编制说明-《微生物活菌流式计数参考方法》

编制说明-《微生物活菌流式计数参考方法》本编制说明旨在阐述《微生物活菌流式计数参考方法》（以下简称“本方法”）的编制背景、目的意义、编制依据、主要内容及编制过程，明确方法的适用范围、技术要点和质量控制要求，为方法的实施、推广及后续修订提供科学依据，确保方法的科学性、规范性、实用性和可操作性。一、任务来源根据市场监管总局办公厅《2024年国家计量技术规范制定、修订及宣贯计划》（市监计量发〔2024〕40号文件）要求，确定由中国计量科学研究院、广东省科学院微生物研究所和中国质量检测检验科学研究院作为主要起草单位，承担本方法的制定工作。本方法归口单位为全国生物计量技术委员会，中国测试技术研究院、内蒙古伊利实业集团股份有限公司作为参加起草单位，共同参与方法的调研、论证、试验及编制工作，确保方法覆盖科研、生产、检验等多领域需求，兼顾计量溯源性和实际应用可行性。二、方法制定的必要性（一）目的与意义微生物活菌计数是食品安全、医疗健康、环境检测、生物工程等领域的核心技术环节，直接关系到产品质量评估、卫生状况监测、益生菌活力评价及微生物药敏反应监测等关键工作。活菌总数作为核心指标，相较于传统“菌落总数”，能更全面地反映样品中厌氧菌、活的不可培养（VBNC）细菌等的真实数量，提升检测结果的准确性和全面性。传统平板计数法虽具有成本低、可获得单菌落等优点，但存在“测不准、不恒定、测不快”的固有缺陷，测量周期长达近2天，重复性和再现性较差，不确定度较高，且无法实现复测，难以满足现代微生物检测精准化、快速化的需求。同时，目前国内外微生物标准物质多采用平板计数法定值，进一步导致标准物质不确定度偏高，影响量值传递的准确性。流式细胞术（FCM）作为一种现代细胞分析技术，通过流体动力学聚焦、激光照射及光信号检测分析，可实现对微生物的快速、高通量、多参数定量检测，每秒可分析多达1000个细胞，每分钟可处理10⁵-10⁶个细胞，显著提升检测效率。该方法不依赖培养基，能准确识别VBNC状态细菌，且操作可通过公式精准描述，可实现SI单位溯源，大幅降低测量不确定度，弥补传统方法的不足。因此，制定本方法，明确微生物活菌流式计数的技术流程、质量控制及计量溯源要求，对规范检测行为、提升检测精度、保障量值统一、支撑相关领域高质量发展具有重要的指导意义和实用价值。（二）国内外现状与发展趋势目前，国内外已有的微生物流式计数相关标准主要聚焦于特定领域和特定微生物，如ISO19344:2015《牛奶和乳制品.发酵剂、益生菌和发酵产品.用流式细胞术对乳酸菌的定量》和SN/T5436-2022《乳及乳制品发酵剂、发酵产品中乳酸菌计数流式细胞仪法》，仅适用于乳及乳制品中乳酸菌的计数，且推荐的三种荧光标记策略（cFDA和PI策略、SYTO和PI策略、DiOC₂策略）因原理不同，可能导致检测结果不可比。在计量学领域，国际上已将流式细胞术作为微生物精准测量的重点研究方向。美国NIST采用类流式技术的库尔特计数法测量酵母菌活菌数量，德国PTB开展了流式技术在微米级、纳米级微生物检测中的尝试性研究；国际计量局（BIPM）物质的量咨询委员会（CCQM）将建立微生物测量新溯源途径和计量标准作为重点研究内容，其细胞分析工作组（CAWG）在2021-2030年战略计划中，将流式分析法认定为潜在高等级微生物测量方法；ISO17511:2020《测量生物样品中的量-校准品和控制品定值的计量可追溯性》首次将流式分析技术列为具有溯源性的参考测量程序。我国已发布JJF1665-2017《流式细胞仪校准规范》、YY/T0588-2017《流式细胞仪》等标准，主要针对真核细胞计数的仪器质控，无法满足微生物测量的特殊需求；即将颁布的《微生物计数标准物质的研制》计量技术规范，已明确将流式计数法作为微生物标准物质定值的核心方法。综上，现有标准应用场景单一、荧光标记策略不可比、缺乏计量学层面的方法性能评价和质量控制要求，无法满足多领域微生物活菌精准快速测量的需求，制定本参考方法具有迫切的现实必要性。