高中生物速解限制酶选择问题高二下学期生物人教版选择性必修3

高中生物速解限制酶选择问题一、限制酶的选择方法1、根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。(2)不能选择切点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。一、限制酶的选择方法2、根据质粒的特点确定限制酶的种类一、限制酶的选择方法3、根据Ti质粒的T­DNA片段选择限制酶图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：二、限制酶的选择原则——“一宜五不宜”二、限制酶的选择原则——“一宜五不宜”口诀原则应用一宜宜选用相同的酶或同尾酶切割载体和目的基因，使目的基因和质粒切割后产生相同的黏性末端或平末端五不宜①不宜破坏目的基因限制酶切割位点位于目的基因内部时，会切断目的基因，破坏目的基因的结构②不宜破坏质粒必要元件不破坏质粒上的启动子、终止子、复制原点、标记基因（只有一个时）等关键序列，如不能选择PstⅠ、KpnⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ，否则会影响质粒在受体细胞中的复制、目的基因的表达或受体细胞的筛选等二、限制酶的选择原则——“一宜五不宜”口诀原则应用五不宜③不宜使用单酶切防止目的基因、质粒的自身环化；避免目的基因与载体反向连接④不宜选择导致目的基因与载体反向连接的双酶切注意目的基因的转录方向，避免目的基因以相反方向连接到载体上。如图中，应选择NdeⅠ和XbaⅠ切割目的基因和质粒，不宜选择BamHⅠ和XbaⅠ切割⑤不宜选择酶切后产生无效切割的限制酶如不宜选择酶切位点不在启动子和终止子之间的限制酶，如不选XhoⅠ三、限制酶的选择典型例题1、(2023·全国新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是()A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接C三、限制酶的选择典型例题解析：只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，且E.coliDNA连接酶无法连接酶3切出的平末端，A不符合题意；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，两者切割后无法相互连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C符合题意；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D不符合题意。三、限制酶的选择典型例题2、(2025·陕西卷)马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。三、限制酶的选择典型例题（1）PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、________、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的________步骤中起作用。（2）图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的________（填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'-________-3'，切割载体时应选用的两种限制酶是________，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。（3）用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到________，抗性基因________可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经________形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。三、限制酶的选择典型例题答案：（1）4种脱氧核苷酸

延伸

（2）5'端AGATCTBamHⅠ、EcoRⅠ

（3）栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体DNA上2再分化三、限制酶的选择典型例题3、面肩肱型肌营养不良是一种罕见的神经肌肉疾病，该病是由DUX4基因突变产生对骨骼肌有毒的DUX4蛋白引起的。研究发现利用反义疗法可治疗该病，即将DUX4的反义基因导入患病组织，从而达到抑制DUX4基因表达的目的。构建DUX4反义基因表达载体的过程如下图所示，已知DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同，但转录的模板链不同。下列说法正确的是()A.利用图中质粒和DUX4基因构建反义基因表达载体时,应选择的限制酶为EcoRⅠ和XbaⅠB.可采用显微注射法将DUX4反义基因表达载体导入受精卵C.DUX4反义基因转录的mRNA可与DUX4基因转录的mRNA发生碱基互补配对，抑制翻译过程D.利用DUX4基因序列制备的引物进行PCR可检测DUX4反义基因是否正确插入质粒C三、限制酶的选择典型例题解析：DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同,但转录的模板链不同,因此DUX4的反义基因的模板链为DUX4基因的编码链,子链的延伸方向是5'→3',因此DUX4基因的右侧连接启动子、左侧连接终止子构建DUX4反义基因表达载体,选用的限制酶为HindⅢ和BamHⅠ,A项错误。当受体细胞为动物时可选用显微注射法,该病的治疗方式为将DUX4的反义基因导入患病组织,从而达到抑制DUX4基因表达的目的,因此可采用显微注射法将DUX4反义基因表达载体导入患病组织,B项错误。DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同,但转录的模板链不同。因此,DUX4反义基因转录的mRNA可与DUX4基因转录的mRNA发生碱基互补配对,从而抑制其翻译过程,导致DUX4蛋白无法合成,C项正确。由于DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同,因此,利用DUX4基因序列制备的引物进行PCR不能检测DUX4反义基因是否正确插入质粒,D项错误。三、限制酶的选择典型例题4、镉离子(Cd2+)是一种在环境中广泛存在的、易在体内蓄积的有毒重金属离子，对生态系统和人类健康构成严重威胁，因此Cd2+的检测就尤为重要。科研人员将Cd响应启动子czcR3与绿色荧光蛋白基因(GFP)组合在一起导入大肠杆菌，构建可对Cd2+响应的大肠杆菌传感器，其原理和构建过程分别如图1、图2所示。已知CadR基因与启动子a相连，czcR3可启动下游基因的表达，P1、P2、P3均为引物。回答下列问题。图1图2三、限制酶的选择典型例题(1)据图1分析,CadR基因的表达是否受Cd2+的诱导?

