2026年大学第二学年(生物制药)疫苗制备工艺综合测试题及答案

2026年大学第二学年(生物制药)疫苗制备工艺综合测试题及答案一、单项选择题（本大题共15小题，每小题2分，共30分。每小题只有一个正确选项，请将正确选项的字母填在括号内）1.在疫苗制备工艺中，用于灭活病毒或细菌毒素最常用的化学试剂是（）。A.乙醇B.甲醛溶液C.氢氧化钠D.青霉素2.mRNA疫苗制备过程中，除了编码抗原的mRNA序列外，包裹mRNA的脂质纳米颗粒（LNP）中起关键辅助递送作用的脂质成分不包括（）。A.可电离阳离子脂质B.辅助脂质（如DSPC）C.胆固醇D.磷脂酰甘油（不带PEG修饰）3.在利用大肠杆菌表达系统制备重组亚单位疫苗（如乙肝疫苗）时，表达产物往往以包涵体形式存在，后续工艺中必须进行的步骤是（）。A.亲和层析B.复性C.离子交换层析D.超滤4.冻干（冷冻干燥）工艺在疫苗生产中广泛应用，其主要目的是为了（）。A.提高疫苗抗原含量B.增加疫苗的免疫原性C.提高疫苗的热稳定性，便于冷链运输D.灭活可能污染的细菌5.在病毒性疫苗的细胞培养工艺中，贴壁细胞培养（如Vero细胞）常用的生物反应器是（）。A.搅拌式生物反应器B.气升式生物反应器C.中空纤维生物反应器或转瓶D.填充床反应器6.蛋白质纯化过程中，根据蛋白质分子大小进行分离的方法是（）。A.离子交换层析B.凝胶过滤层析（分子筛层析）C.亲和层析D.疏水相互作用层析7.佐剂铝佐剂（氢氧化铝或磷酸铝）增强免疫应答的主要机制是（）。A.直接激活T细胞B.形成抗原储存库，产生抗原递呈效应C.诱导产生高滴度的IgE抗体D.完全替代抗原的作用8.在流感疫苗的全病毒灭活工艺中，为了破坏病毒的感染性但尽可能保持其抗原结构，通常使用的裂解剂是（）。。A.TritonX-100B.SDSC.脱氧胆酸钠D.Tween-809.疫苗生产过程中的质量控制（QC）环节，用于检测疫苗中细菌内毒素污染的方法是（）。A.ELISAB.鲎试剂法（LAL法）C.PCR法D.细菌培养法10.在减毒活疫苗的生产中，种子批系统分为三级，其中用于实际生产疫苗的种子批是（）。A.原始种子批B.主种子批C.工作种子批D.最终种子批11.关于结合疫苗（如肺炎球菌结合疫苗）的制备工艺，下列描述错误的是（）。A.需要将多糖抗原与载体蛋白共价结合B.结合反应通常需要使用连接剂（如己二酸二肼ADH）C.目的是将T细胞非依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗原D.结合后不需要纯化即可分装12.在层析纯化工艺中，分辨率（Rs）是衡量分离效果的重要指标，当Rs大于多少时，认为两个峰达到基线分离？（）。A.0.5B.1.0C.1.5D.2.013.腺病毒载体疫苗生产中，为了去除宿主细胞DNA（HCD），通常会加入核酸酶进行处理，该酶通常是（）。A.限制性内切酶B.Benzonase（Benzonase核酸内切酶）C.DNA聚合酶D.连接酶14.疫苗生产车间按照GMP要求，洁净区空气洁净度级别最高的是（）。A.D级B.C级C.B级D.A级15.在疫苗效力检测中，常用的半数有效量计算方法是（）。A.Reed-Muench法B.Lowry法C.Bradford法D.Scatchard法二、多项选择题（本大题共10小题，每小题3分，共30分。每小题有两个或两个以上正确选项，多选、少选、错选均不得分，请将正确选项的字母填在括号内）1.下列关于疫苗制备上游工艺中培养基优化的叙述，正确的有（）。A.无血清培养基可以降低下游纯化过程中血清蛋白去除的难度B.灌流培养可以提高细胞密度和产物表达量C.pH和溶氧（DO）是细胞培养过程中需要实时监控的关键参数D.批次培养比连续培养更容易实现自动化控制2.