三、编制依据与原则（一）编制依据本方法的编制严格遵循国家计量技术规范制定要求，主要依据以下标准、规范及文献资料，确保方法的科学性和合规性：JJF1001《通用计量术语及定义》JJF1265《生物计量术语及定义》JJF1665《流式细胞仪校准规范》GB/T19702《体外诊断医疗器械生物源性样品中量的测量参考测量程序的表述和内容的要求》GB/T39730《细胞计数通用要求流式细胞测定法》SN/T5436《乳及乳制品发酵剂、发酵产品中乳酸菌计数流式细胞仪法》YY/T0588《流式细胞仪》ISO17511《体外诊断医疗器械-建立校准物、正确度质控物和人样品赋值的计量溯源性要求》ISO19344|IDF232《乳及乳制品——发酵剂、益生菌和发酵产品——用流式细胞术定量乳酸菌》国内外相关科研文献、流式细胞术应用研究成果及微生物计数实践经验。（二）编制原则科学性原则：基于流式细胞术的核心原理，结合微生物活菌检测的技术特点，参考国内外最新科研成果和标准规范，确保方法的技术路线、操作流程、参数设置具有科学依据，检测结果准确可靠。规范性原则：严格遵循计量技术规范的编制要求，明确术语定义、缩略语、测量条件、操作步骤、质量控制等内容，格式规范、逻辑清晰，便于统一实施和推广。实用性原则：兼顾科研、生产、检验等不同领域的应用需求，优化操作流程，明确不同场景下的适配性要求，避免过于复杂的操作，确保具备相应设备条件的机构均可顺利实施。溯源性原则：突出计量溯源要求，明确流式细胞仪校准、试剂验证、标准物质使用等环节的溯源路径，确保检测结果可追溯、可比，保障量值统一。前瞻性原则：结合流式细胞术的发展趋势，预留技术升级空间，兼顾方法的稳定性和前瞻性，适应未来微生物检测技术的发展需求。四、方法主要内容及编制说明本方法共分为11个核心章节及2个附录，涵盖范围、规范性引用文件、术语定义和缩略语、概述、测量条件、测量流程、方法确认、不确定度评定、计量溯源性说明、质量控制、结果报告等内容，具体编制说明如下：（一）范围明确本方法规定了细菌、真菌等可定量测量的微生物活菌的流式计数参考方法，适用于研究、生产和检验中使用流式细胞仪进行的样本中细菌（真菌）活菌总数测量，以及基于细菌（真菌）特性的分型计数。该范围的设定兼顾了多领域应用需求，同时明确了方法的适用对象，避免歧义。（二）规范性引用文件列出本方法中规范性引用的国内外标准、规范，明确注日期引用文件仅对应版本适用，不注日期引用文件其最新版本（含修改单）适用，同时补充说明当最新版本未包含引用内容时，采用包含该内容的最后版本，确保引用文件的准确性和适用性。（三）术语、定义和缩略语1.术语和定义：引用JJF1001、JJF1265、GB/T19702、GB/T39730界定的相关术语，同时补充“流式计数”的定义，明确其核心原理的核心是通过激光照射液流中单列生物颗粒，检测散射光或特异性荧光实现计数，确保术语定义清晰、统一，符合计量领域规范。2.缩略语：明确FSC（前向角散射光通道）、SSC（侧向角散射光通道）等流式细胞术常用缩略语，便于方法的理解和实施，避免因缩略语不统一导致的操作误差。（四）概述简要阐述流式计数法的两种核心原理：微球法和体积法。微球法通过目标微生物与计数标准微球的数量比例计算实际浓度；体积法通过微生物光学特性和样本体积直接计算浓度，明确两种方法的核心差异，为后续测量流程的选择提供依据，同时简要说明流式细胞术的技术优势，呼应方法制定的必要性。（五）测量条件1.环境条件：明确环境温湿度（温度15~30℃，湿度≤85%RH），同时注明当与仪器、试剂使用说明不一致时，以说明为准；明确生物安全要求，需符合GB19489、WS233等相关规范，根据微生物危害程度采取相应防护措施，保障操作安全。2.仪器和设备：明确流式细胞仪需具备荧光检测通道和散射光检测通道（含FSC和SSC），可识别最小500nm颗粒，且需经过校准并定期核查；同时列出温度控制装置、分析天平（实际分度值≤0.1mg，特种准确度级）、微量移液器（量程10μL~1000μL）等辅助仪器的要求，确保仪器设备满足检测精度需求。3.试剂和材料：明确荧光探针需适配流式细胞仪的激光器和检测器，活性表征荧光探针需根据微生物生理状态（膜完整性、代谢、呼吸等）选择，同时列举常见活性表征荧光探针（碘化丙啶PI、叠氮溴化丙锭PMA、SYTO等），为试剂选择提供参考，确保试剂适配性。（六）测量流程分三个核心步骤明确测量流程，确保操作可重复、可追溯：1.样品制备：明确样品采集、保存、稀释的要求，避免样品污染和微生物活性变化，确保样品代表性。2.