CN119432800A 处理核酸样本的方法 （生物辐射实验室股份有限公司）

201980046778.72019.05.16本公开提供了用于扩增和分析核酸样本的录酶制备cDNA和/或DNA分子以及cDNA和/或DNA22.根据权利要求20所述的非天然存在的酶，其中所述非天然存在的酶具有与SEQID每一种包含(i)来源于非逆转录病毒转座子或来源于R2逆转录转座子的手指域；(ii)来源(b)使所述反应混合物经受足以扩增所述RNA和DNA的条件，由此得到所述RNA和所述4.根据权利要求3所述的方法，其中所述DNA为来源于所述反应混合物中的RNA子集的(a)将细胞和非天然存在的逆转录酶分区在分区中，所述细胞包含核糖核酸(RNA)分6.根据权利要求3所述的方法，其中所述非天然存在的逆转录酶具有与SEQIDNO:1_ii.非天然存在的逆转录酶，其中所述非天然存在的逆转录酶具有与SEQIDNO:1_208.一种用于处理包含不同类型核糖核酸(RNA)的样本的方法，其包含在被封阻进行转录的核糖体核糖核酸(rRNA)分子存在下使用所述RNA分子合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)分(c)在所述一种或多种RNA片段复合物的存在下使用逆转录酶由所述RNA合成至少一种(a)提供包含所述单链核酸分子和非天然存在的酶的反应混合物，其中所述非天然存3(b)使所述反应混合物经受足以使用所述非天然存在的酶将个别的核苷酸掺入至与所13.根据权利要求10所述的方法，其中所述足以直接对所述核酸分子进行测序的条件14.根据权利要求10所述的方法，其中所述足以直接对所述核酸分子进行测序的条件15.根据权利要求10所述的方法，其中所述足以直接对所述核酸分子进行测序的条件16.根据权利要求10所述的方法，其中所述足以直接对所述核酸分子进行测序的条件(a)用天然存在的酶由一种或多种核糖核酸(RNA)制备互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子，其中所述一种或多种核糖核酸(RNA)来源于受试者的原位组织或来源于所述受试者的固定iv)来源于R2逆转录转座子的核酸内切酶域；由此从所述受试者的所述原位组织或从18.根据权利要求17所述的方法，其中所述受试者的所述固定离体组织被固定在甲醛19.根据权利要求17所述的方法，其中所述受试者的所述固定离体组织被固定在石蜡4其中所述非天然存在的R2酶以3'至5'次序将来自所述一个或多个脱磷酸化的片段化24.根据权利要求21所述的方法，其在加入所述非天然存在的R2酶之前进一步包含去25.根据权利要求21所述的方法，其中用固定的其中所述非天然存在的R2酶使用不与模板互补的多个ssDNA引物引发逆转录，其中在其中所述非天然存在的R2酶使用不与模板互补的多个ssDNA引物引发逆转录，其中在(b)将第一接头分子掺入所述合成cDNA分子的3'并将第二接头分子掺入所述合成cDNA(c)用与所述rDNA序列互补的修饰寡核苷酸探针执行至多10个循环的聚合酶链式反应(d)在所述杂交产物结合于所述固体载体的同时从所述反应混合物去除所述合成30.根据权利要求29所述的方法，在步骤(c)中执行至多5个循环的聚合酶链式反应531.根据权利要求30所述的方法，其中在步骤(c)中执行单个循环的聚合酶链式反应34.根据权利要求29所述的方法，其中所述经过修饰的寡核苷酸探针为生物素寡核苷37.根据权利要求29所述的方法，其在步骤(c)之前进一步包含对(b)中产生的所述38.根据权利要求37所述的方法，其中在步骤(c)之前对步骤(b)中产生的所述cDNA分39.根据权利要求29所述的方法，其中用具有20个核苷酸或更长核苷酸的持续合成能(a)通过将以下各物加入到包含RNA分子的反应容器，从核糖核酸(RNA)分子合成在第一5'末端避免酶促降解并且在第二5'末端未保护的不对称的双链脱氧所述合成在足以允许合成所述不对称的双链脱氧核糖核酸分子的及(c)通过使多种探针之一与所述多种RNA杂交并执行下拉反应从所述(b)的产物耗减所6(d)基于所述RNA测序反应选择所关注细胞并鉴定与所述所关注细胞相关的独特条形(e)使引物和与所述所关注细胞相关的所述独特条形码杂交并在所述杂交样本中执行47.根据权利要求46所述的方法，其进一步包含选择所关注细胞群体并从所述群体鉴(b)从来自所述解离样本的所述多个核酸模板合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子，其中所述cDNA分子用具有20个核苷酸或更长核苷酸的持续合成能力的非天然存在的R2酶合49.