疫苗纯化工艺中常用的层析技术包括（）。A.离子交换层析B.亲和层析C.疏水层析D.纸色谱3.关于mRNA疫苗的生产工艺，下列步骤描述正确的有（）。A.需要使用体外转录（IVT）技术合成mRNAB.合成的mRNA需要进行加帽和加尾修饰以提高稳定性C.纯化过程中需要去除双链RNA（dsRNA）等杂质D.LNP制备通常采用微流控技术实现混合4.疫苗生产中，灭活工艺验证必须包含的内容有（）。A.确定灭活剂的种类和浓度B.确定灭活温度和时间C.证明灭活效果的彻底性（无任何活病毒残留）D.灭活后抗原免疫原性的保持5.下列哪些属于病毒性疫苗生产中常用的细胞基质？（）。A.Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）B.CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）C.MDCK细胞（犬肾细胞）D.鸡胚成纤维细胞6.在疫苗成品分装前，必须进行的除菌过滤工艺要求包括（）。A.过滤器必须进行完整性测试（起泡点测试或扩散流测试）B.通常使用0.22μm孔径的除菌级滤芯C.过滤器必须能重复使用以降低成本D.过滤器需进行相容性验证7.下列关于疫苗稳定性研究的说法，正确的有（）。A.包括实时稳定性研究和加速稳定性研究B.需考察不同温度条件下的效力滴度变化C.只需考察成品，原液和半成品无需考察D.外观、pH值也是重要的稳定性指标8.结合疫苗制备中，常用的载体蛋白有（）。A.破伤风类毒素（TT）B.白喉类毒素（DT）C.CRM197（白喉毒素突变体）D.牛血清白蛋白（BSA）9.影响层析柱载量的因素有（）。A.样品流速B.样品浓度C.树脂的类型和粒径D.上样缓冲液的离子强度和pH值10.疫苗生产过程中的废弃物处理，必须遵循的原则有（）。A.活毒、活菌操作必须在与外界隔离的区域进行B.废弃物排出前必须经过灭活处理C.废液可以直接排入城市下水道D.固体废弃物需按医疗废物处理三、填空题（本大题共10空，每空1分，共10分。请将答案写在横线上）1.在疫苗制备中，用于去除热原质的常用层析方法之一是__________，因为热原质通常带有负电荷。2.重组乙型肝炎疫苗的主要抗原成分是__________，它是一种具有免疫原性的病毒亚单位颗粒。3.在细胞大规模培养中，当细胞密度较高时，为了防止营养耗竭和代谢产物积累，常采用__________培养模式，不断添加新鲜培养基并移除旧培养基。4.脊髓灰质炎疫苗的生产中，I型、II型、III型病毒通常采用__________细胞进行培养。5.疫苗佐剂MF59是一种__________佐剂，其主要成分是角鲨烯。6.在蛋白质纯化中，利用蛋白质表面疏水区域与固定相上的疏水基团相互作用的层析法称为__________。7.冻干过程中，预冻阶段的温度通常必须低于产品的__________，以确保溶液完全冻结。8.疫苗生产中的__________是指将原料药（原液）与稀释剂、佐剂等混合，配制成最终规格产品的过程。9.检查疫苗中是否含有支原体污染，常用的方法包括培养法和__________法。10.在计算病毒滴度时，常用的单位是__________，即半数组织培养感染量。四、名词解释（本大题共5小题，每小题4分，共20分）1.种子批系统2.佐剂3.层析4.灭活5.生物反应器五、简答题（本大题共3小题，每小题10分，共30分）1.简述重组亚单位疫苗（以乙肝疫苗为例）从上游表达系统到下游纯化的主要工艺流程及关键控制点。2.比较微流控技术与薄膜挤出法在制备脂质纳米颗粒（LNP）时的优缺点。3.简述病毒性疫苗生产中，如何进行细胞培养过程的污染监控与防治。六、综合应用题（本大题共2小题，每小题35分，共70分）1.某生物制药公司正在开发一款基于重组新冠病毒S蛋白的亚单位疫苗。