流式细胞术在肿瘤干细胞中的应用进展

摘要流式细胞术在肿瘤干细胞中的应用进展摘要肿瘤作为一种临床治疗中多发且顽固的疾病,对人们的生命健康构成了极大威胁，近年来，我国检测出肿瘤人数和肿瘤病逝人数逐年递增，因此治疗肿瘤一直是临床研究的重点。但由于肿瘤的临床治疗对肿瘤治愈效果不强且预后肿瘤细胞转移率高，而且肿瘤治疗预后副作用多、不能针对性治疗等原因导致肿瘤治疗难上加难，现如今肿瘤干细胞已被证实是导致肿瘤癌变，加速癌症进程，促进肿瘤转移和复发的原因，因此治疗肿瘤的突破点就在于肿瘤干细胞。但由于肿瘤干细胞在肿瘤细胞群中占比小且分布广泛，因而选择合适高效的分选方法也已成为研究肿瘤干细胞的关键，通过流式细胞术(flowcytometry，FCM)来鉴定和分选肿瘤干细胞在近些年已得到广泛应用。本文简要介绍了肿瘤干细胞的概念特性，主要论述通过FCM分选鉴定肿瘤干细胞的方法，以及通过FCM分选肺癌干细胞（LCSC）、胃癌干细胞（GCSC）方面的应用，为肿瘤干细胞的分选提供参考。关键词：肿瘤干细胞；流式细胞术；细胞表面标记物；侧群细胞

引言肿瘤干细胞（Cancerstemcells，CSC）是存在于肿瘤细胞中一群处于不同分化程度的数量极少的干细胞样细胞，可以进行无限的自我更新，以及具有能够分化成不同功能的组织细胞的潜力。他们不受微环境抑制作用调控，是促使肿瘤复发和转移的原因，对治疗药物不敏感。肿瘤干细胞在白血病细胞中首次被发现,随后具有干细胞特性的一小部分肿瘤细胞在乳腺肿瘤中被发现，从而在肿瘤中引入了肿瘤干细胞的概念。随后经过对其他一些肿瘤细胞群体的研究，发现肿瘤细胞中不同的细胞群功能各不相同,其中发现含量极少数的部分细胞具有进行自我更新的能力，以及分化成各不相同的组织细胞的潜能,是肿瘤转移复发的原因，由此产生了肿瘤干细胞学说，由于这部分细胞所含数量很少，因此如何将其分选出来成为关注的重难点。如今，流式细胞术是一项正在发展的新兴技术，是可以利用流式细胞仪快速分析出所测细胞系的物理化学特征，然后根据获得的数据特征进行目的细胞的分选。流式细胞术具有准确度高、分析速度快、精确度高、样品预处理更简单等优点，在分选鉴定肿瘤干细胞等方便得到广泛应用。1.肿瘤干细胞上世纪50年代，研究人员在对患有白血病的小鼠进行肿瘤细胞的移植实验时发现ADDINNE.Ref.{5C87C6CE-976C-4FB9-9716-D2D3A1B2CD81}[1]，肿瘤细胞中有小部分细胞有再生肿瘤的能力。对此研究人员提出了两种可能的理论解释ADDINNE.Ref.{9F482904-0178-4153-B7DD-79295A87FE6F}[2]：1、随机化理论，每个肿瘤细胞都具有新生肿瘤的潜力，但进入肿瘤分化周期的肿瘤细胞较少，是一个小概率的随机事件；2、分层理论，认为只有部分肿瘤细胞具有产生肿瘤的潜力，但是这一部分肿瘤细胞产生肿瘤的几率很高。而后随着现代科学技术的发展，更多的实验结果更倾向于第二种理论解释，由此许多学者在大量研究的基础上提出来肿瘤干细胞学说，认为肿瘤干细胞是指肿瘤中具有无限自我更新能力且有功能异质性的部分肿瘤细胞。1.1肿瘤干细胞生物特性肿瘤干细胞具有干细胞的共性：1、处于未分化状态，具有自我更新和无限增殖的能力，具有分化成不同功能组织细胞的潜能；2、细胞中端粒酶活性较高，具有扩增的端粒重复序列；3、产生的子细胞一个能够分化成为功能专一的终端细胞且不能回到干细胞状态，另一个仍有自我更新的干细胞特征，即能够以对称方式或不对称方式分裂。组织中有少数的肿瘤干细胞可以逃避临床化疗的杀伤，从而导致肿瘤的复发、转移ADDINNE.Ref.{E9F08C7F-B399-4F91-A14C-B313F296599A}[3]。