性质量控制的过程性生物活性检测的重要性生物药物的质量标准主要包括生物药物的理化性质鉴定、生物活性测定方法、杂质限度检测方法及其标准、标准品或者参考品、安全性评价等指标内容。生物药物的质量管理药物非临床研究质量管理规范（GoodLaboratoryPra