根据权利要求48所述的方法，其中所述反应在足以驱动所述溶解反应的温度下执53.根据权利要求48所述的方法，其中所述非天然存在的R2酶在所述清洁剂存在下合54.根据权利要求48所述的方法，其在步骤(b)之前进一步包含(b)将第一接头分子掺入来自所述解离样本的所述多个核酸模板的3'并将第二接头分子掺入来自所述解离样本55.根据权利要求54所述的方法，其在步骤(56.根据权利要求55所述的方法，其在步骤(b)之前进一步包含去除包含2'_3'环状磷57.根据权利要求56所述的方法，其在步骤(b)之前进一步包含将多聚A加入到来自所7[0002]本申请要求2018年5月16日提出的第62/672,480号美国临时申请以及2018年12月[0003]用于研究活细胞中的基因表达的常用技术为由核糖核酸(RNA)分子产生互补脱氧作模板来利用具有逆转录酶活性的酶产生RNA序列的cD[0005]逆转录酶同时具有RNA引导的DNA聚合酶活性和DNA引导的DNA聚合酶活性。RNA模凝胶电泳等等。由非特异性逆转录酶活性产生的非特异性cDNA模板在例如实时PCR等应用[0006]数种方法可用于获得来自单细胞的转录组数据。一种先驱方法使用逆转录酶和转录物而言，并且当以较低量(LQ)细胞为起始物质时需要进行多轮处理，这进一步加剧8[0010]在一些情况下，本公开提供了一种用于同时扩增核糖核酸(RNA)分子和脱氧核糖该非天然存在的酶中的每一种包含：(i)来源于非逆转录病毒转座子或来源于R2逆转录转[0011]在一些情况下，本公开提供了一种用于制备互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子的方9酶从该RNA分子合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库，该非天然存在的转录酶以20个核苷酸液滴可以通过使第一相与不与该第一相混溶的第二相接触，例如使水相与油相接触来形[0013]在一些情况下，本公开提供了一种用于处理包含不同类型核糖核酸(RNA)的样本的方法，其包含在被封阻进行转录的核糖体核糖核酸(rRNA)分子存在下使用该等RNA分子[0014]在一些情况下，本公开提供了一种用于处理包含核糖核酸(RNA)分子的混合物的一个子集互补，由此提供一种或多种包含与该等RNA片段的该至少该子集杂交的该一个或多个单链核酸序列的RNA片段复合物；以及(c)在该一种或多种RNA片段复合物的存在下使用逆转录酶由该RNA合成至少一种互补脱氧核糖核酸(cDN(a)提供包含该单链核酸分子和非天然存在的酶的反应混合物，其中该内切酶域；(b)使该反应混合物经受足以使用该非天然存在的酶将个别的核苷酸掺入至与以直接对该单链核酸分子进行测序的条件包含基于场效应晶体管的单分子测源于受试者的原位组织或来源于该受试者的固定离体组织，其中该非天然存在的酶包含：将来自该一个或多个脱磷酸化的片段化RNA的序列逆转录，其中在到达该一个或多个脱磷火的引物接头。在一些情况下，用固定的多聚A低聚物去除该一个或多个未退火的引物接能力的非天然存在的R2酶，其中该非天然存在的R2酶使用不与模板互补的多个ssDNA引物ssDNA引物引发逆转录，其中在到达该等片段化RNA的5'末端时该酶跳跃至该受体接头的分子掺入该合成cDNA分子的3'并将第二接头分子掺入该合成cDNA的5'末端；(c)用与该rDNA序列互补的经过修饰的寡核苷酸探针执行最多10个循环的聚合酶链式反应(PCR)，其应混合物中的该固体载体的杂交产物；(d)在该杂交产物结合于该固体载体的同时从该反含：(a)在足以允许合成不对称的双链脱氧核糖核酸分子的条件下通过将以下各物加入到之一与该多种RNA杂交并执行下拉反应从该(b)的产物耗减该多种等核酸模板包含核糖核酸；(b)从来自该解离样本的该多个核酸模板合成互补脱氧核糖核[0025]本公开的其它方面和优点将根据以下详细描述而变得为本领域技术人员显而易单独地指示以引用的方式并入相同。在以引用的方式并入的公开案和专利、专利申请或NCBI登记号与本说明书中所含的公开内容相矛盾的情况下，本说明书打算替代和/或优先[0032]图2示出R2逆转录酶。此图示出逆转录酶R2元件的N端部分的保守序列基元的比[0034]图4示出R2逆转录酶(RT)拇指域。此图是图3的延续并示出保守序列基元的比[0037]图6示出原位RNA测序允许在固定细胞和组织中对基因表达原位进行全基因组图RNA)混合。