家禽心包积液-肝炎综合征防控技术规程

ICS点击此处添加ICS号点击此处添加中国标准文献分类号备案号：DB13Technicalregulationsforpreventionandcontrolofpoultrypericardialeffusionandhepatitis河北省市场监督管理局发布DB13/TXXXX—XXXXI本标准按照GB/T1.1-2020给出的规则起草。本标准由河北省农业农村厅提出。本标准起草单位：河北农业大学。本标准主要起草人：袁万哲、雷白时、赵款、张武超、张云航、王淼、薛拥志、董晓峰、陈福星、刘洁、李睿文、王韫、李丽敏、张磊。DB13/TXXXX—XXXX1家禽心包积液-肝炎综合征防控技术规程本标准规定了家禽心包积液-肝炎综合征的诊断、预防和治疗。本标准适用于养殖场（户）和动物疾病防治单位对家禽心包积液-肝炎综合征的防控。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T388畜禽场环境质量标准NY/T5027无公害食品畜禽饮用水水质GB/T32148家禽健康养殖规范NY/T3791鸡心包积液综合征诊断技术3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。家禽心包积液-肝炎综合征（Hydropericardium-hepatitisSyndrome,HHS）又称安卡拉病，是由Ⅰ群禽腺病毒4型（Fowladenovirusserotype-4,FAdV-4）引起的一种急性传染病，该病以心包积液、肝脏肿大为特点，可在肝细胞中形成嗜碱性包涵体。4诊断4.1流行病学4.1.1流行特点一年四季均可发生，但多发生于秋季、初春或春末、夏初。4.1.2易感动物肉鸡、蛋鸡均可感染，该病主要发生于20-30日龄的肉鸡，包括817、肉杂等，发病后4-8天为死亡高峰，病程8-15天，死亡率达20～30%。同时蛋鸡20-70日龄以及200-300日龄也有发生，但死亡率低于肉鸡。另外，鸭、鹅、鸽、鹌鹑也有感染报道。4.1.3传染源DB13/TXXXX—XXXX2病禽和带毒家禽。4.1.4传播途径主要通过粪便等途径水平感染，也可通过种禽、蛋等垂直传播。4.2临床症状及病理变化家禽死亡前均正常采食，无明显临床表现而突然倒地死亡。剖检可见心肌柔软、心包积有淡黄色透明的液体，液体遇冷可凝固；肝脏肿胀、质地变脆，个别死亡家禽脾脏肿大、肺脏淤血。发病家禽肝脏中央静脉和窦状隙广泛淤血、肝细胞脂肪变性，局灶性肝细胞坏死，同时细胞浆和细胞核内可见嗜碱性包涵体。4.3病原学诊断4.3.1病原分离与鉴定无菌采集棉拭子、组织等样本，选择鸡胚或LMH等易感细胞，参照NY/T3791进行病原分离，将收获的尿囊液或者细胞培养液选用4.3.4或者4.3.5所述方法进行核酸鉴定与分析。4.3.2病毒中和试验（VN）参照NY/T3791进行。4.3.3间接免疫荧光试验（IFA方法）按附录B规定的方法执行。4.3.4聚合酶链式反应（PCR方法）按附录C规定的方法执行。4.3.5实时荧光PCR检测方法按附录D规定的方法执行。5预防5.1加强饲养管理饲养要求按照GB/T32148的规定执行；饮水要求按照NY5027的规定执行；环境控制应符合NY/T388的规定。5.2严格家禽检疫DB13/TXXXX—XXXX3引进家禽加强检疫，出现症状进行隔离，证明无病后方可混入大群饲养。种禽加强检疫，可采集肛拭子通过实时荧光PCR检测方法进行检测。5.3免疫接种5.3.1疫苗鸡新城疫、禽流感（H9亚型）、禽腺病毒病(Ⅰ群4型）三联灭活疫苗。5.3.2预防接种商品肉鸡7～14日龄时进行初免；28～35日龄时进行二免。对40～50日龄出栏的肉鸡，建议只进行初免。种鸡与商品蛋鸡初免、二免免疫程序同商品肉鸡；110～120日龄时进行三免。开产后，根据免疫抗体检测情况进行免疫。6.1隔离消毒对发病鸡立即隔离，并彻底消毒用具和鸡舍。对病死、剖检鸡尸体应进行无害化处理。6.2抗病毒选用干扰素等抗病毒药物与禽腺病毒(Ⅰ群4型）蛋黄抗体，混合肌注，1次/天，连用3-5d。6.3对症治疗饲料或饮水中添加保肝利尿等药物减轻肝脏炎症，排出积液；饲料或饮水中添加黄芪多糖提高机体抵抗力；1～2次/天，连用3-5d。DB13/TXXXX—XXXX4（规范性附录）相关试剂的配制A.11.0%琼脂糖凝胶称取琼脂糖1.0g，放入100mL1×TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60℃时，加入5μL核酸染料，均匀铺板，厚度为3mm～5mm。A.250×TAE电泳缓冲液A.2.10.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）称取EDTA18.61g，加灭菌双蒸水至100mL，后用氢氧化钠调pH至8.0。