已知该蛋白在CHO细胞中表达，目标是将表达上清液中的目标蛋白纯化至95%以上的纯度，并保留其三聚体构象。请设计一套详细的下游纯化工艺方案。要求：(1)列出至少三个纯化步骤，并说明每步骤的目的。(2)针对三聚体构象的保持，说明在缓冲液设计和操作条件上需要注意的事项。(3)如果在离子交换层析步骤中发现目标蛋白穿透（出现在流穿液中），可能的原因有哪些？如何解决？2.某疫苗生产车间在进行一批流感病毒裂解疫苗的生产。工艺流程为：鸡胚接种->孵育->收获尿囊液->灭活->超速离心->裂解->层析纯化->配制->分装。在该批次生产中，QC部门在成品放行检测时发现，该批疫苗的卵清蛋白（OVA）残留量超出药典规定的标准。请分析：(1)卵清蛋白残留超标的根本原因可能出现在哪些工艺环节？(2)为了降低卵清蛋白残留，应该对现有工艺进行哪些优化或增加哪些步骤？(3)除了卵清蛋白残留，流感疫苗还需重点控制哪些外源因子残留？请列举至少三种。参考答案及详细解析一、单项选择题1.【答案】B【解析】甲醛溶液（福尔马林）通过与蛋白质的氨基发生交联反应，破坏病毒或细菌毒素的核酸及蛋白结构，从而使其失去感染性或毒性，同时保留其免疫原性，是经典的灭活剂。乙醇通常用于消毒，氢氧化钠用于调节pH或清洗，青霉素是抗生素。2.【答案】D【解析】LNP通常由四种脂质组成：可电离阳离子脂质（关键成分，负责包裹mRNA）、辅助脂质（如DSPC，稳定结构）、胆固醇（调节膜流动性）和PEG化脂质（提高稳定性，防止聚集）。磷脂酰甘油不是LNP的标准必需组分，且未提及PEG修饰。3.【答案】B【解析】大肠杆菌表达的重组蛋白常形成不溶性的包涵体，无生物活性。为了获得具有正确构象和免疫原性的蛋白，必须先变性溶解包涵体，再通过复性工艺使其重新折叠。4.【答案】C【解析】冻干通过升华去除水分，极大地降低了水分对蛋白质降解和水解的催化作用，从而显著提高疫苗的热稳定性，使其在2-8°C甚至更高温度下能长期保存，便于缺乏超低温冷链的地区运输。5.【答案】C【解析】Vero细胞等贴壁依赖性细胞需要贴附在固体表面生长。传统的转瓶工艺常用，大规模生产中常使用微载体培养结合搅拌式生物反应器，或者专门用于贴壁细胞的中空纤维生物反应器及固定床反应器。单纯的搅拌式反应器适用于悬浮细胞。6.【答案】B【解析】凝胶过滤层析（分子筛）是根据分子量大小进行分离的，大分子先流出，小分子后流出。离子交换层析依据电荷差异，亲和层析依据特异性生物亲和力，疏水层析依据疏水性。7.【答案】B【解析】铝佐剂主要通过吸附抗原，在注射部位形成“抗原储存库”，缓慢释放抗原，从而持续刺激免疫系统，并促进抗原递呈细胞（APC）的摄取。8.【答案】A【解析】在裂解疫苗工艺中，TritonX-100是一种非离子型表面活性剂，常用于裂解病毒包膜，暴露内部抗原，同时相对温和，不易破坏抗原表位。SDS是强变性剂，通常不用于疫苗制备。9.【答案】B【解析】鲎试剂法利用鲎血变形细胞溶解物与内毒素发生凝胶反应的原理，是检测细菌内毒素最灵敏、最专一的方法。ELISA用于抗原/抗体检测，PCR用于核酸，细菌培养用于活菌。10.【答案】C【解析】种子批系统：原始种子批（PrimarySeedLot）->主种子批（MasterSeedLot）->工作种子批（WorkingSeedLot）。工作种子批是从主种子批扩增而来，直接用于实际生产。11.【答案】D【解析】结合疫苗制备中，多糖与载体蛋白结合后，反应混合物中会含有未反应的多糖、载体蛋白、连接剂等杂质，必须经过多步纯化（如超滤离心、层析）去除杂质，获得纯化的结合物原液。12.【答案】C【解析】在层析中，分辨率Rs=2(13.