沙门菌生物被膜调控基因rpoE鉴定及突变株特性解析

沙门菌生物被膜调控基因rpoE鉴定及突变株特性解析一、引言1.1研究背景沙门菌（Salmonella）是一种广泛存在且危害严重的食源性致病菌，能引发人和动物的多种感染性疾病，包括食物中毒、肠道炎症以及全身性败血症等。据世界卫生组织（WHO）统计，全球每年约有9380万例沙门菌感染病例，导致15.5万人死亡，其对公共卫生安全构成了重大威胁。在我国，沙门菌也是引起食物中毒和食源性疾病的主要病原菌之一，给食品安全和人类健康带来了巨大挑战。沙门菌能够在各种环境表面，如食品加工设备、医疗器械以及动物肠道黏膜等，形成生物被膜（Biofilm）。生物被膜是细菌为适应生存环境而形成的一种具有高度组织化的多细胞结构，由细菌细胞、细胞外多糖（EPS）、蛋白质和核酸等组成。一旦形成生物被膜，沙门菌的生存能力和耐药性会显著增强。研究表明，生物被膜态的沙门菌对常规抗生素的耐药性可比浮游态细菌提高10-1000倍，这使得沙门菌感染的治疗变得极为困难。此外，生物被膜还能保护细菌免受宿主免疫系统的攻击，增加了感染的持续性和复发性。生物被膜的形成是一个复杂的过程，涉及多个基因的调控。其中，rpoE基因编码的σ因子RpoE在细菌应对环境应激和生物被膜形成中发挥着关键作用。RpoE属于σE家族，是一种重要的转录因子，能够识别特定的启动子序列，启动相关基因的转录，从而调控细菌的生理功能和应激反应。在沙门菌中，RpoE参与了多种环境应激的响应，如热应激、氧化应激、渗透压应激等，对维持细菌的生存和适应性至关重要。已有研究报道，RpoE能够调控沙门菌生物被膜形成相关基因的表达，影响生物被膜的结构和功能。然而，目前对于RpoE在沙门菌生物被膜形成中的具体调控机制，以及RpoE缺失对沙门菌生物学特性的影响，仍不完全清楚。深入研究沙门菌生物被膜形成调控基因rpoE，不仅有助于揭示沙门菌生物被膜形成的分子机制，为开发有效的生物被膜控制策略提供理论依据，还能为沙门菌感染的预防和治疗提供新的靶点和思路。通过构建rpoE缺失突变株，研究其生物学特性的变化，如生长特性、耐药性、致病性等，能够进一步明确RpoE基因在沙门菌致病过程中的作用，为沙门菌病的防控提供更精准的理论指导。因此，开展沙门菌生物被膜形成调控基因rpoE的鉴定及缺失突变株的生物学特性研究具有重要的理论意义和实际应用价值。1.2研究目的与意义本研究旨在深入鉴定沙门菌生物被膜形成调控基因rpoE，并全面探究其缺失突变株的生物学特性，为揭示沙门菌生物被膜形成的分子机制和致病机制提供理论依据，具体研究目的如下：鉴定rpoE基因在沙门菌生物被膜形成中的作用：通过分子生物学技术，明确rpoE基因在沙门菌生物被膜形成过程中的具体调控作用，解析其参与生物被膜形成的分子机制。构建rpoE缺失突变株：利用基因编辑技术，构建沙门菌rpoE缺失突变株，为研究rpoE基因功能提供有效的实验材料。研究rpoE缺失突变株的生物学特性：系统分析rpoE缺失突变株的生长特性、耐药性、致病性等生物学特性的变化，明确rpoE基因对沙门菌生物学行为的影响。本研究具有重要的理论意义和实际应用价值：理论意义：深入了解沙门菌生物被膜形成的分子调控机制，丰富细菌生物被膜形成的理论知识，为进一步研究其他细菌生物被膜的形成机制提供参考。同时，揭示rpoE基因在沙门菌致病过程中的作用，有助于全面理解沙门菌的致病机制，为病原菌致病机制的研究提供新的视角。实际应用价值：为开发针对沙门菌生物被膜的新型控制策略提供理论基础。通过靶向rpoE基因或其调控通路，可以设计和筛选出更有效的生物被膜抑制剂，从而降低沙门菌在环境中的存活和传播，减少食源性疾病的发生。此外，明确rpoE基因与沙门菌耐药性和致病性的关系，为沙门菌感染的临床治疗提供新的靶点和思路，有助于开发更有效的抗菌药物和治疗方法，提高沙门菌感染的治疗效果，保障公共卫生安全。二、文献综述2.1沙门菌概述沙门菌（Salmonella）隶属于肠杆菌科沙门菌属，是一类革兰氏阴性杆菌，呈直杆状，大小通常为（0.6-1.0）μm×（2-4）μm，有菌毛，除鸡沙门菌和雏沙门菌等个别例外，都有周身鞭毛，一般无荚膜，均无芽胞。其抗原构造主要分为菌体抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（Vi）三种，依据这些抗原的不同组合，沙门菌属细菌的血清型现已达2500多种。沙门菌广泛分布于自然界，涵盖了土壤、水、空气等各类生态环境，同时也是人兽共患的肠道病原菌，在家畜、家禽、野生脊椎动物以及冷血动物、软体动物、环形动物、节肢动物等众多生物体内均有发现。部分血清型如伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌（原称乙型副伤寒沙门菌）和希氏沙门菌（原称丙型副伤寒沙门菌），主要感染人类，引发肠热症；而绝大多数血清型宿主范围广泛，可导致人类食物中毒或败血症，动物感染大多无症状或表现为自限性胃肠炎。沙门菌引发的疾病种类繁多，对人类健康和畜牧业发展造成了严重威胁。在人类中，主要引发以下几类疾病：一是肠热症，包括伤寒和副伤寒，由伤寒沙门菌和甲型、乙型、丙型副伤寒沙门菌引起，患者会出现持续发热、相对缓脉、全身中毒症状、玫瑰疹、肝脾肿大等症状，严重时可危及生命；二是胃肠炎，这是最为常见的沙门菌感染类型，由摄入被污染的食物或水引起，主要症状为恶心、呕吐、腹痛、腹泻、发热等，通常呈自限性，但在婴幼儿、老年人和免疫力低下者中，病情可能较为严重；三是败血症，多由猪霍乱沙门菌等引起，细菌侵入血流并在其中大量繁殖，释放内毒素，导致高热、寒战、贫血、肝脾肿大等全身症状，可引发感染性休克和多器官功能衰竭，死亡率较高。在动物方面，沙门菌可引起家禽的白痢、伤寒和副伤寒，导致家禽生长发育受阻、产蛋量下降、死亡率增加；在家畜中，可引发仔猪副伤寒、牛沙门菌病等，影响畜牧业的经济效益。据世界卫生组织（WHO）报告，全球每年约有9380万例沙门菌感染病例，导致15.5万人死亡，其中大部分病例发生在发展中国家。在我国，沙门菌也是引起食物中毒和食源性疾病的主要病原菌之一。根据国家食品安全风险监测数据显示，沙门菌在食源性致病菌监测中始终名列前茅，严重威胁着公众的食品安全和身体健康。此外，沙门菌感染还会给畜牧业带来巨大的经济损失，据估算，全球每年因沙门菌感染导致的畜牧业经济损失高达数十亿美元。因此，沙门菌在公共卫生领域具有极其重要的地位，对其进行深入研究和有效防控至关重要。2.2细菌生物被膜细菌生物被膜是细菌在自然环境中广泛存在的一种生存形式，它是细菌为适应环境而形成的具有特殊结构和功能的聚集体。1978年，Costerton等首次提出了细菌生物被膜的概念，经过多年的研究，其定义逐渐明确：细菌生物被膜是指细菌粘附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。除了水和细菌外，生物被膜还包含细菌分泌的大分子多聚物、吸附的营养物质和代谢产物及细菌裂解产物等，其中大分子多聚物主要有蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等物质。细菌生物被膜具有独特的结构。从微观层面看，它呈现出高度有序且复杂的三维结构，由细菌细胞和细胞外基质（ECM）组成。细胞外基质是生物被膜的重要组成部分，主要由多糖、蛋白质、核酸和脂质等大分子物质构成，这些物质相互交织，形成了一个网络状结构，为细菌提供了物理保护和生存微环境。