A.2.2TAE电泳缓冲液（50×)Tris242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA100mL，加灭菌双蒸水至1000mL。A.3溴化乙锭（EB）溶液溴化乙锭20mg，加灭菌双蒸水至20mL。A.4DEPC水焦碳酸二乙酯（DEPC）50μL，加灭菌双蒸水至100mL，室温放置6h～8h，121℃高压灭菌20min，分装到1.5mLDEPC处理过的离心管。A.5PBS缓冲液A.5.1A液（0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液）NaH2PO4·H2O27.6g先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000mL。A.5.2B液（0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）Na2HPO4·7H2O53.6g或Na2HPO4·12H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g）先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000mL。A.5.30.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液的配制A液14mL，B液36mL，加氯化钠（NaCl）8.5g，最后用蒸馏水稀释至1000mL。5A.6细胞培养用溶液A.6.12×104U/mL青霉素链霉素液（双抗）青霉素、链霉素各2×106U溶于100mL三蒸水中，过滤除菌，分装后，-20℃冻存备用。A.6.2500mmol/LHepes贮存液1.2gHepes溶于10mL三蒸水中，经121℃高压灭菌15min，置-20℃冻存备用。A.6.37.5%NaHCO37.5gNaHCO3溶于100mL三蒸水中，115℃高压灭菌20min，4℃保存备用。A.6.45×DMEM浓缩液将DMEM粉剂按厂家说明书配制，过滤除菌，4℃保存，使用时进行5倍稀释。A.6.5含10％胎牛血清DMEM培养基（生长液）于264mL三蒸水中加入80mL5×DMEM溶液，40mLFBS（胎牛血清），2mL2×104U/mL青链霉素液，4mL500mmol/LHepes贮存液，用7.5%NaHCO3溶液调节pH值至7.2～7.4左右，4℃保存备用。A.6.6含2％胎牛血清DMEM培养基（维持液）于296mL三蒸水中加入80mL5×DMEM溶液，8mLFBS，2mL2×104U/mL青链霉素液，4mL500mmol/LHepes贮存液，用7.5%NaHCO3溶液调节pH值至7.2～7.4左右，4℃保存备用。A.6.710×Na2EDTA-胰酶溶液（2.5%）Na2EDTA0.2g，NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.89g，KH2PO40.2g，溶于90mL三蒸水中，再加入2.5g胰酶（1：250完全溶解后，加三蒸水补足至100mL，NaHCO3调节pH至7.2～7.4，过滤除菌，分装，-20℃保存备用，使用时1：10稀释。DB13/TXXXX—XXXX6（规范性附录）间接免疫荧光试验B.1材料LMH细胞、生长液、维持液、0.25%胰酶溶液、禽腺病毒4型鼠源单克隆抗体或兔源多克隆抗体、荧光标记兔抗鼠IgG或荧光标记山羊抗兔IgG、丙酮。B.2仪器设备倒置荧光显微镜、CO2培养箱B.3操作步骤B.3.1复苏LMH细胞，于37℃CO2培养箱中培养，待细胞长成良好的细胞单层后，用0.25%胰酶溶液进行消化。B.3.2将LMH细胞消化后，以约106个/mL的细胞密度转入96孔细胞培养板，于37℃CO2培养箱中培养，待细胞长成良好的细胞单层后，接种待检病毒，同时设立阴阳性对照，于37℃吸附1h后，加入100μL维持液继续培养。B.3.3接毒一定时间后，倒去上层液体，用-20℃预冷的丙酮室温固定15min，自然干燥。B.3.4滴加一定浓度单克隆抗体或多克隆抗体，37℃湿盒作用45min；PBS漂洗3次，每次5min；滴加1:40稀释的含0.01％伊文斯兰的荧光标记（FITC）兔抗鼠IgG或山羊抗兔IgG，37℃湿盒作用45min；PBS漂洗3次，每次5min；吸干液体后立即于荧光显微镜下观察。B.4结果判定阳性对照进行IFA后细胞浆中可见特异性绿色荧光，阴性对照进行IFA后细胞浆中未见特异性绿色荧光，阴阳性同时成立表明试验有效，否则试验无效。阴阳性同时成立的情况下，若待检样品进行IFA后细胞浆中可见特异性绿色荧光，则判定为待检样品禽腺病毒4型阳性。