肿瘤干细胞特有的信号调控机制也使其具有化学耐药性和抗辐射性ADDINNE.Ref.{CE925200-61F3-4DAE-8779-FBC995633B0D}[4]。1.2肿瘤干细胞的重要性及治疗方向在临床上，90%的肿瘤患者都是死于肿瘤转移和复发。如今肿瘤干细胞已被证实是导致癌变，加快癌症进程，促使肿瘤转移，癌症复发的原因，因而肿瘤干细胞的治疗已成为治疗肿瘤的关键。目前临床上针对肿瘤干细胞的治疗措施主要有ADDINNE.Ref.{5574D440-9CFB-4503-B934-5F44C4B97ED1}[5]：1、阻断抑制肿瘤干细胞的信号通路，通过抑制阻断信号通路，肿瘤干细胞的活性也会降低；2、诱导肿瘤干细胞的分化，使肿瘤干细胞不可逆的分化出具有一定功能的组织细胞；3、通过改变构成肿瘤干细胞生存的环境，抑制细胞中的端粒，使肿瘤干细胞活性降低；4、将正常基因导入肿瘤干细胞，进行特定基因治疗；5、研究专门针对治疗肿瘤干细胞的药物，使肿瘤干细胞特异性死亡。2.流式细胞术的原理及关键技术肿瘤干细胞在细胞系中含量较低，且分布广泛，因此如何高效的将肿瘤细胞分选出来成为当今研究的重点。流式细胞术作为一项正在被广泛运用的技术，其通过流式细胞仪将处于快速直线流动状态中的单细胞和生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析，从而将目的细胞从中分选出来ADDINNE.Ref.{F12739F3-CC79-49B1-8BD8-427910B74076}[6]，流式细胞分选技术的建立，为获取目标细胞提供了强有力的技术平台，目前随着流式细胞术的不断发展，其在肿瘤诊断和监测中已成为广泛且常规的工具ADDINNE.Ref.{1749517D-19F6-4AFA-8177-5E385D2BFF6B}[7]。2.1流式细胞仪应用流式细胞仪常用于细胞表型分析：1、按照细胞的蛋白表达量定量，例如丁玉珍ADDINNE.Ref.{1BFBC9CC-9FAB-47B1-A848-AC453BAFF65B}[12]等利用流式细胞仪检测内皮祖细胞相关蛋白含量。2、按照细胞的DNA量的变化来分类或定量，例汪艳等ADDINNE.Ref.{F5B15322-5D49-44B4-8433-FB6EE359A97F}[13]运用流式细胞仪检测高等植物DNA含量；曲亚兰等ADDINNE.Ref.{8EEF3FA0-0A7F-4797-8DDE-0DE8E517772D}[14]通过流式细胞仪检测宫颈细胞DNA含量变化来诊断宫颈癌变发展趋势，均是利用流式细胞仪分析DNA量变化来检测发展趋势。在进行DNA含量检测时还可与下文中检测表面标记物同时进行，在细胞混合培养中，可用来追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期状况，如细胞凋亡。3、按细胞功能改变来对细胞进行分类和定量，例毕丹等ADDINNE.Ref.{C766BFD1-811F-4668-975D-36E3B1685399}[15]通过研究磷脂酰丝氨酸外翻的分子调控机制，表明流式细胞仪能够通过外翻的磷脂酰丝氨酸来分选肿瘤细胞和非肿瘤细胞，即通过检测细胞膜表面物质功能的改变来对不同细胞种类进行分选。4、按照细胞生物大分子的暴露来分类细胞和定量，例张楠等ADDINNE.Ref.{BB7D0EF8-7D40-424C-9CB8-B1BF3991CF6F}[16]通过运用流式细胞仪检测细胞表面暴露出的抗原来分选两种不同类型巨噬细胞，即通过检测细胞表面暴露出的生物大分子-抗原来分选不同种类的细胞。