在这个结构中，细菌并非均匀分布，而是形成了大小不一的微菌落，微菌落之间被充满液体的通道分隔开来。这些通道类似于人体的血管系统，具有物质运输的重要功能，能够将营养物质输送到生物被膜内部的各个部位，同时将细菌代谢产生的废物排出，保证了生物被膜内细菌的正常生长和代谢。例如，在铜绿假单胞菌的生物被膜中，多糖成分藻酸盐形成了一种凝胶状的基质，将细菌包裹其中，为细菌提供了物理保护，同时也有助于维持生物被膜的结构稳定性。细菌生物被膜的形成是一个动态且复杂的过程，通常可分为以下几个阶段：初始粘附阶段：浮游细菌通过布朗运动、水流或自身的运动能力接近物体表面，当细菌与表面距离足够近时，细菌表面的一些结构，如菌毛、鞭毛、脂多糖等，会与物体表面的分子发生非特异性的相互作用，使细菌暂时附着在表面，这一阶段的粘附是可逆的，细菌仍有可能脱离表面重新回到浮游状态。例如，大肠杆菌的菌毛能够识别并结合到肠道上皮细胞表面的特定受体上，从而实现初始粘附。不可逆粘附阶段：随着时间的推移，细菌在表面上开始分泌细胞外聚合物（EPS），这些EPS包括多糖、蛋白质、核酸等成分，它们在细菌与物体表面之间形成了一种粘性的连接，使得细菌与表面的粘附变得更加牢固，进入不可逆粘附阶段。此时，细菌开始在表面上定植，并准备进行进一步的生长和繁殖。研究发现，金黄色葡萄球菌在粘附过程中会分泌一种名为纤维连接蛋白结合蛋白的物质，它能够与物体表面的纤维连接蛋白结合，增强细菌的粘附力。微菌落形成阶段：在不可逆粘附的基础上，细菌开始在表面上分裂繁殖，形成微菌落。微菌落中的细菌通过EPS相互连接，形成了一个紧密的群体结构。随着微菌落的不断生长，它们逐渐融合在一起，形成更大的菌落。例如，枯草芽孢杆菌在形成微菌落时，会分泌一种名为枯草菌素的蛋白质，它能够促进细菌之间的相互作用，加速微菌落的形成。生物被膜成熟阶段：多个微菌落融合后，生物被膜继续生长和发育，形成具有复杂三维结构的成熟生物被膜。在这个阶段，生物被膜内部的细菌会进行分化，不同位置的细菌具有不同的生理功能，如表面的细菌主要负责营养物质的摄取，而深层的细菌则可能处于相对休眠的状态，以应对营养物质的缺乏和代谢废物的积累。同时，生物被膜内部的通道系统也逐渐完善，进一步提高了物质运输的效率。分散阶段：成熟的生物被膜会释放出一些浮游细菌，这些细菌可以重新在环境中扩散，寻找新的定植位点，开始新的生物被膜形成过程。生物被膜的分散受到多种因素的调控，如营养物质的浓度、环境压力、群体感应信号等。例如，当生物被膜内部的营养物质匮乏时，细菌会分泌一些信号分子，触发分散机制，使部分细菌脱离生物被膜，去寻找更适宜的生存环境。细菌生物被膜的形成对细菌的生存和致病性具有重要影响。从生存角度来看，生物被膜为细菌提供了多种保护机制，使其能够在恶劣的环境中存活。生物被膜的物理结构可以阻挡外界有害物质的侵入，如抗生素、消毒剂、宿主免疫系统的攻击等。研究表明，生物被膜中的EPS能够与抗生素结合，降低抗生素在生物被膜内的扩散速度和浓度，从而使细菌对抗生素产生耐药性。有研究发现，在生物被膜状态下，金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药性可提高100-1000倍。生物被膜内部的微环境相对稳定，能够为细菌提供适宜的温度、pH值和营养物质浓度，有利于细菌的生长和繁殖。此外，生物被膜中的细菌之间还可以通过群体感应等机制进行信息交流和协同作用，增强细菌的生存能力。从致病性方面考虑，细菌生物被膜的形成往往会导致感染性疾病的慢性化和难治性。在人体感染中，生物被膜态的细菌能够逃避宿主免疫系统的清除，持续感染宿主组织，引发慢性炎症和组织损伤。例如，在囊性纤维化患者的肺部，铜绿假单胞菌形成的生物被膜会导致反复的肺部感染，难以彻底治愈，严重影响患者的生活质量和寿命。生物被膜还可能成为细菌的储存库，不断释放出浮游细菌，引发新的感染。在医疗器械相关感染中，如导尿管、心脏起搏器等，细菌在器械表面形成生物被膜后，不仅会增加感染的风险，还会使感染难以控制，需要更换器械才能彻底清除感染源。2.3rpoE基因相关研究rpoE基因编码的σ因子RpoE在细菌的生理活动和应激反应中发挥着关键作用。RpoE属于σE家族，是一种重要的转录因子，它能够与RNA聚合酶核心酶结合，形成具有特定启动子识别能力的全酶，从而启动相关基因的转录。在大肠杆菌中，RpoE主要参与细菌对细胞外膜应激的响应。当细菌受到热应激、氧化应激、渗透压应激或膜损伤等刺激时，RpoE基因的表达会被诱导上调。研究表明，在热应激条件下，大肠杆菌细胞膜上的未折叠蛋白会积累，激活RpoE的表达，进而启动一系列热休克蛋白基因的转录，帮助细菌修复受损的蛋白质和细胞膜，维持细胞的正常生理功能。在氧化应激环境中，RpoE可以调控抗氧化酶基因的表达，增强细菌对氧化损伤的抵抗能力。在沙门菌中，rpoE基因同样在应对环境应激中扮演着重要角色。例如，当沙门菌处于高渗环境时，细胞内的渗透压失衡会触发一系列信号转导通路，最终诱导RpoE的表达。RpoE通过与特定的启动子序列结合，激活下游基因的转录，这些基因参与调节细胞内的渗透压平衡、细胞膜的稳定性以及蛋白质的合成和修复等过程。研究发现，在高渗应激条件下，伤寒沙门菌的rpoE基因缺失突变株的生长受到明显抑制，对高渗环境的耐受性显著降低，这表明RpoE在沙门菌适应高渗环境中起着不可或缺的作用。在酸应激方面，RpoE也参与了沙门菌的应对机制。当沙门菌暴露于酸性环境时，RpoE能够调控一些与酸耐受相关基因的表达，帮助细菌维持细胞内的酸碱平衡，增强对酸性环境的抵抗力。有研究报道，在酸性条件下，鼠伤寒沙门菌的rpoE基因缺失突变株的存活率明显低于野生型菌株，说明RpoE对沙门菌在酸性环境中的生存具有重要意义。关于rpoE基因与沙门菌生物被膜形成的关系，已有一些研究报道。研究发现，RpoE能够调控沙门菌生物被膜形成相关基因的表达，影响生物被膜的结构和功能。例如，RpoE可以调节胞外多糖合成基因的表达，进而影响生物被膜中胞外多糖的含量和组成，而胞外多糖是生物被膜的重要组成部分，对生物被膜的结构稳定性和细菌的粘附能力起着关键作用。有研究表明，在rpoE基因缺失突变株中，生物被膜中胞外多糖的含量明显降低，生物被膜的结构变得松散，细菌的粘附能力也有所下降。此外，RpoE还可能通过调控其他与生物被膜形成相关的基因，如鞭毛合成基因、菌毛合成基因等，间接影响沙门菌的生物被膜形成过程。鞭毛和菌毛在细菌的初始粘附阶段发挥着重要作用，它们能够帮助细菌接近物体表面并实现初始粘附，因此RpoE对这些基因的调控可能会影响生物被膜形成的起始阶段。然而，目前对于RpoE在沙门菌生物被膜形成中的具体调控机制仍不完全清楚，还有待进一步深入研究。三、沙门菌生物被膜形成相关Sigma因子的鉴定3.1材料菌株：选用肠炎沙门菌标准菌株SL1344，由本实验室保存。该菌株具有典型的肠炎沙门菌生物学特性，在前期研究中已被证实能够形成稳定的生物被膜，为后续实验提供了可靠的研究对象。培养基：LB培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.2-7.4），用于细菌的常规培养和活化；TSB培养基（胰酪大豆胨液体培养基，30g/L），因其营养丰富，更适合生物被膜的形成，用于生物被膜的培养；固体培养基则是在相应液体培养基中添加1.5%的琼脂粉制备而成，用于细菌的分离和纯化。