《干细胞制剂质量控制和临床前研究指导原则（试行）》

《干细胞制剂质量控制和临床前研究指导原则（试行）》一、目的与适用范围为规范干细胞治疗产品的研发，保障干细胞制剂的质量、安全性和有效性，指导干细胞制剂的注册申报与临床试验研究，根据《中华人民共和国药品管理法》《生物制品注册分类及申报资料要求》等法规要求，制定本指导原则。本指导原则适用于研发注册阶段，用于人体疾病预防、治疗的各类活干细胞制剂，包括自体或异体来源的成体干细胞、胚胎干细胞（ESC）来源分化细胞、诱导多能干细胞（iPSC）来源分化细胞、基因修饰干细胞等创新型干细胞治疗产品；不适用于已经纳入常规临床实践的捐献者来源造血干细胞移植、脐带血造血干细胞公共库常规移植产品，此类产品遵循相应的临床技术规范。本指导原则为现阶段的研究要求，将随着科学技术的发展和监管实践的进展适时更新。二、干细胞制剂的质量控制干细胞制剂的质量控制需覆盖从原材料供体筛选到终产品放行的全链条，基于风险等级制定控制策略，确保每一批次制剂质量均一、稳定、安全。（一）原材料质量控制1.供体来源筛选与检定所有供体必须符合伦理要求，获得知情同意，来源可追溯。（1）自体供体：需完成完整的健康筛查，检测项目包括乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原、丙型肝炎病毒（HCV）抗体、人类免疫缺陷病毒（HIV-1/2）抗体、梅毒螺旋体抗体、巨细胞病毒（CMV）IgM、EB病毒衣壳抗原IgM，所有病原体检测结果需为阴性；采集前需确认供体无恶性肿瘤病史（非黑色素瘤皮肤癌除外）、无活动性自身免疫病、无严重遗传性疾病家族史；采集过程严格执行无菌操作，确保标本无外源污染。（2）异体供体：除上述病原体筛查外，需完成HLA基因分型并建档留存，排除携带明确致病性遗传变异的供体，无恶性肿瘤家族史；脐带组织/脐带血来源供体要求母体妊娠周期完整，无妊娠合并症、无传染病史，新生儿出生体重≥2500g，无先天发育畸形、无遗传疾病；胚胎干细胞供体仅可来源于辅助生殖技术剩余的废弃囊胚，需符合国家干细胞研究伦理规范，完成全基因组测序，排除明确致病性拷贝数变异与单核苷酸变异。（3）iPSC供体：除常规病原体与遗传筛查外，需对重编程起始细胞（如外周血单个核细胞、皮肤成纤维细胞）进行核型分析，确认起始细胞基因组无异常；重编程完成后需对建系的iPSC进行全基因组测序，排除重编程过程引入的致癌驱动突变。2.生产辅助原材料质量控制所有生产用辅料、试剂需符合《中国药典》药用级标准，来源可追溯：①若使用胎牛血清，要求必须来源于无疯牛病疫区，可追溯来源，无外源病毒、支原体污染，内毒素≤0.25EU/ml，总蛋白含量≥35g/L，不得使用未灭活的未知来源血清；②不得使用未经安全性验证的异种重组蛋白，所有细胞因子、生长因子需符合药用纯度要求，纯度≥95%，无内毒素污染；③重编程或基因修饰所用的病毒载体，需验证复制缺陷型，成品载体滴度符合要求，残留宿主细胞DNA≤10ng/剂，残留载体蛋白≤100ng/剂；非整合型重编程体系需证明终产品中无外源基因残留。（二）制备过程质量控制1.批次划分与追溯：同一批次干细胞制剂定义为“同一供体来源、同一生产周期、同一制备工艺下完成收获、配制的终产品”，每个批次需编制唯一可追溯的生产批号，全生产过程所有操作、人员、环境、原材料信息需完整记录，可反向追溯；批次最大生产规模不得超过单次验证生产的最大批量，不得跨批次混合细胞。2.过程控制要求：所有开放细胞操作需在A级洁净区进行，环境监测要求：沉降菌≤1CFU/4h·Φ90mm，浮游菌≤1CFU/m³，接触碟表面微生物≤1CFU/碟；每一代细胞扩增收获后需检测细胞活率、微生物污染，细胞连续扩增不超过10代需进行一次核型分析，确认基因组稳定性，超过15代扩增的细胞需额外完成全基因组测序，排除获得性致癌突变。