T-HLJTDXH 002-2025 草地植物叶际微生物采集及提取技术规程

ICS65.020.01CCSB16HLJTDXH草地植物叶际微生物采集及提取技术规程Technicalregulationsforthecollectionandextractionofphyllospheremicroorganismsofgrasslandplants2025-08-11发布T/HLJTDXH002—2025本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由黑龙江省土地学会提出并归口。本文件起草单位：黑龙江八一农垦大学、中国科学院沈阳应用生态研究所、东北农业大学。本文件主要起草人：王智慧、陈丽芬、刘香萍、王洪义、赵丹、侯双利、李焮玉、彭婉婷、郭芯怡、武泽强、孙傲雪、魏祎、李洋。T/HLJTDXH002—20251草地植物叶际微生物采集及提取技术规程本文件规定了草地植物叶际微生物采集及提取技术中提取溶液配置、样品采集、植物表面叶际微生物提取步骤、植物内生叶际微生物提取步骤、建立技术档案等内容。本文件适用于植物及多物种草地植物叶际微生物的采集及提取。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2752.4卫生检疫人员的自我防护规范第4部分：实验室人员3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1叶际微生物植物地上部分（叶、茎、花等）的表面和内部统称为叶际，附生或寄生在叶际的细菌、真菌、古菌等微生物。3.2植物表面叶际微生物指附着或定植于植物表面生存的微生物群落。3.3植物内生叶际微生物指生活在植物组织内部的微生物群落。4提取溶液配置4.1试剂耗材准备磷酸氢二钠（Na2HPO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、表面活性剂SilwetL-77、盐酸（HCl）、75%乙醇、2.5%次氯酸钠（NaOCl现用现配灭菌的药勺、称量纸、试剂瓶、容量瓶、移液枪枪头、无菌水。4.2PBS磷酸缓冲盐溶液配置分别称取NaCl质量8g、KCl质量0.2g、Na2HPO4质量1.44g、KH2PO4质量0.24g，溶于800ml蒸馏水中，用0.1mol/LHCl调节溶液的pH值至6.5~7.5，最后加蒸馏水定容至1000ml即可。在每1000mlT/HLJTDXH002—20252的PBS缓冲液中加入200μL表面活性剂SilwetL-77。实验室药品配制应按GB19489规定执行。5样品采集5.1样品采集前准备采样前需要确定好实验目的、采样样地、样品数量、采样工具（无菌离心管或无菌自封袋、无菌剪子、无菌镊子、酒精、封口膜、记号笔、无菌手套、口罩、带冰袋的保温箱）等情况。5.2样品采集时间依据植物生长周期和气象条件，选定在植物生长旺盛期（春季末至秋季初)采样。具体采样时间选在晴朗、无风的上午9点~11点，避免在雨后或露水未干时采样。5.3样品采集操作步骤5.3.1样本个体选取每种目标草地植物选取至少3个~5个不同个体采样。5.3.2采样要求采样时，全程佩戴口罩及无菌手套，避免人为因素引入外源微生物或杂质。在每个植株上，挑选中上部3片~5片健壮叶片作为样本，同时确保叶片无明显病虫害、机械损伤，保证样本的均一性与可靠性。样品采集人员的自我防护按照SN/T2752.4规定执行。5.3.3样品采集方法用无菌剪刀迅速剪下叶片，放入无菌自封袋或50ml无菌离心管中。每管或每袋中叶片数量以不超过容器容积的2/3为宜，确保有足够空间用于后续处理。5.3.4交叉污染防控在连续采集不同植株叶片时，每完成一次采集，立即使用75%酒精棉球对剪刀刃进行全面擦拭消毒，并等待酒精完全自然挥发后，再进行下一株采集。5.3.5样本标识记录在离心管或自封袋上用记号笔清晰标注采样地点、采样时间、植物种类、植株编号、叶片位置等详细信息，确保每个样本具有唯一性标识。对于每个样本，额外记录叶片的大小、颜色、质地等特征。5.3.6样本保存运输将采集完毕的样品放入带有冰袋的保温箱中，随后带回实验室进行叶际微生物提取，若无法及时处理，应暂存于-80℃超低温冰箱不超过6个月。样品采集记录参照附录A。6植物表面叶际微生物提取步骤6.1浸提液用量取样本5g~10g，放入无菌管中，每克样本加入10mlPBS磷酸缓冲盐溶液。6.2提取操作步骤缓冲液充分浸润叶片表面，将样本放在涡旋仪上漩涡振荡5min，超声振荡器（功率50W~100W）振荡15min，重复上述步骤2次。T/HLJTDXH002—202536.3浸提液过滤和样本的保存洗涤液过0.22μm滤膜，过滤后的滤膜放在无菌离心管中，盖好盖子，封上封口膜，用液氮速冻，放-80℃冰箱保存待用。样品提取记录参照附录B。7植物内生叶际微生物提取步骤7.1样品准备按第6章规定执行。7.2植物组织表面消毒7.2.1洗涤预处理用无菌水冲洗植物茎叶，去除表面可见杂质。7.2.2消毒处理将植物组织浸泡在75%乙醇中2min，转移至2.5%次氯酸钠溶液中浸泡5min，再次放入75%乙醇中浸泡0.5min。7.2.3无菌水洗涤用无菌水洗涤植物组织3次，去除残留消毒剂，避免干扰后续实验。7.3无菌化处理后样本的保存表面无菌化的植物组织进行送样或者液氮速冻，然后保存于-80℃冰箱，可用于测定植物内部微生物。样品提取记录参照附录B。8建立技术档案应做好样品来源、取样时间、取样人员、样品名称等全面且详尽的记录，便于查找核对，提供可追溯依据。4T/HLJTDXH002—2025（资料性）样品采集记录表样品采集记录表，见表A。表A样品采集记录表5T/HLJTDXH002—2025（资料性）样品提取记录表样品提取记录表，见表B。表B样品提取记录表6T/HLJTDXH002—2025参考文献[1]白农恩，邓巍，程依婷，等.微生物类群在叶际微生物群落构建过程中的主导作用[J].微生物学通报,2025,52(4):1587-1599.[2]郑炀，孙学广，熊洋阳，等.叶际微生物对马尾松凋落针叶分解的影响[J].植物生态学报,2023,47(5):687-698[3]GongTY,XinXF.Phyllospheremicrobiota:Communitydynamicsanditsinteractionwithplanthosts[J].JournalofIntegrativePlantBiology,2021,63(2):297-304.[4]LiuHW,BrettellLE,SinghB.Linkingthephyllospheremicrobiometoplanthealth.TrendsinPlantScience,2020,25(9):841-844.[5]MandalSD,JeonJ.Phyllospheremicrobiomeinplanthealthanddisease.Plants,2023,12(19):3481.[6]SohrabiR,PaaschBC,LiberJA,etal.Phyllospheremicrobiome.