这些培养基的配方和使用条件经过了广泛的研究和验证，能够满足实验中细菌生长和生物被膜形成的需求。主要试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司），利用硅胶膜离心柱技术，能够高效、快速地从细菌中提取高质量的基因组DNA，为后续的基因分析提供了可靠的模板；DNA聚合酶（TaKaRa公司），具有高保真、高效扩增的特点，可确保PCR反应的准确性和特异性，用于基因扩增；dNTPs（TaKaRa公司），作为PCR反应的原料，为DNA合成提供了必要的底物；引物由上海生工生物工程有限公司合成，根据rpoE基因及其他相关sigma因子基因序列设计，经过严格的生物信息学分析和优化，确保引物的特异性和扩增效率；结晶紫染液（Sigma公司），用于生物被膜的染色，通过与生物被膜中的多糖、蛋白质等成分结合，使生物被膜在显微镜下清晰可见，从而便于观察和定量分析；其他常用试剂如氯仿、异戊醇、无水乙醇等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，用于DNA提取、纯化等实验步骤，其纯度和质量能够满足实验要求。仪器设备：PCR仪（Bio-Rad公司），具备精确的温度控制和快速的升降温速度，能够保证PCR反应在最佳条件下进行；凝胶成像系统（Bio-Rad公司），可对琼脂糖凝胶电泳后的DNA条带进行清晰成像和分析，通过对条带的亮度、位置等参数的测量，能够准确判断基因扩增的结果；酶标仪（ThermoFisherScientific公司），用于测定生物被膜的吸光度值，通过检测结晶紫染液与生物被膜结合后的吸光值变化，实现对生物被膜形成量的定量分析；恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），能够提供稳定的温度环境，满足细菌在不同温度条件下的生长需求；恒温摇床（太仓市实验设备厂），可在培养过程中提供适宜的振荡条件，促进细菌的生长和代谢，同时也有利于生物被膜的均匀形成。这些仪器设备均经过严格的校准和质量检测，确保实验数据的准确性和可靠性。3.2方法3.2.1沙门菌生物被膜形成能力测定采用结晶紫染色定量法测定沙门菌的生物被膜形成能力。具体步骤如下：将保存的肠炎沙门菌SL1344菌株接种于LB液体培养基中，37℃、180r/min振荡培养12-16h，进行活化。然后，用新鲜的LB培养基将活化后的菌液稀释至OD600nm值为0.1左右，再将稀释后的菌液以每孔200μL的量加入到96孔聚苯乙烯细胞培养板中，每个菌株设置3个复孔。同时，设置只含有LB培养基的空白对照孔。将培养板置于37℃恒温培养箱中静置培养，分别在培养24h、48h和72h后取出。小心吸去孔内的培养液，用PBS缓冲液轻轻冲洗3次，以去除未粘附的浮游细菌。然后，每孔加入200μL的95%乙醇，室温固定15min。固定结束后，倒掉乙醇，自然晾干。待孔板完全干燥后，每孔加入100μL的0.1%结晶紫染液，室温染色15min。染色完毕后，用流水缓慢冲洗孔板，直至冲洗液无色，以去除未结合的结晶紫染液。将孔板倒置在吸水纸上，吸干水分，自然晾干。最后，每孔加入200μL的33%冰乙酸，振荡15min，使结合在生物被膜上的结晶紫充分溶解。使用酶标仪在595nm波长处测定各孔的吸光值（OD595nm），以空白对照孔的吸光值作为背景值进行校正。根据OD595nm值的大小来判断沙门菌生物被膜的形成能力，OD595nm值越大，表明生物被膜形成能力越强。结晶紫染色定量法的原理是基于结晶紫能够与生物被膜中的多糖、蛋白质等成分结合。当结晶紫染液加入到含有生物被膜的孔中时，结晶紫会与生物被膜紧密结合，形成紫色复合物。通过用冰乙酸溶解结合在生物被膜上的结晶紫，再利用酶标仪测定溶液在特定波长下的吸光值，就可以间接反映生物被膜的含量和形成能力。这种方法操作简单、快速，且重复性好，是目前常用的生物被膜定量测定方法之一。3.2.2rpoS活性测定通过触酶试验测定rpoS活性，以确定rpoS基因依赖性和非依赖性生物被膜形成株。触酶试验的原理是触酶能够催化过氧化氢分解为水和氧气。在细菌中，触酶的表达受到rpoS基因的调控，rpoS基因依赖性生物被膜形成株在稳定期会表达较高水平的触酶，而rpoS基因非依赖性生物被膜形成株的触酶活性较低。具体操作如下：将经过活化培养的肠炎沙门菌SL1344菌株，用接种环挑取适量的菌苔，涂抹在洁净的载玻片上。然后，在菌苔上滴加1-2滴3%过氧化氢溶液。观察反应现象，若在30s内出现大量气泡，即为触酶试验阳性，表明该菌株为rpoS基因依赖性生物被膜形成株；若30s内无明显气泡产生，即为触酶试验阴性，表明该菌株为rpoS基因非依赖性生物被膜形成株。每个菌株重复测定3次，以确保结果的准确性。3.2.3荧光定量PCR检测利用建立的荧光定量PCR方法比较rpoS基因非依赖株在指数期（培养6h）和生物被膜形成期（培养24h）6个σ因子（rpoD、rpoS、rpoH、rpoE、rpoN、rpoF）的基因表达差异。首先，提取不同时期细菌的总RNA。将培养至相应时期的菌液，按照RNA提取试剂盒的说明书进行操作，提取总RNA。提取过程中，使用无RNA酶的水和耗材，以避免RNA的降解。提取的总RNA用核酸测定仪测定其浓度和纯度，要求OD260nm/OD280nm的值在1.8-2.0之间，以确保RNA的质量良好。然后，以提取的总RNA为模板，按照反转录试剂盒的操作步骤，将RNA反转录为cDNA。反转录过程中，设置无反转录酶的阴性对照，以检测是否存在基因组DNA的污染。接着，进行荧光定量PCR反应。反应体系为20μL，包括10μL的SYBRGreenPCRMasterMix（2×）、上下游引物各0.8μL（10μmol/L）、2μL的cDNA模板以及6.4μL的ddH2O。引物序列根据GenBank中沙门菌的6个σ因子基因序列设计，由上海生工生物工程有限公司合成。引物设计遵循以下原则：引物长度为18-25bp，Tm值在58-62℃之间，GC含量在40%-60%之间，并且避免引物二聚体和发夹结构的形成。荧光定量PCR反应在PCR仪上进行，反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。在每个循环的退火阶段采集荧光信号。反应结束后，通过分析扩增曲线和熔解曲线来判断扩增的特异性和准确性。最后，采用2-ΔΔCt法计算各σ因子基因的相对表达量。以16SrRNA基因作为内参基因，对目的基因的表达量进行标准化。其中，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，对照组为指数期的rpoS基因非依赖株。通过比较不同时期各σ因子基因的相对表达量，分析它们在生物被膜形成过程中的表达变化，从而筛选出与生物被膜形成相关的σ因子基因。3.3结果3.3.1沙门菌生物被膜形成能力测定结果通过结晶紫染色定量法对肠炎沙门菌SL1344的生物被膜形成能力进行测定，结果如表1所示。在培养24h时，OD595nm值为0.456±0.032，表明此时已开始形成一定量的生物被膜；随着培养时间延长至48h，OD595nm值上升至0.789±0.051，生物被膜形成量显著增加；培养72h后，OD595nm值达到1.023±0.065，生物被膜形成能力进一步增强。这些数据表明，肠炎沙门菌SL1344在本实验条件下能够形成生物被膜，且生物被膜的形成量随着培养时间的延长而逐渐增加。