5、按照特定细胞的标记对细胞进行深度研究，例郭枫等ADDINNE.Ref.{930C101C-B82D-4447-9ECC-9DB62DEFC20A}[17]通过流式细胞术利用特异性细胞标记CD133分选出两种不同的亚群细胞，2.2流式细胞仪分选肿瘤干细胞的工作原理分选肿瘤干细胞时，先将待测样品，制成单细胞悬液，经特异性荧光染料（如侧群细胞分析法中所用的Hoechst33342）染色后装入样品管，送入流动室。如孙立新等ADDINNE.Ref.{EBBA8171-6FA0-42CC-997D-73593F76A102}[8]在分选胰腺癌干细胞时，将经过细胞培养及传代后的细胞群经亲脂性染料PKH26染色后，用胰酶消化成单一细胞后送入流式细胞仪。分离样品流在鞘液的包被下呈单行排列，依次流经检测区域，在检测区，激光束垂直照射在通过的颗粒上。经激光照射的单细胞颗粒产生散射光信号和荧光信号，散射光信号包括前向角散射光(forwardscatterlight，FSC)和侧向角散射光（sidescatterlight，SSC），FSC的大小与细胞直径成正比，即FSC能够反映单细胞颗粒的大小，FSC越强，则单细胞颗粒越大；SSC的强度与细胞内颗粒结构的质量成正比，即SSC可以反映单细胞颗粒内部复杂程度。荧光信号来自于被标记的荧光染料被激光激发后发射的光信号，荧光信号的强弱代表了单细胞颗粒内被荧光染料标记的相关物质的浓度ADDINNE.Ref.{C2640CA4-D51E-49C6-8EF3-1BF677B7A6B6}[9-11]。这些光信号通过光电倍增管(PMT)转化为电信号，经放大器放大后传送到计算机进行数据采集和样本分析。3.流式细胞术分选肿瘤干细胞的方法3.1细胞表面标记物分选法细胞表面标记物分选法是目前运用最广泛的一种细胞分选研究方法，通常采用的方法包括免疫磁珠分选法(magneticactivatedcellsorting，MACS)和荧光激活细胞分选法(fluorescence-activatedcellsorting，FACS)。白细胞分化抗原（ClusterofDifferentiation， CD）是一类细胞膜蛋白，被用来命名细胞表面抗原，也常作为细胞表面标记物。在分选肿瘤干细胞研究中CD133、CD24以及CD44因在各种肿瘤干细胞中均有表达，而作为表面标记物被广泛运用ADDINNE.Ref.{B565D7DB-6476-4AC4-AE3C-03581B3C6FCA}[4]，如赵春霞ADDINNE.Ref.{16C128D5-9E87-45FC-AC33-6ACFCB22DA43}[18]通过检测CD133+在口腔中鳞癌组织的表达，发现其明显强于在正常口腔上皮组织中的表达，以此推断肿瘤干细胞导致了口腔黏膜癌变；许扬梅等ADDINNE.Ref.{DB7D545E-B1A7-441F-97D4-867E20B9394C}[19]通过流式细胞分选法利用CD44抗体和CD133抗体成功分选出CD44+/CD133+循环肿瘤干细胞，均通过分选CD表面标记物实现的，由此可见，细胞表面标记物分选法已成为常见的分选肿瘤干细胞的方法。3.1.1荧光激活细胞分选法荧光激活细胞分选法，即流式细胞分选法。在流式细胞仪光收集系统中有一组滤光片组合，通过滤光片时，FSC、SSC和荧光信号会根据波长的不同被引导至不同的PMT上，从而分选出目的细胞即肿瘤干细胞ADDINNE.Ref.{F5EDBF7D-39F8-4EB0-9785-40C83E069C85}[20]，如王玲燕ADDINNE.Ref.