实验用羊微生物学等级及监测 DB62-T 4576-2022

实验用羊微生物学等级及监测DB62/T4576-2022甘肃省地方标准DB62/T4576-2022实验用羊微生物学等级及监测（Microbiologicalgradeandmonitoringofexperimentalsheep）2022年08月16日发布2022年09月16日实施甘肃省市场监督管理局发布前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由甘肃省科学技术厅提出、归口并监督实施。本文件主要起草人：王瑜、刘兰、常攀峰、董鹏程、牛海清、王东升、李润林、罗金印、李琪、樊世常、汪文琦、丁金武。1范围本文件主要规定了实验用羊微生物学等级及监测的术语和定义、等级分类、检测要求、检测程序、检测方法、检测规则和结果判定等。本文件适用于实验用羊微生物学等级及监测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB14922.2实验动物微生物学等级及监测GB/T14926.46实验动物钩端螺旋体检测方法GB/T18089蓝舌病诊断技术GB/T18641伪狂犬病诊断技术GB/T18646布鲁氏菌病诊断技术GB/T18653胎儿弯曲杆菌感染诊断技术GB/T18935口蹄疫诊断技术GB/T22915口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法GB/T27528口蹄疫病毒核酸检测方法GB/T27637副结核分枝杆菌核酸检测方法GB/T27982小反刍兽疫诊断技术NY/T539动物结核病诊断技术NY/T561动物炭疽诊断技术NY/T562动物衣原体病诊断技术NY/T576绵羊痘和山羊痘诊断技术NY/T577山羊关节炎-脑炎诊断技术NY/T1468山羊支原体肺炎诊断技术SN/T1087贝氏柯克斯体检测方法SN/T1171绵羊梅迪-维纳斯病和山羊关节炎-脑炎诊断技术SN/T3741.1钩端螺旋体病检测第1部分：显微镜凝集试验3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实验用羊（experimentalsheepandgoat）经人工饲育，对其携带的病原微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，用于科学研究、教学、生产和检定以及其它科学实验的羊。3.2普通级羊（conventionalsheepandgoat）不携带所规定的人兽共患病病原和羊烈性传染病病原的实验用羊，简称普通羊。3.3无特定病原体级羊（specificpathogenfreesheepandgoat）除普通羊应排除的病原外，不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验有干扰的病原的实验用羊，简称无特定病原体羊。4等级分类按微生物学与寄生虫学等级分类，实验用羊分为普通级、无特定病原体级。5微生物学等级及控制指标5.1外观指标实验用羊应外观健康，无异常。5.2微生物指标参考GB14922.2的规定，确定各等级实验用羊微生物检测项目应符合表1。动物等级病原微生物检测要求普通级口蹄疫病毒（Food-and-mouthdiseasevirus）▲小反刍兽疫病毒（Pestedespetitsruminants）▲绵羊/山羊痘病毒（Sheep/Goatpoxvirus）▲布鲁氏菌（Brucella）▲炭疽芽胞杆菌（Bacillusanthracis）○贝氏柯克斯体（Coxiellaburnetii）○钩端螺旋体（Leptospira）○无特定病原体级伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus）●口疮病毒（Orfvirus）●山羊支原体（Mycoplasmacapricolum）●副结核分枝杆菌（Mycobacteriumparatuberculosis）●胎儿弯曲杆菌（Campylobacterfetus）●衣原体（Chlamydia）●山羊关节炎-脑炎病毒（Caprinearthritisencephalitisvirus）○蓝舌病病毒（Bluetonguevirus）○绵羊梅迪-维纳斯病毒（Maedi-visnavirus）○绵羊肺腺瘤病毒（Ovinepulmonaryadenomatosisvirus）○注1：▲应检测项目，普通级可免疫，无特定抗原抗体实验用羊和无特定病原体级不可免疫。