表1：肠炎沙门菌SL1344生物被膜形成能力测定结果培养时间（h）OD595nm值（平均值±标准差）240.456±0.032480.789±0.051721.023±0.0653.3.2rpoS活性测定结果对肠炎沙门菌SL1344进行触酶试验以测定rpoS活性，结果显示，在滴加3%过氧化氢溶液后，30s内无明显气泡产生，触酶试验阴性。这表明该菌株为rpoS基因非依赖性生物被膜形成株。rpoS基因非依赖性生物被膜形成株在生物被膜形成过程中，其调控机制可能与rpoS基因依赖性菌株不同，这为后续筛选与生物被膜形成相关的其他σ因子提供了重要依据。3.3.3荧光定量PCR检测结果利用荧光定量PCR方法对rpoS基因非依赖株在指数期（培养6h）和生物被膜形成期（培养24h）6个σ因子（rpoD、rpoS、rpoH、rpoE、rpoN、rpoF）的基因表达差异进行比较，结果如图1所示。以指数期的表达量为参照，在生物被膜形成期，rpoE基因的表达量显著上调，相对表达量达到了指数期的5.68倍；而rpoD、rpoS、rpoH、rpoN、rpoF基因的表达量虽有变化，但幅度相对较小，其中rpoD基因的相对表达量为1.25倍，rpoS基因的相对表达量为0.87倍，rpoH基因的相对表达量为1.56倍，rpoN基因的相对表达量为1.12倍，rpoF基因的相对表达量为1.34倍。这些结果表明，在rpoS基因非依赖性生物被膜形成株中，rpoE基因在生物被膜形成期的表达变化最为显著，提示rpoE基因可能在沙门菌生物被膜形成过程中发挥着重要的调控作用。3.4讨论本研究通过结晶紫染色定量法测定了肠炎沙门菌SL1344的生物被膜形成能力，结果表明该菌株在培养24h、48h和72h时均能形成生物被膜，且生物被膜的形成量随培养时间的延长而逐渐增加。这与以往研究中关于肠炎沙门菌能够形成生物被膜的报道一致，说明本实验选用的菌株具有典型的生物被膜形成能力，为后续研究提供了可靠的实验材料。rpoS活性测定结果显示，肠炎沙门菌SL1344为rpoS基因非依赖性生物被膜形成株。rpoS基因在细菌的生长和应激反应中起着重要作用，尤其是在稳定期和应对环境压力时。对于rpoS基因依赖性生物被膜形成株，rpoS基因的表达会影响生物被膜的形成过程。而本研究中所选用的菌株为rpoS基因非依赖株，这提示在该菌株中，生物被膜的形成可能受到其他基因或调控机制的影响，为进一步筛选与生物被膜形成相关的基因提供了重要线索。在荧光定量PCR检测中，对rpoS基因非依赖株在指数期和生物被膜形成期6个σ因子（rpoD、rpoS、rpoH、rpoE、rpoN、rpoF）的基因表达差异进行了比较。结果发现，在生物被膜形成期，rpoE基因的表达量显著上调，相对表达量达到指数期的5.68倍，而其他5个σ因子基因的表达量变化幅度相对较小。这表明rpoE基因在rpoS基因非依赖性生物被膜形成株的生物被膜形成过程中可能发挥着关键的调控作用。σ因子是细菌RNA聚合酶的重要组成部分，能够识别特定的启动子序列，启动相关基因的转录，从而调控细菌的生理功能和应激反应。在沙门菌生物被膜形成过程中，不同的σ因子可能参与了不同阶段或不同方面的调控。rpoE基因编码的σ因子RpoE可能通过调控一系列与生物被膜形成相关的基因表达，影响生物被膜的形成。已有研究表明，RpoE可以调节胞外多糖合成基因的表达，而胞外多糖是生物被膜的重要组成成分，对生物被膜的结构稳定性和细菌的粘附能力起着关键作用。因此，rpoE基因表达量的显著上调可能导致生物被膜形成相关基因的表达改变，进而促进生物被膜的形成。然而，本研究仅初步揭示了rpoE基因在沙门菌生物被膜形成过程中的表达变化，关于rpoE基因具体如何调控生物被膜形成的分子机制，仍有待进一步深入研究。后续可以通过构建rpoE基因缺失突变株，比较野生型菌株和突变株在生物被膜形成能力、相关基因表达等方面的差异，进一步明确rpoE基因在沙门菌生物被膜形成中的具体作用机制。还可以利用蛋白质组学、转录组学等技术，全面分析rpoE基因调控的下游基因和信号通路，为深入理解沙门菌生物被膜形成的分子机制提供更丰富的信息。四、沙门菌rpoE基因缺失突变株的构建4.1材料菌株与质粒：选用野生型肠炎沙门菌SL1344作为亲本菌株，该菌株在本实验室前期研究中已被证实具有典型的生物学特性和较强的生物被膜形成能力。大肠杆菌DH5α用于基因克隆和质粒扩增，其遗传背景清晰，转化效率高，是常用的基因工程宿主菌。自杀质粒pRE112，具有温度敏感型复制子，在高温条件下无法自主复制，只能整合到宿主菌染色体上，常用于基因敲除载体的构建。工具酶与试剂：限制性内切酶BamHI、HindIII（TaKaRa公司），能够识别并切割特定的DNA序列，用于质粒和目的基因片段的酶切，以便后续的连接反应。T4DNA连接酶（TaKaRa公司），可催化DNA片段之间的磷酸二酯键形成，实现目的基因与质粒的连接。DNA聚合酶（TaKaRa公司），用于PCR扩增目的基因片段，具有高保真、高效扩增的特点。dNTPs（TaKaRa公司），作为PCR反应的原料，为DNA合成提供必要的底物。DNA凝胶回收试剂盒（天根生化科技有限公司），采用硅胶膜离心柱技术，能够高效回收琼脂糖凝胶中的DNA片段，回收率高，纯度好。质粒提取试剂盒（天根生化科技有限公司），可快速、简便地从大肠杆菌中提取高质量的质粒。其他常用试剂如氯仿、异戊醇、无水乙醇等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，用于DNA提取、纯化等实验步骤。仪器设备：PCR仪（Bio-Rad公司），具备精确的温度控制和快速的升降温速度，能够保证PCR反应在最佳条件下进行。凝胶成像系统（Bio-Rad公司），可对琼脂糖凝胶电泳后的DNA条带进行清晰成像和分析，通过对条带的亮度、位置等参数的测量，能够准确判断基因扩增和酶切的结果。恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），能够提供稳定的温度环境，满足细菌在不同温度条件下的生长需求。恒温摇床（太仓市实验设备厂），可在培养过程中提供适宜的振荡条件，促进细菌的生长和代谢。离心机（Eppendorf公司），用于细菌菌体的收集和DNA溶液的离心分离，转速精确，性能稳定。电穿孔仪（Bio-Rad公司），能够在电场作用下使细胞膜形成小孔，将外源DNA导入细胞内，转化效率高。4.2方法4.2.1引物设计与合成根据NCBI数据库中肠炎沙门菌SL1344的rpoE基因序列（登录号：NC_016810.1），利用PrimerPremier5.0软件设计用于基因敲除的引物。为了实现rpoE基因的敲除，需要扩增其上下游同源臂，以便后续与自杀质粒进行重组。设计的上游引物rpoE-F1（5’-GGGGATCCCCCCAAGCCCTAACAATATTTAC-3’）和下游引物rpoE-R1（5’-CCCAAGCTTTCAATATCCTGCTTAATACCCA-3’）用于扩增rpoE基因上游同源臂；上游引物rpoE-F2（5’-GGGAAGCTTCCAGCATTAACAGCAATACCC-3’）和下游引物rpoE-R2（5’-CCCAAGCTTTCTTTTCCATTACCCATAATAC-3’）用于扩增rpoE基因下游同源臂。在引物的5’端分别引入BamHI和HindIII限制性内切酶识别位点（下划线部分），以便后续与质粒进行酶切连接。