{F48C0F35-D226-4C37-8397-6B12007F33AB}[21]等通过流式细胞分析法利用CD44抗体和CD24抗体成功将CD44＋CD24－／low乳腺癌干细胞从人乳腺癌细胞系中分离出来。综上所述，流式细胞分选法就是利用肿瘤干细胞与一般肿瘤细胞同被标记的CD结合后，通过激光照射时发射的荧光信号波长不同，将肿瘤干细胞从肿瘤细胞群中分选出来的方法。3.1.2免疫磁珠分选法免疫磁珠分选法主要是使肿瘤干细胞表面抗原与表面包被的特异性单克隆抗体的磁珠发生反应，使肿瘤干细胞与磁珠结合，然后在分选柱上施加磁场，用缓冲液冲洗，未标记的细胞被冲洗下来，由此将结合了磁珠的肿瘤干细胞分离出来。简单地说，用结合了磁珠的抗体与肿瘤干细胞表面抗原结合，使肿瘤干细胞带上磁珠，添加磁场后，利用缓冲液进行冲洗，便将结合了磁珠与没结合磁珠的细胞分离开来。如项峰等ADDINNE.Ref.{D05F49F9-DF5D-41D0-8537-331D71DD9FFE}[22]利用包被CD133抗体的磁珠从子宫颈癌组织中分选出了CD133+和CD133－肿瘤干细胞，证明了利用免疫磁珠分选法可以获得高纯度的目的肿瘤干细胞。3.1.3 MACS和FACS比较流式细胞分选法是目前运用最广泛的一种细胞分选方法，特异性和敏感性较高。也可以进行多参数分选，不同荧光强度进行分选，例如靳小可ADDINNE.Ref.{2DD1D9E0-57BC-415A-BA14-B26E4AD8B443}[23]等曾利用多参数流式细胞术检测多发性骨髓瘤中微小残留病变。但流式细胞分选法的缺点是分选技术难度较高，速度相比免疫磁珠分选法较慢。免疫磁珠分选法对设备要求较低，只需要一块磁珠，分选速度快，对细胞损伤程度小，分选得到的肿瘤干细胞活性高ADDINNE.Ref.{DD081507-91C7-4D17-AFC4-E5103F627615}[24]，适合大多数的实验室。缺点是可以分选的细胞类型有限。3.2侧群细胞分析法侧群细胞分析法（sidepopulationsanalysis）是利用肿瘤干细胞具有能将核酸染料Hoechst33342（双苯酰亚胺H33342或HOE33342）高效排出细胞的特点，通过流式细胞仪分选出肿瘤干细胞的方法。正常细胞和普通肿瘤细胞一般发出蓝色荧光，由于肿瘤干细胞已将燃料排出细胞，所以不发光ADDINNE.Ref.{1EEBFDCD-6845-426C-A06E-93CF6B7E767A}[25]。这类未发出荧光信号的细胞被称为侧群细胞（sidepopulations，SP细胞）。例如姜贻乾ADDINNE.Ref.{68EAD8E4-2086-461E-A0C6-A37DB6FB8F33}[26]等通过侧群细胞分析法从胃癌MKN-45细胞系中分选出胃癌干细胞，证明了侧群细胞分析法分选肿瘤干细胞的可行性，在生物学功能和表面分子标记物等方面，侧群细胞与肿瘤干细胞有许多共同点，但利用侧群细胞分析法分离出的侧群细胞并不能直接说明就是肿瘤干细胞本身，还需进行后续鉴定出肿瘤干细胞特性，如刘哲亮ADDINNE.Ref.{5738CE36-1AAD-443D-904F-52C05A6A47B3}[27]等通过侧群细胞分选法从新鲜肺鳞癌组织标本中分选出SP细胞后，结合流式细胞分选法CD133和CD44鉴定证实得到的SP细胞为肺癌干细胞。综上，侧群细胞分析法相较细胞表面标记物分选法来说可以解决细胞表面标记物分选时部分肿瘤干细胞缺少表面标记物的问题，且细胞表面标记物分选法也可以作为侧群细胞分选法的鉴定方法ADDINNE.Ref.{5D90BF63-B755-4143-9225-30138BF873DF}[28]。4.