（三）终产品质量控制终产品放行需完成所有项目检定，所有指标符合预设质量标准：1.细胞身份与属性检定①标志物纯度检测：通过流式细胞术检测细胞表面特异性标志物，不同类型干细胞预设标准：间充质干细胞要求CD90+、CD105+、CD73+阳性率≥95%，CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA-DR阳性率≤2%；多巴胺能神经元要求酪氨酸羟化酶（TH）阳性率≥60%；功能性肝细胞要求白蛋白分泌阳性率≥90%；多能干细胞来源分化产品要求未分化干细胞残留比例≤0.01%。②功能学鉴定：需完成对应功能试验，间充质干细胞需完成成骨、成脂、成软骨三系分化诱导试验，结果阳性；造血干细胞需完成半固体集落培养试验，集落形成率符合注册标准；神经干细胞需完成神经元、星形胶质细胞分化试验，分化比例符合要求。③基本参数：活细胞比例要求新鲜制剂≥90%，冻存制剂复苏后活率≥85%；细胞浓度偏差不得超过标示量的±10%。2.安全性检定①微生物与内毒素检测：需同时采用培养法和核酸扩增法检测支原体，结果均为阴性；无菌检查符合《中国药典》要求，不得检出任何需氧菌、厌氧菌、真菌；内毒素含量≤0.5EU/ml。②外源病毒检测：需完成通用外源病毒因子检测，敏感细胞培养观察14天无细胞病变，红细胞吸附试验阴性；动物源性原材料需加做种属特异性病毒检测，包括牛病毒性腹泻病毒、牛细小病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒等，结果均为阴性。③基因组稳定性检定：需完成G显带核型分析，染色体数目与结构异常率≤5%；iPSC、ESC来源产品，以及体外扩增超过10代的产品需完成全基因组测序，分析单核苷酸变异、拷贝数变异与结构变异，排除所有明确致癌驱动突变，意义未明的变异需完成功能验证，确认无致瘤风险后方可放行。④残留杂质检测：生产过程残留牛血清白蛋白≤50ng/剂，残留抗生素不得检出，DMSO残留符合每日允许暴露量要求（按体重计算≤1.1g/kg/d），病毒载体残留DNA符合国家限定标准。⑤致瘤性体外初筛：需完成软琼脂克隆形成试验，克隆形成率≤0.1%为合格；体内成瘤性初筛要求免疫缺陷NOD/SCID小鼠接种10倍临床剂量，观察24周，无肿瘤性增生为合格。⑥免疫原性检测：异体干细胞制剂需完成混合淋巴细胞反应，检测刺激指数，评估免疫原性强度，定量记录结果。（四）稳定性研究稳定性研究需考察不同储存条件下制剂质量的变化趋势，确定有效期：①实时稳定性：冻存制剂储存条件为-130℃以下气相液氮，考察周期至少36个月，每6个月取样检测一次，考察指标包括活率、纯度、微生物安全性，要求储存期末活率下降幅度≤10%，所有指标符合质量标准；新鲜制剂需考察2-8℃储存下的稳定性，考察周期不短于制剂制备到使用的最长间隔时间，要求储存期末活率下降≤5%。②冻融稳定性：冻存制剂需完成至少3次冻融循环试验，复苏后活率≥85%，所有指标合格，证明制剂在运输、使用过程中意外冻融的可接受性。③使用前稳定性：需考察制剂复苏/复温后室温放置的稳定性，要求25℃放置6小时活率下降≤5%，2-8℃放置24小时活率下降≤10%，各项指标符合要求。三、干细胞制剂临床前研究临床前研究需明确干细胞制剂的安全性、有效性，为临床试验的给药剂量、给药途径、风险监测提供依据。（一）安全性研究1.