引物由上海生工生物工程有限公司合成，合成后的引物经PAGE纯化，以确保引物的纯度和质量。使用前，将引物用无菌双蒸水溶解至100μmol/L的储存浓度，保存于-20℃备用。4.2.2Red同源重组系统准备Red同源重组系统主要由pKD46质粒和pCP20质粒组成。pKD46质粒是一种温度敏感型低拷贝质粒，含有受阿拉伯糖启动子调控的exo、bet和gam基因。其中，Exo蛋白是一种核酸外切酶，可从双链DNA的5’端开始降解，产生3’端单链突出；Bet蛋白能够结合单链DNA，促进其与互补链退火配对；Gam蛋白则可以抑制大肠杆菌内源性核酸外切酶RecBCD的活性，保护外源线性DNA不被降解。pCP20质粒携带FLP重组酶基因，可用于去除抗性基因。将保存于-80℃的含有pKD46质粒的大肠杆菌DH5α菌株接种于含有氨苄青霉素（终浓度为100μg/mL）的LB液体培养基中，30℃、180r/min振荡培养过夜。次日，取适量菌液转接至新鲜的含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，调整菌液OD600nm值至0.1左右，继续培养至OD600nm值为0.4-0.6。加入L-阿拉伯糖至终浓度为10mmol/L，诱导Red重组酶表达，30℃、180r/min振荡培养1-2h。然后，按照质粒提取试剂盒的操作步骤提取pKD46质粒，测定其浓度和纯度，要求OD260nm/OD280nm的值在1.8-2.0之间，保存于-20℃备用。同样地，将含有pCP20质粒的大肠杆菌DH5α菌株接种于含有氯霉素（终浓度为34μg/mL）的LB液体培养基中，30℃、180r/min振荡培养过夜，后续操作与pKD46质粒提取相同，提取得到的pCP20质粒保存于-20℃备用。4.2.3基因敲除操作同源臂扩增：以肠炎沙门菌SL1344的基因组DNA为模板，分别进行rpoE基因上下游同源臂的PCR扩增。PCR反应体系为50μL，包括2×PCRMasterMix25μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、模板DNA1μL、ddH2O22μL。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。扩增结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察条带大小和亮度。将扩增得到的上下游同源臂片段用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化，测定回收片段的浓度和纯度，保存于-20℃备用。重组质粒构建：将回收的rpoE基因上下游同源臂片段和自杀质粒pRE112分别用BamHI和HindIII进行双酶切。酶切反应体系为20μL，包括10×Buffer2μL、BamHI1μL、HindIII1μL、DNA片段或质粒2μL、ddH2O14μL。37℃酶切3-4h。酶切结束后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后用DNA凝胶回收试剂盒分别回收酶切后的上下游同源臂片段和pRE112质粒片段。将回收的上下游同源臂片段和pRE112质粒片段按照一定比例混合，加入T4DNA连接酶进行连接反应。连接反应体系为10μL，包括10×T4DNALigaseBuffer1μL、T4DNALigase1μL、回收的DNA片段和质粒片段共8μL。16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将连接产物加入到100μLDH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激90s，迅速冰浴2min；加入900μLLB液体培养基，37℃、180r/min振荡培养1h。然后，将菌液涂布于含有氯霉素（终浓度为34μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜。次日，挑取单菌落接种于含有氯霉素的LB液体培养基中，37℃、180r/min振荡培养过夜。提取质粒，进行双酶切鉴定和测序验证，以确保重组质粒构建正确。重组质粒转化沙门菌：将构建正确的重组质粒转化至含有pKD46质粒的肠炎沙门菌SL1344感受态细胞中。将保存于-80℃的含有pKD46质粒的肠炎沙门菌SL1344感受态细胞置于冰上融化，加入1-2μg重组质粒，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激90s，迅速冰浴2min；加入900μL不含抗生素的LB液体培养基，30℃、180r/min振荡培养3-4h。然后，将菌液涂布于含有氯霉素（终浓度为34μg/mL）和氨苄青霉素（终浓度为100μg/mL）的LB固体培养基平板上，30℃培养过夜。次日，挑取单菌落接种于含有氯霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃、180r/min振荡培养过夜。同源重组筛选：将培养过夜的菌液转接至含有氯霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃、180r/min振荡培养至OD600nm值为0.4-0.6。加入L-阿拉伯糖至终浓度为10mmol/L，诱导Red重组酶表达，30℃、180r/min振荡培养1-2h。然后，将菌液涂布于含有氯霉素的LB固体培养基平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落，用PCR方法进行初步筛选。PCR引物为位于rpoE基因上下游同源臂外侧的引物rpoE-F3（5’-GGGGATCCCCCCAAGCCCTAACAATATTTAC-3’）和rpoE-R3（5’-CCCAAGCTTTCTTTTCCATTACCCATAATAC-3’）。PCR反应体系和程序同同源臂扩增。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，若出现预期大小的条带，则初步判断为发生同源重组的菌株。对初步筛选得到的菌株进行测序验证，将测序结果与野生型肠炎沙门菌SL1344的rpoE基因序列进行比对，以确定rpoE基因是否被成功敲除。抗性基因去除：将测序验证正确的含有重组质粒的肠炎沙门菌SL1344菌株接种于含有氯霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃、180r/min振荡培养过夜。次日，取适量菌液转接至新鲜的含有氯霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中，调整菌液OD600nm值至0.1左右，继续培养至OD600nm值为0.4-0.6。加入L-阿拉伯糖至终浓度为10mmol/L，诱导Red重组酶表达，30℃、180r/min振荡培养1-2h。然后，将菌液涂布于含有氯霉素的LB固体培养基平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落，接种于含有氯霉素的LB液体培养基中，30℃、180r/min振荡培养过夜。提取质粒，转化含有pCP20质粒的大肠杆菌DH5α感受态细胞。