样品处理：重点规范荧光标记的操作流程，包括探针添加量、孵育温度、孵育时间等参数，明确不同活性表征探针的使用注意事项，避免标记误差。3.流式细胞仪测量：明确仪器参数设置、样品上样、信号采集、数据筛选等要求，规范异常信号的处理方法，确保测量数据准确可靠。（七）方法确认明确方法确认的核心内容，包括精密度、准确度、检出限、定量限等性能指标的验证方法，参考GB/T19702等标准，规范确认流程和判定标准，确保本方法适用于不同场景下的微生物活菌计数，保障方法的可靠性。（八）不确定度的评定及表示结合计量溯源要求，明确不确定度的来源（仪器误差、试剂误差、操作误差、环境误差等），规范不确定度的评定流程和表示方法，参考JJF相关计量规范，确保检测结果的不确定度评定科学、规范，便于量值比对和溯源。（九）计量溯源性说明明确流式细胞仪校准、计数标准微球、荧光探针等关键环节的计量溯源路径，参考ISO17511等国际标准，确保测量结果可追溯至国家计量基准或国际计量标准，保障量值统一。（十）方法质量控制规范质量控制的核心环节，包括空白对照、平行样检测、标准物质验证、仪器定期校准、人员操作规范等，明确各环节的控制要求和判定标准，及时发现并纠正检测过程中的偏差，确保检测结果的稳定性和可靠性。（十一）结果报告明确结果报告的内容要求，包括样品信息、测量条件、仪器参数、检测结果、不确定度、检测日期、检测人员等，规范结果表述格式，确保报告完整、清晰，便于后续查阅和追溯。（十二）附录附录A（酸奶中活菌总数测量）和附录B（液体培养基中大肠杆菌O157:H7活菌计数），结合实际应用场景，提供具体的操作示例，明确样品处理、参数设置、结果计算等细节，为方法的实际应用提供指导，提升方法的实用性和可操作性。五、编制过程（一）前期准备阶段起草组成立后，首先开展了全面的文献调研和资料收集工作，系统梳理国内外微生物流式计数相关的标准规范、科研文献和应用案例，重点分析现有标准的不足和技术难点；同时调研了食品、医疗、环境等领域微生物检测机构的实际需求，明确方法的编制重点和技术方向，形成了方法编制大纲。（二）试验验证阶段依托各起草单位的技术平台，开展了大量试验验证工作。选取不同类型的微生物（细菌、真菌）、不同基体的样品（食品、生物制品、环境样品），采用不同的荧光标记策略和仪器参数，验证方法的精密度、准确度、检出限等性能指标；同时对比传统平板计数法，验证本方法的优越性和准确性，根据试验结果优化操作流程和参数设置，解决荧光标记干扰、样品污染、数据偏差等技术难题，形成试验报告，为方法编制提供坚实的试验支撑。（三）草案编制阶段结合文献调研和试验验证结果，按照编制大纲，起草组完成了本方法的草案编制工作，明确了各章节的内容和技术要求，规范了术语定义、操作流程和质量控制要求，形成了《微生物活菌流式计数参考方法》草案。（四）征求意见与修改完善阶段将草案发送至全国生物计量技术委员会、相关科研机构、检测机构、生产企业等单位，广泛征求意见；同时组织行业专家开展论证会，针对方法的适用范围、技术参数、操作流程、不确定度评定等内容提出修改建议。起草组对收集到的意见和建议进行系统梳理、分析，对草案进行修改完善，形成征求意见稿；再次征求意见后，结合反馈情况进一步优化，最终形成本方法的送审稿。六、方法创新点突破现有标准的应用局限，覆盖细菌、真菌等多种微生物，适用于多领域样品检测，解决现有标准应用场景单一的问题。规范荧光标记策略的选择和操作要求，减少不同标记方法导致的结果不可比问题，提升检测结果的一致性。强化计量溯源性要求，明确各环节的溯源路径，结合不确定度评定，确保检测结果可追溯、可比，提升方法的计量学水平。结合实际应用场景提供具体操作示例，优化操作流程，兼顾科学性和实用性，便于不同类型机构实施。七、方法实施建议1.本方法实施前，相关检测机构应确保流式细胞仪经过校准并符合要求，试剂和材料符合本方法规定，检测人员具备相应的操作技能和专业知识，可通过专业培训提升操作规范性。2.各应用单位可根据自身样品类型和检测需求，在本方法规定的范围内，优化荧光标记策略、仪器参数等细节，确保检测结果准确可靠。3.本方法实施过程中，应严格遵循质量控制要求，定期开展仪器校准、标准物质验证等工作，及时发现并解决实施过程中的问题，不断提升检测水平。4.建议全国生物计量技术委员会牵头，开展本方法的