DB13/TXXXX—XXXX7(规范性附录)聚合酶链式反应C.1材料表C.1引物信息引物名称引物浓度序列（5'-3'）上游引物10μmol/LCCGACCGTTACAAGTTTAGCAT上游引物10μmol/LTTCGCAGGAAGTCGTAGTGGAC.2仪器设备PCR仪、凝胶成像系统、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL）、水浴锅。C.3样品的采集与处理C.3.1样品的采集C.3.1.1棉拭子采集将棉拭子深入咽喉或肛门转一圈；将采集后的棉拭子放入盛有1.0mLPBS（配制方法见附录A中A.5）的1.5mL的离心管，加盖，编号。C.3.1.2组织采集剖检家禽，用剪刀采集心肝脾肺肾法氏囊等组织，装入一次性灭菌容器，编号。C.3.2样品的处理C.3.2.1棉拭子处理方法将装有棉拭子的离心管在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，4℃条件下3000r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。C.3.2.2组织的处理方法将所采集的组织置于洁净、灭菌并烘干的搪瓷盘中，称取组织按照质量体积比（1:5）加入样品保DB13/TXXXX—XXXX8存液进行充分研磨，4℃条件下3000r/min离心15min。取上清转入无菌的1.5mL的离心管备用，编号。C.4操作步骤C.4.1阴阳性对照以灭活的禽腺病毒4型细胞培养物或者感染鸡组织作为阳性对照，以正常细胞或者是正常鸡组织作为阴性对照。对照均应在-20℃保存。同时进行阴阳对照样品的核酸提取。C.4.2核酸提取采用商品化核酸提取试剂，按照说明书进行操作。C.4.3PCR反应反应管中依次加入无核酸酶水6μL、2×TaqMasterMix10μL、所提取的DNA溶液1μL、10µmol/L的上游引物各0.5μL，反应体系共计20μL。经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。PCR扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸57s，循环30次；72℃延伸5min。扩增反应结束后立即进行电泳或置于4℃条件下备用。C.4.4扩增产物电泳检测制备1.0%琼脂糖凝胶板。在电泳槽内加入1×TAE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取3μL～5μL扩增产物加到凝胶孔，加入DNA分子量标准（100bp）。恒压（110V）电泳30min～40min，在凝胶成像系统上观察结果。C.5结果判定阳性对照的扩增产物经电泳检测，在预期大小的条带位置均出现特异性的条带；阴性的扩增产物没有预期的目的条带；阴阳性同时成立表明试验有效，否则试验无效。在试验结果成立的前提下，如果样品的PCR产物电泳后在954bp位置出现特异性的条带，则判定为禽腺病毒4型核酸检测阳性；如果样品的PCR产物电泳后在954bp位置未出现特异性的条带，则判定为禽腺病毒4型核酸检测阴性。DB13/TXXXX—XXXX9(规范性附录)实时荧光PCR检测方法D.1材料表D.1引物/探针信息引物/探针名称引物/探针浓度序列（5'-3'）FAdV4-F（上游引物）10μmol/LTTACGCTTACGGTGCCTACGTFAdV4-R（下游引物）10μmol/LCCGCGTTATTCATGATCCAGTAFAdV4-P（探针）10μmol/LFAM-CGACGGTTCCCAGTCCCTCACG-EclipseD.2仪器设备实时荧光PCR仪、台式低温高速离心机、冰箱、微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL）。D.3样品的采集与处理D.3.1样品的采集D.3.1.1棉拭子采集将棉拭子深入咽喉或肛门转一圈；将采集后的棉拭子放入盛有1.0mLPBS（配制方法见附录A中A.5）的1.5mL的离心管，加盖，编号。D.3.1.2组织采集剖检家禽，用剪刀采集心肝脾肺肾法氏囊等组织，装入一次性灭菌容器，编号。D.3.2样品的处理D.3.2.1棉拭子处理方法将装有棉拭子的离心管在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，4℃条件下3000r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。D.3.2.2组织的处理方法DB13/TXXXX—XXXX将所采集的组织置于洁净、灭菌并烘干的搪瓷盘中，称取组织按照质量体积比（1:5）加入样品保存液进行充分研磨，4℃条件下3000r/min离心15min。取上清转入无菌的1.5mL