该图示出第三步骤，即通过固相可逆固定(solidphasereversible[0044]图13示出系统发生树，其突出显示非LTR逆转录元件与蚕蛾之间的推断的进化关[0053]图22示出利用5'_末端受保护的寡核苷酸(PCR引物)的大量(rRNA)序列耗减方法[0055]图24示出在不纯化RNA下从组织/细胞生物质直接制备RNA_seq文库的方法的步[0058]虽然本文已展示并描述了本公开的各种实施例，但本领域的技术人员将显而易录酶活性或无有害影响的氨基酸取代的蛋白质或多肽。非LTR逆转录转座子的一类是R2蛋逆转录酶活性或无有害影响的氨基酸取代的蛋白质是指多肽或酶由于使用例如重组DNA技术(例如诱变)产生的一突变和取代而不同于专门列举的多肽或酶。可以通过比较具体多肽与同源多肽(例如酵母或细菌)的序列以及最大限度地减少高同源性区域(保守区)中产生的氨基酸序列变化的数目或通过用共同序列置换氨基酸来引导确定可以置换、加入或缺失哪些氨基酸残基而不会增)所必需的试剂的组合物，其中这些试剂的非限制性实例包括对目标RNA或目标DNA具有特异性的引物组、由RNA的逆转录产生的DNA、DNA聚合引物仅用作加入少数非模板化核苷酸的位点。可使用例如长度为至少6个核苷酸的引物六3'封阻物，因为例如可以抑制通过本公开的酶或DNA聚合酶进行的延伸或可以抑制通过连基(NH2)或任何其它抑制在多核苷酸的3'末端与另一核苷酸之间形成后续磷酸二酯键的化Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、克列诺片段(Klenow录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶和聂型内含子逆转录酶。其它细菌逆转录酶描述于SimonD和ZimmerlyS(2008)的《细菌中的多种未表征的逆转录元件(Adiversityofuncharacterizedretroelementsinbacteria)》《核酸研究(NucleicAcidsR颖类型的原核逆转录元件的系统性调查(Systematicsurveyfornoveltypesofprokaryoticretroelementsbasedongeneneighborhoodandprotein些可移动遗传元件存在于更高级物种的基因组中并且在这些可移动遗传元件的寿命周期TranscriptionintheEukaryoticGenome:Retroviruses.Pararetroviruses,[0084]逆转录元件(编码RT的遗传元件)被分成表示为含LTR逆转录元件和含非LTR逆转来源和进化(Originandevolutionofretroelementsbasedupontheirreverse变)来引入到相关基因的核苷酸和氨基酸序列中(Wu编的酶学方法(Meth.Enzymol.)217,可包括锌指和cmybDNA结合基元，相信这些基元影响特异性识别和结合于目标DNA(目标录元件的表达和稳定性，而无需影响所公开的酶在制备用于测序的RNA文库中的能力和性No:1_20至少98％同一性，与SEQIDNo:1_20至少99％同一性，与SEQIDNo:1_20至少图14中公开蚕蛾R2参考序列。举例而言，以下氨基酸取代可以在基元_1中工程化：A15→方式掺入核苷酸的频率。聚合酶(例如DNA聚合酶)在或经过修饰的酶或具有逆转录酶活性的经过修饰的多肽可以如下持续合成能力扩增模肽可以或能够以在介于约12℃与约40℃之间的温度下测量的持续合成能力扩增模板核酸℃与约40℃之间或介于约12℃与约42℃之间。在一些情况下，温度介于约8℃到约50℃之过修饰的多肽针对给定核苷酸底物展现的持续合成能力高于参考酶或参考多肽针对相同[0113]在一些方面，本公开提供了一种用于同时扩增核糖核酸(RNA)分子和脱氧核糖核反应混合物，该等非天然存在的酶中的每一种包含(i)来源于R2逆转录转座子的手掌和手录酶、非天然存在或经过修饰的非LTR逆转录转座子、非天然存在或经过修饰的R2逆转录录酶、非天然存在或经过修饰的非LTR逆转录转座子、非天然存在或经过修饰的R2逆转录酶)或具有逆转录酶活性的经过修饰的多肽以比未修饰或天然存在的酶或具有逆转录酶活性的未修饰的多肽低如下倍数的误差率产生与模板互补的一个或多个核酸(例如cDNA)分饰包含位点特异性掺入和/或在所关注位置处的氨基酸加入和/或缺失和/或取代。在一些或经过修饰的多肽相对于野生型或未修饰的酶(例如野生型逆转录酶)或野生型或未修饰[0119]在一些情况下，可以对影响蛋白质或酶的功能活性的区域的截短进行工程改造。