注2：●应检测项目。注3：○必要时检测项目。a仅适用于实验用山羊。b仅适用于实验用绵羊。5.3检测项目分类5.3.1必须检测项目：在进行实验用羊质量评价时必须检测的项目。普通级可免疫接种疫苗，无特定病原体级不能免疫接种疫苗。5.3.2必要时检测项目：指从国内外引进实验用羊时、怀疑有病原微生物流行感染时、申请生产许可证或实验特殊需要时应检测的项目。普通羊中的必须检测和必要时检测项目，在无特定病原体羊中为必须检测项目。6检测程序检测程序见图1。编号→保定→外观检查→采血、采集耳后/背部毛发或皮屑、采集鼻拭子/咽喉拭子/肛拭子（或新鲜粪便）→检测→结果判定→判定结论图1检测程序7检测方法检测方法应符合表2。微生物检测方法适用范围口蹄疫病毒GB/T18935：抗体检测、抗原检测（食道-喉部分泌物）、核酸检测（组织）；GB/T22915：核酸检测（血样、咽喉拭子）；GB/T27528：核酸检测（水泡液）实验用羊口蹄疫病毒检测小反刍兽疫病毒GB/T27982：抗体检测、抗原检测（结膜拭子、动物组织）实验用羊小反刍兽疫病毒检测绵羊/山羊痘病毒NY/T576：抗体检测（血清）、抗原检测（动物组织）、核酸检测（动物组织）实验用羊绵羊/山羊痘病毒检测布鲁氏菌GB/T18646：抗体检测（血清或奶样）实验用羊布鲁氏菌检测炭疽芽胞杆菌NY/T561：抗原检测（疑似病料、养殖场土壤或水体样本）实验用羊炭疽芽胞杆菌检测贝氏柯克斯体SN/T1087：抗体检测、抗原检测（阴道分泌物、奶样、粪便、动物组织或流产胎儿）实验用羊贝氏柯克斯体检测钩端螺旋体GB/T14926.46：抗体检测；SN/T3741.1：抗原检测（血液、尿液、组织）实验用羊钩端螺旋体检测伪狂犬病病毒GB/T18641：抗体检测、抗原检测（动物组织）、核酸检测（鼻拭子）实验用羊伪狂犬病病毒检测口疮病毒附录A：核酸检测（患处痂块）实验用羊口疮病毒检测山羊支原体NY/T1468：抗体检测、抗原检测（鼻拭子、动物组织）实验用羊山羊支原体检测副结核分枝杆菌GB/T27637：核酸检测（血样、奶样、粪便、动物组织）；NY/T539：抗体检测、抗原检测（粪便）、皮内变态反应试验实验用羊副结核分枝杆菌检测胎儿弯曲杆菌GB/T18653：抗原检测（阴道粘液、包皮液、精液）实验用羊胎儿弯曲杆菌检测衣原体NY/T562：抗体检测、抗原检测（流产胎儿或病料）、核酸检测实验用羊衣原体检测山羊关节炎-脑炎病毒NY/T577：抗体检测；SN/T1171：抗体检测（血样、奶样、关节囊液、病料）、核酸检测实验用羊山羊关节炎-脑炎病毒检测蓝舌病病毒GB/T18089：抗体检测、抗原检测（血样、精液、动物组织或库蠓）实验用羊蓝舌病病毒检测绵羊梅迪-维纳斯病毒SN/T1171：抗体检测（血样、奶样、关节囊液、病料）、核酸检测实验用绵羊梅迪-维纳斯病毒检测绵羊肺腺瘤病毒附录B：抗体检测（血样）实验用绵羊肺腺瘤病毒检测a如无注明，用于抗体检测的样本均为血清。b抗原检测、核酸检测后“（）”中注明的是可用于检测的样本来源。c库蠓为蓝舌病病毒的传播媒介。8检测规则8.1检测频率：普通级实验用羊每6个月检测1次；无特定病原体级实验用羊每3个月检测1次。8.2抽样方法：抽样应随机进行，抽样数量应符合GB14922.2的规定。批量≤50只时，抽样数量≥5只；批量51~100只时，抽样数量≥10只；批量>100只时，抽样数量≥15只。8.3检测项目选择：应根据实验用羊的等级，按照表1规定的检测项目进行检测；必要时检测项目应根据实际需求选择。8.4复检规则：当检测结果出现可疑或阳性时，应扩大抽样范围（抽样数量增加50%）进行复检；复检结果仍为阳性或可疑时，判定该批次实验用羊不符合相应等级要求。9结果判定9.1外观判定：实验用羊外观健康、无精神萎靡、无体表损伤、无异常分泌物（鼻、眼、口等），判定外观合格；否则判定为不合格。