一般毒性试验：需按照生物技术药物一般毒性要求开展，设置低、中、高三个剂量组，低剂量相当于临床拟用最大剂量，中剂量为2倍临床剂量，高剂量为10倍临床剂量，同时设置阴性溶媒对照组；急性毒性试验观察周期14天，记录动物死亡、毒性反应情况；长期毒性试验观察周期至少3个月，对于体内滞留时间超过3个月的干细胞需延长观察周期至6个月，检测指标包括体重、饮食、血常规、血生化、尿常规、凝血功能、主要脏器组织病理学检查，高剂量组不得出现与干细胞给药相关的死亡、严重不可逆毒性。2.特殊安全性试验：包括局部刺激性试验、过敏试验、溶血试验，均需符合药用要求；遗传毒性需完成Ames试验、小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验、体内小鼠微核试验三项试验，结果均为阴性，若任意一项阳性，需进一步开展全基因组分析与风险评估，明确毒性风险等级。3.致瘤性与致畸性试验：除终产品检定的初筛试验外，临床前需开展更长周期的整体动物致瘤性试验，多能干细胞来源制剂需在免疫缺陷小鼠观察至少12个月，接种量不低于10倍临床剂量，所有动物尸检，对可疑组织做组织病理学鉴定，确认无恶性肿瘤发生；用于生殖系统疾病、育龄人群、妊娠人群的制剂需完成两代生殖毒性试验与致畸胎试验，确认无生殖毒性与致畸风险。4.免疫原性与免疫毒性研究：异体干细胞制剂需开展不同剂量下的免疫反应研究，检测给药后1天、1周、2周、1个月、3个月血清中抗干细胞抗体滴度，检测脾脏、淋巴结中的细胞毒性T细胞反应，评估免疫排斥风险；观察免疫器官的病理变化，确认无免疫抑制、自身免疫损伤等毒性。（二）有效性研究有效性研究需结合适应症机制，采用体外试验结合体内动物试验的方式，明确量效关系：1.体外有效性：需验证干细胞的核心功能，例如用于心肌梗死的间充质干细胞需验证其旁分泌功能，检测VEGF、HGF等细胞因子分泌水平，验证其促进内皮细胞管形成、抑制心肌细胞凋亡的能力，获得量效关系数据；用于神经系统疾病分化的神经元需验证其电生理功能，确认可产生动作电位、形成突触连接。2.体内有效性：需选择病理机制与人类疾病高度一致的动物模型，重大难治性疾病需增加大动物模型（比格犬、小型猪、非人灵长类）验证；试验设计需设置空白对照组、阴性对照组、阳性药对照组，至少设置3个剂量组，获得量效关系数据，确定临床试验的起始剂量、最大耐受剂量；有效性评价需结合功能学、影像学、组织病理学三类指标，例如缺血性脑卒中需评价神经功能缺损评分、磁共振成像脑梗死体积、海马区新生血管密度，要求试验组疗效显著优于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），结果可重复；基因修饰干细胞需验证目的基因的表达稳定性、表达持续时间，确认目的基因发挥预期治疗作用，无异常表达。（三）体内分布与动力学研究干细胞为活细胞产品，需明确其体内转归：①采用生物安全的细胞示踪技术（荧光素酶标记、超顺磁氧化铁标记等），检测给药后1天、3天、1周、2周、1个月、3个月、6个月各主要组织器官（心、肝、脾、肺、肾、脑、骨髓、生殖腺）中的活干细胞数量，明确靶组织滞留率，非靶组织分布比例，要求治疗剂量下6个月后非靶组织无持续活干细胞滞留，生殖腺分布比例不得超过0.1%，若生殖腺存在持续滞留，需进一步评估生殖遗传风险；②明确干细胞在体内的分化方向，验证分化比例与功能，确认无异常分化，明确干细胞的体内清除时间，评估长期滞留的风险。（四）不同类型干细胞的特殊临床前要求1.自体干细胞：需排除采集标本中的肿瘤细胞污染，采用特异性标记或核酸检测验证，无肿瘤细胞残留；需验证体外扩增过程中无获得性致癌突变，确认致瘤性阴性。2.异体干细胞：需明确HLA配型相合程度对免疫排斥的影响，确定不同配型情况下的免疫抑制方案，验证不同免疫抑制剂量下的安全性与有效性。3.多能干细胞来源制剂：需进一步验证未分化细胞残留控制方法的有效性，长期致瘤性观察不得少于12个月，确认无致瘤风险。4.基因修饰干细胞：需验证插入位点的安全