流式细胞术在临床治疗肿瘤干细胞中的应用肿瘤干细胞在肿瘤细胞群中含量占极少数，因此分选肿瘤干细胞成为目前靶向治疗肿瘤干细胞的重点和难点。运用流式细胞术分选肿瘤干细胞为日后研究肿瘤的发生机制以及靶向治疗提供重要参考依据，从而为临床治疗更好实施肿瘤癌症的预后评估以及靶向治疗提供参考。4.1流式细胞术在分选肺癌干细胞中的应用2007年研究人员利用侧群细胞分析法从肺癌细胞株中分选并鉴定出具有肿瘤干细胞活性的侧群细胞ADDINNE.Ref.{5F2CE146-FEED-498F-8B48-C2A41C8672BF}[29]。目前针对肺癌干细胞的分选是通过分选细胞特异性表面标记物来实现的，常见的用来分选肺癌干细胞的表面标记物有CD44+、CD133+等。例如遇珑等ADDINNE.Ref.{234DABA2-205B-440F-94B0-B16E9B5E1F41}[30]将通过流式细胞术从小鼠的肺癌细胞中筛选出CD133+细胞接种至小白鼠体内，后表现肿瘤干细胞特性-致瘤性；陈鑫等ADDINNE.Ref.{01A6F0BA-70AF-49B6-85BF-7042E6D10657}[31]运用SP细胞分析法分选出SP细胞，发现分选出的SP细胞有增殖速度快，集聚力强等CSC特点，以上皆是利用了流式细胞术进行了分选鉴定，证明流式细胞术在肺癌干细分选鉴定中发挥了关键作用，运用流式细胞术分选肺癌干细胞为日后研究肿瘤的发生机制以及靶向治疗提供重要参考依据，从而在临床上更好实施肺癌的预后评估以及靶向治疗。4.2流式细胞术在分选胃癌干细胞中的应用目前对胃癌干细胞的分离鉴定主要运用的是细胞表面标记物分选，胃癌干细胞目前多专注于CD44+、CD24+、CD133+等表面标记物的研究，其中最常见的表面标记物是CD44+。周雨等ADDINNE.Ref.{FB173A8D-CA27-47D4-8A5F-F9BEBC03A447}[32]利用免疫磁珠分选法从胃癌细胞系中筛选出阳性CD44胃癌细胞，并用流式细胞分选法鉴定出分选得到的胃癌细胞具有干细胞活性；彭平等ADDINNE.Ref.{89EFB94F-A514-4D1A-98DA-28D019AE13AB}[33]通过细胞培养获得胃癌细胞和胃癌干细胞球形体，经流式细胞分选法分别分选，发现球形体中CD44细胞含量远远大于胃癌细胞中CD44细胞含量，而后通过流式细胞分选法从胃癌细胞中分别分选出阳性和阴性CD44胃癌干细胞，体外培养发现CD44+胃癌干细胞具有更高的球形成能力，即自我更新能力更强。以上皆是利用了胃癌干细胞最常见的特异性表面标记物CD44进行的流式细胞术分选，而后进行鉴定。流式细胞术在分选胃癌干细胞中的运用，为后续进行的干细胞靶向治疗提供了参考。5.结语及展望肿瘤治疗一直以来都是临床研究的热点问题，而肿瘤干细胞的治疗更成为肿瘤研究中的重点。为了保证后续研究的继续进行，如何从肿瘤细胞系中分选出肿瘤干细胞成为了关键问题。流式细胞术作为正在被广泛关注的分选鉴定细胞的一种方法，在解决这个关键问题中发挥了重要作用。由于肿瘤干细胞特异性的细胞表面标记，利用细胞表面标记物分选法很容易将目的肿瘤干细胞分选鉴定。但由于肿瘤干细胞不一样的亚型、肿瘤发展的不同阶段以及表达不稳定等原因，使肿瘤干细胞缺乏一个最具特征性的标志物。而侧群细胞法可以避免缺乏特征性表面标记这个问题，但是由于侧群细胞法对仪器、环境、细胞状态要求高，因此侧群细胞法有较高的不稳定性，且因为侧群细胞法使用的Hoechst33342染色剂对不同的肿瘤干细胞有不同程度的毒性，因此对分选结果会有大大小小的影响。