9.2微生物检测判定：各等级实验用羊微生物检测结果应符合表1规定，所有应检测项目均为阴性时，判定微生物检测合格；任一应检测项目为阳性时，判定微生物检测不合格；必要时检测项目根据实际检测需求判定。10判定结论10.1外观合格且微生物检测合格，判定该批次实验用羊符合相应微生物学等级要求。10.2外观不合格或微生物检测不合格，判定该批次实验用羊不符合相应微生物学等级要求，不得用于实验。附录A（规范性）羊传染性脓疱病诊断技术A.1范围本附录规定了羊传染性脓疱病（口疮）的核酸检测方法，适用于实验用羊口疮病毒的检测。A.2原理采用聚合酶链反应（PCR）技术，针对口疮病毒的特异性基因片段设计引物，通过扩增目的片段，判断样本中是否含有口疮病毒核酸。A.3试剂与材料A.3.1核酸提取试剂盒：符合国家相关标准，适用于痂块样本的核酸提取。A.3.2PCR反应试剂盒：包含Taq酶、dNTPs、PCR缓冲液等，符合实验要求。A.3.3引物：上游引物（5’-GCGGATCCATGACGTTGAAGGTGAAG-3’），下游引物（5’-GCTCTAGATTAGGGTTTCTGCGTCTG-3’），引物浓度为10μmol/L。A.3.4阳性对照：已知含口疮病毒核酸的样本；阴性对照：不含口疮病毒核酸的健康羊痂块样本。A.3.5其他材料：离心管、移液器、PCR仪、琼脂糖凝胶电泳设备等。A.4样本采集与处理A.4.1样本采集：采集实验用羊口腔、嘴唇或蹄部患处的痂块，放入无菌离心管中，做好标记。A.4.2样本处理：取50mg痂块样本，加入1mL无菌生理盐水，充分研磨至匀浆；4℃、8000r/min离心10min，取上清液，按照核酸提取试剂盒说明书提取病毒核酸。A.5PCR反应A.5.1反应体系（25μL）：PCR缓冲液5μL，dNTPs混合物2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，Taq酶0.5μL，模板核酸5μL，无菌去离子水10.5μL。A.5.2反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃终延伸10min；4℃保存。A.6结果观察与判定A.6.1琼脂糖凝胶电泳：取10μLPCR产物，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳时间30min，紫外灯下观察结果。A.6.2结果判定：阳性对照出现预期大小（约500bp）的特异性条带，阴性对照无条带，样本出现相同大小的特异性条带时，判定为阳性；样本无特异性条带时，判定为阴性。附录B（规范性）绵羊肺腺瘤病毒双抗体夹心ELISA检测技术B.1范围本附录规定了绵羊肺腺瘤病毒的双抗体夹心ELISA检测方法，适用于实验用绵羊血清中绵羊肺腺瘤病毒抗体的检测。B.2原理以绵羊肺腺瘤病毒特异性单克隆抗体作为包被抗体，捕获样本中的绵羊肺腺瘤病毒抗体；再加入酶标二抗，通过酶催化底物显色，根据吸光度值判断样本中是否含有绵羊肺腺瘤病毒抗体。B.3试剂与材料B.3.1包被抗体：绵羊肺腺瘤病毒单克隆抗体，浓度为1μg/mL。B.3.2酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗绵羊IgG抗体，稀释比例为1:5000。B.3.3底物液：TMB底物液，分为A液和B液，使用时等体积混合。B.3.4终止液：2mol/LH₂SO₄溶液。B.3.5阳性对照血清：已知含绵羊肺腺瘤病毒抗体的绵羊血清；阴性对照血清：不含绵羊肺腺瘤病毒抗体的健康绵羊血清。B.3.6其他材料：ELISA酶标板、移液器、酶标仪、洗板机等。B.4操作步骤B.4.1包被：将包被抗体加入ELISA酶标板，每孔100μL，4℃孵育过夜；次日用PBST洗板3次，每次3min，拍干。B.4.2封闭：加入5%脱脂奶粉封闭液，每孔200μL，37℃孵育1h；洗板3次，拍干。B.4.3加样：将待检血清、阳性对照血清、阴性对照血清分别用封闭液稀释1:100，每孔加入100μL，37℃孵育1.5h；洗板3次，拍干。B.4.4加酶标二抗：每孔加入100μL