【答案】B【解析】Benzonase是一种非特异性内切酶，能降解所有形式的DNA和RNA（单链、双链、线性、环状），且在下游纯化中易于通过离子交换或亲和层析去除，是生物制药中去除宿主核酸的标准工具。14.【答案】D【解析】GMP洁净区按悬浮粒子数和微生物数分为A、B、C、D四级。A级为高风险操作区（如灌装、无菌连接），洁净度最高（静态下100级/ISO5）。15.【答案】A【解析】Reed-Muench法是病毒学中用于计算病毒滴度（如TCID50、二、多项选择题1.【答案】ABC【解析】无血清培养基消除了血清来源的动物源性污染风险并简化纯化（A对）。灌流培养通过持续换液维持高细胞密度和高产物表达（B对）。pH和DO是维持细胞活性的核心参数（C对）。连续培养虽然难以长期维持遗传稳定性，但批次培养并不比连续培养“更容易”实现自动化，两者均可自动化，且连续培养自动化要求更高。D选项表述不准确。2.【答案】ABC【解析】离子交换、亲和层析、疏水层析是疫苗（蛋白/多肽类）纯化的三大主力层析技术。纸色谱主要用于分析化学分离，不适用于工业化制备纯化。3.【答案】ABCD【解析】mRNA疫苗制备涵盖体外转录（IVT）（A）、加帽（Cap1）和加尾（PolyA）修饰（B）、去除dsRNA等副产物（C）、以及微流控技术混合脂质与mRNA制备LNP（D）。4.【答案】ABCD【解析】灭活工艺验证必须全面：确定灭活剂种类浓度（A）、温时条件（B）、验证灭活彻底性（C，这是核心），以及确认灭活后抗原结构未被破坏，保留免疫原性（D）。5.【答案】ABCD【解析】Vero、MDCK、CHO均为传代细胞系，广泛用于疫苗生产。鸡胚成纤维细胞（CEF）是原代细胞，用于生产麻疹、风疹等疫苗。6.【答案】ABD【解析】除菌过滤前必须进行完整性测试（A），使用0.22μm滤芯（B），过滤器需与产品相容（D）。除菌级滤芯通常为一次性使用，重复使用存在无法彻底灭菌和完整性破坏的风险，C错。7.【答案】ABD【解析】稳定性研究包括实时和加速（A），考察不同温度（B），外观和pH也是关键指标（D）。稳定性研究需涵盖原液、半成品及成品，C错。8.【答案】ABC【解析】破伤风类毒素（TT）、白喉类毒素（DT）及其无毒突变体CRM197是结合疫苗中最成熟的载体蛋白。BSA虽可用作载体，但在人用疫苗中因过敏风险较少使用。9.【答案】ABCD【解析】流速影响接触时间和传质（A）；浓度影响动态载量（B）；树脂性质决定了静态载量（C）；上样缓冲液的离子强度和pH直接影响蛋白与树脂的结合强弱（D）。10.【答案】ABD【解析】生物安全原则：密闭操作（A），灭活后排放（B），按医疗废物处理（D）。废液绝对不能直接排入下水道（C错）。三、填空题1.【答案】阴离子交换层析【解析】热原质（内毒素）脂多糖（LPS）带有大量的负电荷，在生理pH下，阴离子交换层析可以吸附蛋白，让内毒素流穿；或者在特定条件下吸附内毒素。2.【答案】乙型肝炎表面抗原【解析】HBsAg是乙肝病毒的外膜蛋白，重组乙肝疫苗即通过表达HBsAg颗粒（22nm亚病毒颗粒）来诱导免疫。3.【答案】灌流【解析】灌流培养通过持续添加新鲜培养基并移除消耗的培养基，使细胞处于高活力、高密度状态。4.【答案】Vero【解析】目前IPV（脊髓灰质炎灭活疫苗）主要使用Vero细胞进行工业化生产，以替代猴肾细胞。5.【答案】油包水乳剂【解析】MF59是水包油（O/W）或油包水（W/O）的乳剂佐剂，核心成分是角鲨烯油滴。6.【答案】疏水相互作用层析【解析】HIC利用高盐浓度下蛋白质疏水基团暴露的特性进行结合，降低盐浓度进行洗脱。7.【答案】共晶点或玻璃化转变温度【解析】预冻温度必须低于溶液的共晶点（完全冻结成固体的最高温度）或塌陷温度，以保证升华界面稳定。8.【答案】配制（或佐剂吸附/分装前配制）【解析】制剂阶段，将原液稀释、加入佐剂、稳定剂等，调整至最终浓度。