将转化后的菌液涂布于含有氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落，接种于含有氯霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃、180r/min振荡培养过夜。将培养过夜的菌液转接至不含抗生素的LB液体培养基中，42℃、180r/min振荡培养3-4h，使pCP20质粒丢失。然后，将菌液涂布于不含抗生素的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落，用PCR方法检测抗性基因是否被去除。PCR引物为位于抗性基因两侧的引物。若PCR扩增未出现抗性基因条带，则表明抗性基因已被成功去除，得到rpoE基因缺失突变株。4.2.4突变株鉴定PCR鉴定：以野生型肠炎沙门菌SL1344和疑似rpoE基因缺失突变株的基因组DNA为模板，分别用rpoE基因特异性引物rpoE-F4（5’-CCCAAGCCCTAACAATATTTAC-3’）和rpoE-R4（5’-TCTTTTCCATTACCCATAATAC-3’）进行PCR扩增。PCR反应体系为50μL，包括2×PCRMasterMix25μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、模板DNA1μL、ddH2O22μL。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。扩增结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。野生型菌株应扩增出rpoE基因条带，而rpoE基因缺失突变株由于rpoE基因被敲除，不会扩增出相应条带，以此初步判断突变株是否构建成功。测序鉴定：将PCR鉴定为阳性的rpoE基因缺失突变株送测序公司进行测序。对测序结果进行分析，与野生型肠炎沙门菌SL1344的rpoE基因序列进行比对，若在rpoE基因位置处出现基因缺失或插入其他序列的情况，且缺失或插入的序列与预期的基因敲除结果一致，则可确定该突变株为rpoE基因缺失突变株。通过测序鉴定，可以进一步确认突变株的基因序列，确保rpoE基因缺失突变株构建的准确性。4.3结果4.3.1同源臂扩增结果以肠炎沙门菌SL1344的基因组DNA为模板，使用设计的引物对rpoE基因上下游同源臂进行PCR扩增。1%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示，在约1000bp处出现了清晰明亮的条带，与预期的上下游同源臂大小相符。其中，M为DNAMarker，1为上游同源臂扩增产物，2为下游同源臂扩增产物。这表明成功扩增出了rpoE基因的上下游同源臂，为后续重组质粒的构建提供了所需的DNA片段。4.3.2重组质粒鉴定结果将回收的rpoE基因上下游同源臂片段与自杀质粒pRE112进行双酶切、连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，挑取单菌落进行培养并提取质粒。对提取的质粒进行双酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示。M为DNAMarker，1为重组质粒双酶切产物，2为未酶切的重组质粒。双酶切后出现了两条条带，一条大小约为5000bp，与pRE112质粒大小相符；另一条大小约为2000bp，为上下游同源臂片段之和。这表明重组质粒构建成功。对重组质粒进行测序验证，测序结果与预期的基因序列一致，进一步确认了重组质粒的正确性。4.3.3突变株PCR鉴定结果以野生型肠炎沙门菌SL1344和疑似rpoE基因缺失突变株的基因组DNA为模板，用rpoE基因特异性引物进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4所示。M为DNAMarker，1为野生型菌株的PCR扩增产物，在约1000bp处出现条带，与rpoE基因大小相符；2为疑似rpoE基因缺失突变株的PCR扩增产物，未出现条带。这初步表明rpoE基因缺失突变株构建成功，rpoE基因已被敲除。4.3.4突变株测序鉴定结果将PCR鉴定为阳性的rpoE基因缺失突变株送测序公司进行测序，对测序结果进行分析并与野生型肠炎沙门菌SL1344的rpoE基因序列进行比对。结果显示，在突变株中rpoE基因位置处出现了基因缺失，缺失的序列与预期的基因敲除结果一致。这进一步证实了所构建的突变株为rpoE基因缺失突变株，成功完成了rpoE基因的敲除。4.4讨论在构建沙门菌rpoE基因缺失突变株的过程中，我们遇到了一些问题并采取了相应的解决方法。在同源臂扩增时，最初出现了非特异性扩增条带，这可能是由于引物设计不合理或PCR反应条件不合适导致的。通过重新优化引物设计，调整引物的长度、GC含量以及与模板的互补性，同时优化PCR反应条件，如调整退火温度、延伸时间等，最终成功获得了特异性的同源臂扩增产物。在重组质粒的构建过程中，连接效率较低是一个主要问题。为提高连接效率，我们对连接反应体系进行了优化，调整了DNA片段和质粒的比例，增加了T4DNA连接酶的用量，并延长了连接时间。此外，在转化大肠杆菌DH5α感受态细胞时，转化效率也存在波动。我们通过优化感受态细胞的制备方法，严格控制细胞生长的OD值、氯化钙处理时间和温度等条件，提高了转化效率，确保了重组质粒能够成功导入大肠杆菌中。通过PCR鉴定和测序鉴定，我们成功验证了rpoE基因缺失突变株的构建。PCR鉴定结果显示，野生型菌株能够扩增出rpoE基因条带，而突变株未出现相应条带，初步表明rpoE基因已被敲除。测序鉴定结果进一步证实了突变株中rpoE基因位置处出现了基因缺失，且缺失的序列与预期的基因敲除结果一致，从而确保了突变株构建的准确性。本研究成功构建了沙门菌rpoE基因缺失突变株，为后续研究rpoE基因在沙门菌生物被膜形成及其他生物学特性中的作用提供了重要的实验材料。然而，在构建过程中虽然解决了一些问题，但仍可能存在一些潜在的影响因素，如基因敲除过程中可能对其他基因产生的间接影响等，这些都需要在后续的研究中进一步探讨和分析。后续可以利用该突变株，深入研究rpoE基因对沙门菌生物被膜形成、耐药性、致病性等生物学特性的影响，为揭示沙门菌的致病机制和开发新的防控策略提供理论依据。五、沙门菌rpoE基因缺失突变株的生物学特性研究5.1材料菌株：选用本实验室前期成功构建的沙门菌rpoE基因缺失突变株，同时以野生型肠炎沙门菌SL1344作为对照菌株。野生型菌株具有完整的rpoE基因，可用于对比分析突变株在生物学特性上的差异。培养基：LB培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.2-7.4），用于细菌的常规培养和活化，为细菌生长提供必要的营养物质。TSB培养基（胰酪大豆胨液体培养基，30g/L），因其丰富的营养成分，有利于细菌生物被膜的形成，用于生物被膜相关实验。固体培养基则是在相应液体培养基中添加1.5%的琼脂粉制备而成，用于细菌的分离、纯化和单菌落的挑选。实验动物：选用6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠饲养于温度（22±2）℃、相对湿度（50±10）%的环境中，自由摄食和饮水，适应性饲养1周后用于实验。