(填“是”或“否”)，判断依据是

。(2)据图2分析,应选用限制酶

切割目的基因,以实现质粒与目的基因的高效重组。重组后利用PCR技术扩增GFP基因时,应选择引物P1和

。已知GFP基因转录得到的RNA中缺乏起始密码子AUG,为了保证GFP基因能被限制酶识别且能正常表达,应该在引物P1的5'端增加的碱基序列为

。(3)为筛选出能导入重组质粒并且成功表达目的基因的目标菌,可以将转化后的大肠杆菌接种到含有

和

的培养基上,观察菌落是否有绿色荧光出现。限制酶识别序列及切割位点：MunⅠ5'-C↓AATTG-3'；XhoⅠ5'-C↓TCGAG-3'；EcoRⅠ5'-G↓AATTC-3'；SalⅠ5'-G↓TCGAC-3'。三、限制酶的选择典型例题答案：(1)否

无论是否有Cd2+存在，CadR基因都会表达出相应的蛋白质(2)EcoRⅠ和SalⅠP25'-GAATTCATG-3'(3)四环素Cd2+(顺序可互换)解析：(1)无论是否有Cd2+存在，CadR基因都会表达出相应的蛋白质，因此CadR基因的表达不受Cd2+的诱导。(2)分析图2可知，切割质粒时应使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ，限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶XhoⅠ和SalⅠ切割后形成的黏性末端也相同。限制酶MunⅠ会破坏目的基因，若只使用限制酶EcoRⅠ切割目的基因会导致目的基因自身环化，因此为实现质粒与目的基因的高效重组，应使用限制酶EcoRⅠ和SalⅠ切割目的基因。重组后利用PCR技术获取GFP基因时，应选择引物P1和P2。结合题图分析可知，为了保证GFP基因能被限制酶(EcoRⅠ)识别且能正常表达，应在引物P1的5'端增加碱基序列5'-GAATTCATG-3'。(3)若重组质粒成功导入目标菌，且目的基因成功表达，则该目标菌会生成抗四环素的物质，且GFP基因可正常表达。为筛选出能导入重组质粒并且成功表达目的基因的目标菌，可以将转化后的大肠杆菌接种到含有四环素和Cd2+的培养基上，观察菌落是否有绿色荧光出现。三、限制酶的选择典型例题小结：选择限制酶的“两技巧”双酶切法:通过使用双酶切法切割目的基因和载体，可有效防止目的基因环化，避免其自身的黏性末端互补连接形成环状结构；同时，能确保目的基因与载体连接时的方向正确，使目的基因在导入受体细胞后能按照预期方向进行转录和表达。此外，通过选择合适的限制酶组合，能够更精确地控制基因的切制和连接过程,进而提高基因重组的效率和准确性。同尾法:在构建基因表达载体时，当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端，这增加了限制酶选择的灵活性，同尾酶法能够在一定程度上满足实验对限制酶的特殊需求，有助于提高实验的效率和成功率。四、限制酶的选择练习题牛刀小试1.花青素在植物抗逆和预防人类慢性疾病中起着重要作用。研究推测拟南芥中AtMYBL2基因缺失与植株花青素合成量显著增加有关。研究者在验证该推测的过程中，利用基因工程设计了重组DNA(质粒三)。下列分析错误的是()CA.“质粒二”利用BamHI开环B.该基因工程中，“目的基因"是AtMYBL2基因C.构建质粒三时，最好在A、B两端分别加BamHI、Ecl136Ⅱ的识别序列D.对于培育成功的拟南芥转基因植株，“发卡”在细胞内可以阻止翻译过程四、限制酶的选择练习题解析：A.据图可知，“质粒二”开环后两侧均有BamHI的切割位点，因此“质粒二”开环所用酶是BamHI；B.根据题图可知，该基因工程设计出的质粒三会表达出双链RNA，导致双链RNA、mRNA被降解，即目的基因不能表达，由题意可知，该研究推测AtMYBL2基因缺失与植株花青素合成的关系，故“目的基因”应为AtMYBL2基因；C.图中质粒二开环后的目的基因两侧存在Ecl136Ⅱ、BamHI的切割位点，所以为保证第二个目的基因反向连接，构建质粒三时，最好在第二个目的基因的A、B两端分别加Ecl136Ⅱ、BamHI的识别序列；D.由图可知，培育成功的拟南芥转基因植株可合成双链RNA、mRNA，即可以转录，但“发卡”的形成会导致双链RNA、mRNA被降解，因此“发卡”在细胞内阻止的是翻译过程。四、限制酶的选择练习题牛刀小试2.为了进一步提高番茄的储藏时间，可从该植物体内提取Ers1基因(乙烯受体基因)，按照下图所示流程将Ers1基因重新导回该植物，致使该植物原有Ers1基因翻译受抑制。已知限制酶EcoRI和XhoI、BamHI切割后露出的黏性末端碱基序列不同，据图分析，提取的目的基因A、B两端需分别添加