总之，随着科学技术的继续进步，这些问题也将得到更好的解决，流式细胞术在肿瘤干细胞的分选鉴定方面将得到更深入的进步发展，相信在不久的将来，流式细胞术将在肿瘤治疗方面得到更广泛的应用参考文献参考文献ADDINNE.RepADDINNE.Bib参考文献[1] HewittHB.StudiesofthedisseminationandquantitativetransplantationofalymphocyticleukaemiaofCBAmice[J].BrJCancer,1958,12(3).[2] 宋东颖，王毅，孙岚，等.肿瘤干细胞理论及肿瘤干细胞分离和鉴定研究进展[J].中国药理学与毒理学杂志,2012,26(5):674-675.[3] 王耀焓，张培彤.影响肿瘤干细胞侵袭转移的相关机制[J].中国肿瘤,2016,25(09):699-705.[4] 许姗，赖俊忠，陈骐.肿瘤干细胞表面标志物及主要信号通路[J].中国生物化学与分子生物学报,2015,31(10):1017-1024.[5] 吕慧侠，崔畅畅，柯学.肿瘤干细胞靶向治疗研究进展[J].药学进展,2016,40(1):20-29.[6] 周静.流式细胞术的临床应用及研究进展[J].甘肃科技,2016,32(14):137-138.[7] 黄玉杰.流式细胞术应用于医学检验的研究进展[J].中国医疗器械信息,2019,25(16):14-15.[8] 孙立新，遇珑，解亦斌，等.抗胰腺癌干细胞单克隆抗体的筛选和鉴定[J].现代肿瘤医学,2014,22(07):1492-1496.[9] 夏天爽.流式细胞术在食品微生物检测领域的研究进展[J].食品安全导刊,2019,(34):62-64.[10] 赵书涛，武晓东，王策，等.流式细胞仪的原理、应用及最新进展[J].现代生物医学进展,2011,11(22):4378-4381.[11] 李胜男，王秀娟，周建，等.利用流式细胞仪计数微型浮游生物的方法[J].湖泊科学,2015,27(05):757-766.[12] 丁玉真，高雨，李继凤，等.KCa3.1通道在内皮祖细胞生物学功能改变及分化中的作用[J].中国药学杂志,2019,54(6):464-469.[13] 汪艳，肖媛，刘伟，等.流式细胞仪检测高等植物细胞核DNA含量的方法[J].植物科学学报,2015,33(01):126-131.[14] 曲亚兰，谢宝芳，李丹阳.流式细胞术联合阴道镜活检在宫颈癌和癌前病变筛查中的意义[J].实用肿瘤学杂志,2017,31(01):31-34.[15] 毕丹，徐扬，逄越，等.质膜组分磷脂酰丝氨酸外翻的分子调控机制[J].遗传,2015,37(02):140-147.[16] 张楠，石玲玲，解秀梅，等.免疫组织荧光与流式细胞术检测脊髓损伤局部巨噬细胞亚群的比较[J].牡丹江医学院学报,2017,38(01):8-11.[17] 郭枫，钟鸣，杨乃林，等.肿瘤干细胞标记物CD_(133)与miR-429在大肠癌组织中的表达及其相关性研究[J].现代生物医学进展,2014,14(19):3684-3686.[18] 赵春霞.口腔鳞癌组织中CD133的表达及意义[J].全科口腔医学电子杂志,2018,5(33):158-159.[19] 许扬梅，刘巧珍，刘沁颖，等.流式细胞术检测结直肠癌根治术前后循环肿瘤细胞和循环肿瘤干细胞及其临床预测价值[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2017,24(04):355-361.[20] 付佳，何慈江，刘志红.利用荧光激活细胞分选技术获取荧光蛋白标记肾小球足细胞[J].肾脏病与透析肾移植杂志,2014,23(03):201-206.[21] 王玲燕，王斌，马清华，等.CD44~