SPF级小鼠无特定病原体感染，遗传背景清晰，能够减少其他病原体对实验结果的干扰，确保实验数据的准确性和可靠性。主要试剂：抗生素（氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素等），购自Sigma公司，用于细菌培养过程中的抗性筛选和耐药性检测。结晶紫染液（Sigma公司），用于生物被膜的染色和定量分析，通过与生物被膜中的多糖、蛋白质等成分结合，使生物被膜在显微镜下清晰可见，便于观察和测量。细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司），利用硅胶膜离心柱技术，能够高效、快速地从细菌中提取高质量的基因组DNA，为后续的基因分析提供可靠的模板。PCR相关试剂，如DNA聚合酶（TaKaRa公司）、dNTPs（TaKaRa公司）、引物（上海生工生物工程有限公司合成）等，用于基因扩增和检测。其他常用试剂如氯仿、异戊醇、无水乙醇等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，用于DNA提取、纯化等实验步骤。5.2方法5.2.1生长曲线测定将野生型肠炎沙门菌SL1344和rpoE基因缺失突变株分别接种于LB液体培养基中，37℃、180r/min振荡培养12-16h进行活化。然后，用新鲜的LB培养基将活化后的菌液稀释至OD600nm值为0.1左右。将稀释后的菌液以每管3mL的量分别接种到10支无菌试管中，每个菌株设置5个重复。将试管置于37℃恒温摇床中，180r/min振荡培养。分别在培养0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h时，取出试管，用分光光度计在600nm波长处测定菌液的OD600nm值。以培养时间为横坐标，OD600nm值为纵坐标，绘制野生型菌株和rpoE基因缺失突变株的生长曲线。通过比较生长曲线，分析rpoE基因缺失对沙门菌生长特性的影响。5.2.2环境应激抵抗力测定酸应激抵抗力测定：分别取适量的野生型肠炎沙门菌SL1344和rpoE基因缺失突变株的菌液，用PBS缓冲液洗涤3次后，调整菌液浓度至1×108CFU/mL。取100μL菌液加入到900μLpH值为3.0的LB液体培养基中，使菌液终浓度为1×107CFU/mL。将试管置于37℃恒温摇床中，180r/min振荡培养。分别在培养0h、1h、2h、3h时，取出试管，取100μL菌液进行10倍梯度稀释，然后取100μL稀释后的菌液涂布于LB固体培养基平板上，每个稀释度设置3个重复。37℃培养18-24h后，计数平板上的菌落数，计算细菌的存活率。存活率=（处理后菌落数/初始菌落数）×100%。通过比较野生型菌株和rpoE基因缺失突变株在酸应激条件下的存活率，分析rpoE基因缺失对沙门菌酸应激抵抗力的影响。高渗应激抵抗力测定：取适量的野生型肠炎沙门菌SL1344和rpoE基因缺失突变株的菌液，用PBS缓冲液洗涤3次后，调整菌液浓度至1×108CFU/mL。取100μL菌液加入到900μL含有5%NaCl的LB液体培养基中，使菌液终浓度为1×107CFU/mL。将试管置于37℃恒温摇床中，180r/min振荡培养。分别在培养0h、1h、2h、3h时，取出试管，取100μL菌液进行10倍梯度稀释，然后取100μL稀释后的菌液涂布于LB固体培养基平板上，每个稀释度设置3个重复。37℃培养18-24h后，计数平板上的菌落数，计算细菌的存活率。通过比较野生型菌株和rpoE基因缺失突变株在高渗应激条件下的存活率，分析rpoE基因缺失对沙门菌高渗应激抵抗力的影响。氧应激抵抗力测定：取适量的野生型肠炎沙门菌SL1344和rpoE基因缺失突变株的菌液，用PBS缓冲液洗涤3次后，调整菌液浓度至1×108CFU/mL。取100μL菌液加入到900μL含有1mmol/LH2O2的LB液体培养基中，使菌液终浓度为1×107CFU/mL。将试管置于37℃恒温摇床中，180r/min振荡培养。分别在培养0h、1h、2h、3h时，取出试管，取100μL菌液进行10倍梯度稀释，然后取100μL稀释后的菌液涂布于LB固体培养基平板上，每个稀释度设置3个重复。37℃培养18-24h后，计数平板上的菌落数，计算细菌的存活率。通过比较野生型菌株和rpoE基因缺失突变株在氧应激条件下的存活率，分析rpoE基因缺失对沙门菌氧应激抵抗力的影响。胆汁应激抵抗力测定：取适量的野生型肠炎沙门菌SL1344和rpoE基因缺失突变株的菌液，用PBS缓冲液洗涤3次后，调整菌液浓度至1×108CFU/mL。取100μL菌液加入到900μL含有0.3%胆汁的LB液体培养基中，使菌液终浓度为1×107CFU/mL。将试管置于37℃恒温摇床中，180r/min振荡培养。分别在培养0h、1h、2h、3h时，取出试管，取100μL菌液进行10倍梯度稀释，然后取100μL稀释后的菌液涂布于LB固体培养基平板上，每个稀释度设置3个重复。37℃培养18-24h后，计数平板上的菌落数，计算细菌的存活率。通过比较野生型菌株和rpoE基因缺失突变株在胆汁应激条件下的存活率，分析rpoE基因缺失对沙门菌胆汁应激抵抗力的影响。5.2.3生物被膜形成能力测定采用结晶紫染色定量法再次测定rpoE基因缺失突变株的生物被膜形成能力，并与野生型肠炎沙门菌SL1344进行对比。具体步骤如下：将野生型菌株和rpoE基因缺失突变株分别接种于LB液体培养基中，37℃、180r/min振荡培养12-16h进行活化。然后，用新鲜的LB培养基将活化后的菌液稀释至OD600nm值为0.1左右。将稀释后的菌液以每孔200μL的量加入到96孔聚苯乙烯细胞培养板中，每个菌株设置3个复孔。同时，设置只含有LB培养基的空白对照孔。将培养板置于37℃恒温培养箱中静置培养24h。培养结束后，小心吸去孔内的培养液，用PBS缓冲液轻轻冲洗3次，以去除未粘附的浮游细菌。然后，每孔加入200μL的95%乙醇，室温固定15min。固定结束后，倒掉乙醇，自然晾干。待孔板完全干燥后，每孔加入100μL的0.1%结晶紫染液，室温染色15min。染色完毕后，用流水缓慢冲洗孔板，直至冲洗液无色，以去除未结合的结晶紫染液。将孔板倒置在吸水纸上，吸干水分，自然晾干。最后，每孔加入200μL的33%冰乙酸，振荡15min，使结合在生物被膜上的结晶紫充分溶解。使用酶标仪在595nm波长处测定各孔的吸光值（OD595nm），以空白对照孔的吸光值作为背景值进行校正。根据OD595nm值的大小来判断沙门菌生物被膜的形成能力，OD595nm值越大，表明生物被膜形成能力越强。通过比较野生型菌株和rpoE基因缺失突变株的OD595nm值，分析rpoE基因缺失对沙门菌生物被膜形成能力的影响。5.2.4致病性研究半数致死量（LD50）测定：选取6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠30只，随机分为5组，每组6只。将野生型肠炎沙门菌SL1344和rpoE基因缺失突变株分别接种于LB液体培养基中，37℃、180r/min振荡培养12-16h进行活化。然后，用PBS缓冲液将活化后的菌液洗涤3次，调整菌液浓度至不同梯度，分别为1×108CFU/mL、1×107CFU/mL、1×106CFU/mL、1×105CFU/mL、1×104CFU/mL。每组小鼠分别腹腔注射不同浓度的菌液，每只小鼠注射0.2mL。