9.【答案】DNA荧光染色（或指示细胞法）【解析】支原体无细胞壁，革兰氏染色无效。常用DNA荧光染色法（如Hoechst）快速检测。10.【答案】TCI【解析】TCID四、名词解释1.种子批系统指从原始种子批（MasterSeedLot）衍生出主种子批，再由主种子批制备工作种子批，用于疫苗生产的分级管理系统。该系统确保了疫苗生产用菌株或毒种的遗传稳定性、一致性和可追溯性，避免因多次传代导致变异。2.佐剂佐剂是指先于抗原或与抗原同时注入机体，可非特异性地增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫反应类型的物质。常见的佐剂有铝佐剂、油乳佐剂、MF59、AS01等。3.层析层析是一种基于混合物中各组分在固定相和流动相之间分配系数的差异（如吸附、分子大小、电荷、生物亲和力等），而实现分离分析的技术。在生物制药中广泛用于蛋白质、核酸等的纯化。4.灭活灭活是指通过物理（如热、射线）或化学（如甲醛、β-丙内酯）方法，破坏病毒或细菌的遗传物质（核酸）或关键蛋白结构，使其失去繁殖能力或毒性，但尽可能保持其免疫原性的过程。5.生物反应器生物反应器是指为生物体（如细胞、微生物）提供适宜的生长环境和代谢条件，以完成特定生物反应（如细胞生长、产物表达）的装置。常见的有搅拌罐、气升式、波浪式、中空纤维反应器等。五、简答题1.简述重组亚单位疫苗（以乙肝疫苗为例）从上游表达系统到下游纯化的主要工艺流程及关键控制点。答：主要工艺流程：(1)上游表达：构建重组CHO细胞株->细胞库建立->细胞扩增（生物反应器培养）。(2)下游纯化：收获培养上清->澄清/深层过滤->亲和层析捕获（如硫酸铵沉淀或离子交换）->疏水/凝胶过滤精细纯化->超滤/除菌过滤->原液配制。关键控制点：(1)细胞库：确保细胞无外源因子污染，遗传稳定性。(2)培养：监控pH、DO、温度，防止污染，维持高表达量。(3)纯化：特异性吸附HBsAg，去除宿主细胞蛋白（HCP）、DNA、宿主细胞病毒。(4)原液：确保HBsAg颗粒结构完整（22nm），抗原效力符合标准，无菌、内毒素合格。2.比较微流控技术与薄膜挤出法在制备脂质纳米颗粒（LNP）时的优缺点。答：微流控技术：优点：混合过程高度可控，流速比精确，制备的LNP粒径均一、重现性好，包封率高，易于放大（平行放大）。缺点：设备成本较高，通道可能堵塞，对样品粘度有一定限制。薄膜挤出法：优点：设备简单、便宜，操作方便，适合实验室小规模制备。缺点：粒径分布较宽，重现性较差，包封率相对较低，放大生产困难（难以线性放大），挤出过程可能剪切破坏mRNA。3.简述病毒性疫苗生产中，如何进行细胞培养过程的污染监控与防治。答：监控：(1)原材料控制：血清、培养基、胰酶等均须无菌过滤并进行支原体、病毒检测。(2)过程检测：定期取样进行革兰氏染色、镜检、无菌培养（细菌/真菌）。(3)支原体检测：细胞培养末期进行指示细胞法或PCR法检测。(4)病毒检测：进行体外细胞致瘤试验或动物实验检测外源病毒。防治：(1)A级/B级环境下操作，使用密闭式生物反应器。(2)严格的人员更衣和卫生规范。(3)使用抗生素（需注意后续去除及耐药性风险，现代工艺倾向于不用）。(4)一旦发现污染，立即报废该批次，对设备进行彻底清洗灭菌（SIP/CIP），查找污染源。六、综合应用题1.【答案】(1)纯化步骤及目的：步骤一：亲和层析（如His-tag镍柱或特异性抗体柱）。目的：利用高特异性结合，从复杂的细胞培养上清液中快速捕获目标蛋白，大幅浓缩并去除大部分杂质。步骤二：离子交换层析（IEX）。目的：根据电荷差异去除宿主细胞蛋白（HCP）、DNA、内毒素以及电荷变异体（如降解片段）。步骤三：分子筛排阻层析（SEC）。目的：根据分子大小分离，去除聚