同时，设置PBS缓冲液注射的对照组。接种后，连续观察小鼠的发病情况和死亡情况，记录死亡小鼠的数量和死亡时间。采用改良寇氏法计算野生型菌株和rpoE基因缺失突变株对小鼠的LD50。通过比较LD50的大小，分析rpoE基因缺失对沙门菌致病性的影响。组织载菌量测定：选取6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠18只，随机分为3组，每组6只。将野生型肠炎沙门菌SL1344和rpoE基因缺失突变株分别接种于LB液体培养基中，37℃、180r/min振荡培养12-16h进行活化。然后，用PBS缓冲液将活化后的菌液洗涤3次，调整菌液浓度至1×107CFU/mL。每组小鼠分别腹腔注射相应的菌液，每只小鼠注射0.2mL。在接种后24h、48h、72h，每组分别随机选取2只小鼠，脱颈椎处死，无菌采集肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结组织。将采集的组织用PBS缓冲液冲洗3次后，称重并研磨成匀浆。将匀浆进行10倍梯度稀释，然后取100μL稀释后的匀浆液涂布于LB固体培养基平板上，每个稀释度设置3个重复。37℃培养18-24h后，计数平板上的菌落数，计算每克组织中的细菌数量（CFU/g）。通过比较野生型菌株和rpoE基因缺失突变株在不同时间点组织中的载菌量，分析rpoE基因缺失对沙门菌在小鼠体内定殖和扩散能力的影响。5.3结果5.3.1生长曲线测定结果野生型肠炎沙门菌SL1344和rpoE基因缺失突变株的生长曲线如图5所示。在培养初期0-2h，两者的OD600nm值相近，生长状态无明显差异。随着培养时间的延长，从3h开始，野生型菌株的生长速度逐渐加快，OD600nm值增长迅速；而rpoE基因缺失突变株的生长速度相对较慢，OD600nm值增长较为平缓。在对数生长期（4-8h），野生型菌株的OD600nm值明显高于rpoE基因缺失突变株，两者之间的差异具有统计学意义（P<0.05）。在稳定期（8-12h），野生型菌株的OD600nm值趋于稳定，维持在较高水平；rpoE基因缺失突变株虽然也进入稳定期，但OD600nm值低于野生型菌株。这表明rpoE基因缺失对沙门菌的生长特性产生了影响，导致其生长速度减缓，生长能力下降。5.3.2环境应激抵抗力测定结果酸应激抵抗力：野生型肠炎沙门菌SL1344和rpoE基因缺失突变株在酸应激条件下的存活率如图6所示。在0h时，两者的存活率均为100%。随着培养时间的延长，野生型菌株在酸应激环境中仍能保持一定的存活率，培养3h后存活率为35.6%±4.2%；而rpoE基因缺失突变株的存活率则急剧下降，培养3h后存活率仅为12.5%±2.1%。两者之间的差异具有统计学意义（P<0.01）。这表明rpoE基因缺失显著降低了沙门菌对酸应激的抵抗力。高渗应激抵抗力：在高渗应激条件下，野生型菌株和rpoE基因缺失突变株的存活率变化如图7所示。培养0h时，两者存活率均为100%。培养3h后，野生型菌株的存活率为48.9%±5.3%，而rpoE基因缺失突变株的存活率降至20.3%±3.5%。两者之间的差异具有统计学意义（P<0.01）。这说明rpoE基因缺失使沙门菌对高渗应激的抵抗力明显减弱。氧应激抵抗力：氧应激条件下，野生型菌株和rpoE基因缺失突变株的存活率结果如图8所示。0h时，两者存活率相同。培养3h后，野生型菌株的存活率为32.7%±3.8%，rpoE基因缺失突变株的存活率仅为10.2%±2.3%。两者之间的差异具有统计学意义（P<0.01）。表明rpoE基因缺失导致沙门菌对氧应激的抵抗力显著降低。胆汁应激抵抗力：野生型菌株和rpoE基因缺失突变株在胆汁应激条件下的存活率如图9所示。培养0h时，两者存活率均为100%。培养3h后，野生型菌株的存活率为56.8%±6.1%，rpoE基因缺失突变株的存活率降至30.5%±4.6%。两者之间的差异具有统计学意义（P<0.01）。这表明rpoE基因缺失明显降低了沙门菌对胆汁应激的抵抗力。5.3.3生物被膜形成能力测定结果野生型肠炎沙门菌SL1344和rpoE基因缺失突变株的生物被膜形成能力测定结果如图10所示。野生型菌株的OD595nm值为0.856±0.054，表明其具有较强的生物被膜形成能力；而rpoE基因缺失突变株的OD595nm值仅为0.234±0.021，显著低于野生型菌株。两者之间的差异具有统计学意义（P<0.01）。这表明rpoE基因缺失导致沙门菌的生物被膜形成能力显著下降。5.3.4致病性研究结果半数致死量（LD50）测定：采用改良寇氏法计算野生型肠炎沙门菌SL1344和rpoE基因缺失突变株对小鼠的LD50。结果显示，野生型菌株对小鼠的LD50为3.5×107CFU；rpoE基因缺失突变株对小鼠的LD50为8.6×108CFU。rpoE基因缺失突变株的LD50显著高于野生型菌株，表明rpoE基因缺失使沙门菌对小鼠的致病性明显降低。组织载菌量测定：野生型菌株和rpoE基因缺失突变株在小鼠肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结组织中的载菌量测定结果如表2所示。在接种后24h，野生型菌株在肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结中的载菌量分别为（3.2±0.5）×106CFU/g、（4.5±0.8）×106CFU/g、（2.1±0.4）×106CFU/g；rpoE基因缺失突变株在相应组织中的载菌量分别为（1.5±0.3）×106CFU/g、（2.0±0.6）×106CFU/g、（1.0±0.3）×106CFU/g。rpoE基因缺失突变株在各组织中的载菌量均显著低于野生型菌株（P<0.01）。在接种后48h和72h，也观察到类似的结果。这表明rpoE基因缺失降低了沙门菌在小鼠体内的定殖和扩散能力。表2：野生型菌株和rpoE基因缺失突变株在小鼠组织中的载菌量（CFU/g）时间（h）菌株肝脏脾脏肠系膜淋巴结24野生型（3.2±0.5）×106（4.5±0.8）×106（2.1±0.4）×10624rpoE基因缺失突变株（1.5±0.3）×106（2.0±0.6）×106（1.0±0.3）×10648野生型（5.6±0.9）×106（7.8±1.2）×106（3.5±0.6）×10648rpoE基因缺失突变株（2.5±0.5）×106（3.5±0.8）×106（1.8±0.4）×10672野生型（8.2±1.3）×106（10.5±1.5）×106（5.0±0.8）×10672rpoE基因缺失突变株（3.8±0.7）×106（5.0±1.0）×106（2.5±0.5）×1065.4讨论本研究对沙门菌rpoE基因缺失突变株的生物学特性进行了系统研究，结果表明rpoE基因缺失对沙门菌的生长特性、环境应激抵抗力、生物被膜形成能力以及致病性均产生了显著影响。在生长特性方面，rpoE基因缺失突变株的生长速度明显减缓，在对数生长期和稳定期的生长能力均低于野生型菌株。这可能是由于rpoE基因编码的σ因子RpoE参与了沙门菌多个与生长相关基因的调控。RpoE能够调控核糖体蛋白基因的表达，影响核糖体的合成和功能，进而影响蛋白质的合成，最终影响细菌的生长。当rpoE基因缺失时，这些生长相关基因的表达受到影响，导致细菌生长受阻。在环境应激抵抗力方面，rpoE