与对应未突变或未修饰或野生型聚合酶相比或与一种或合酶或逆转录酶)相比提高的活性，例如提高的RNA依赖性DNA聚合酶活性或DNA依赖性DNA少约1,000％提高、至少约2,500％提高或至少约5,000％提高的经过修饰的聚合酶或经过修饰的逆转录酶：(1)对应未突变或野生型酶；或(2)特定聚合酶(例如RNA依赖性DNA聚合过修饰的聚合酶或经过修饰的逆转录酶的活性可以提高约5％至约5,000％、约5％至约2,的聚合酶或经过修饰的逆转录酶的RNA依赖性DNA聚合酶活性和/或DNA依赖性DNA聚合酶活因此，本公开的经过修饰的聚合酶或经过修饰的逆转录酶可能具有如下提高的RNA依赖性引起稳定性降低或提高(例如热稳定性提高)、保存Fh8系统(Fusiontagsforproteinsolubility,purificationandimmunogenic溶解性强化搭配物可能在其目标蛋白的折叠中起被动作用，从而减少蛋白质聚集的机会。LHVLDRNGDGKVSAEELKAFADDSKCPLDSNKIKAFIKEHDKNKDGKLDLKELVSILSS(SEQIDNO:21)的[0123]ATGCCGTCTGTTCAGG[0124]CGGTAAAGTTTCTGC[0125]TGGACTCTAACAAAATCAAAGCGTTCATCAAAGAACACGACAAAAACAAAGACGGTAAACTGGACCTG官能团，例如叠氮基或乙炔基，其使得能够通过铜(I)介导的点击化学进行捕捉(参见码的目标特异性区域包含与分子内的序列互补的序列。[0128]在一些情况下，本公开的酶或蛋白质或多肽或变体或产物可以结合于固体载体。与内切蛋白酶(例如加his标签的蛋白酶)混合具有逆转录酶活性的经过修饰的多肽在无热循环的情况下展示活性，能够进行模板跳跃，的经过修饰的多肽在等于或小于约如下任何温度的温度下展示活性，能够进行模板跳跃，的经过修饰的多肽或非天然存在的酶相对于未修饰或天然存在的酶具有至少一种变化特或具有逆转录酶活性的经过修饰的多肽能够在无热循环的情况下由模板核酸分子产生核性的经过修饰的多肽或非天然存在的酶是SEQIDNo:1_20中提供的序列中的任一者的变过修饰的多肽或非天然存在的酶相对于未修饰或天然存在的酶具有至少一种改良酶特性录以产生互补脱氧核糖核酸(cDNA)产物并以如下持续合成能力扩增cDNA产物：在约12℃、以针对选自由以下组成的组的至少一种酶特性超过约1.0的物以比参考酶针对相同核苷酸底物的持续合成能力高至少约5％、至少约10％、至少约短、1小时或更短或30分钟或更短)的时段内和/或针对给定核苷酸底物以比参考酶针对相其中该非天然存在的逆转录酶具有与SEQIDNO:1_2假象扩增风险而非RNA样本本身。实现质量文库制备需要高RNA至DNA转化效率和低低聚接[0143]在一些方面，本公开提供了一种用于制备供单细胞或低RNA样本输入用的互补脱[0144]在一些方面，本公开提供了一种用于制备供单细胞或低RNA样本输入用的互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子的酶平台，其提供了必要的高RNA样本文库转化效率。在一些情况[0145]在一些方面，本公开提供了一种用于制备供单细胞或低RNA样本输入用的互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子的酶平台，其不仅仅限于来自细胞的目标聚腺苷酸化核糖核酸(RNA)。在一些情况下，本文中所公开的酶促平台捕获未聚腺苷酸化RNA，例如微小RNA况下，方法包含对至少一个核酸分子和/或多个双链核酸分子进行末端修复。在一些情况下，方法包含将至少一个或多个接头分子加入到至少一个核酸分子和/或多个双链核酸分个核酸分子和/或多个双链核酸分子包含逆转录酶(例如R2逆转录酶或经过修饰的逆转录在一些情况下，至少两个突出端序列彼此互补(例如由况下，可以例如通过用经过修饰的核苷酸对接头加于PCR循环的数目和/或时间量(例如等温扩增中的时间)和/或基于接头中存在的经过修饰[0148]在一些情况下，用于制备核酸文库和/或互补cDNA文库的方法包含在最多约1小艺，和/或提供用于精准医学的方法。在一些情况下，本文中所公开的方法和工艺提供<0.1％的捕获ctDNA中的次要等位基因的较高敏感度(可获得的当前方法具有>1％的敏感饰的逆转录酶)可以从模板迁移到受体核酸分子，与模板和受体核酸分子之间的序列同一[0151]本公开涉及使用经过修饰的逆转录酶制备互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子的方转录酶具有与天然存在或未修饰的或野生型酶(例如野生型逆转录酶)相比有所改良的酶存在核苷酸(例如dNTP)的情况下，在足以产生与模板和的条件下将退火到引物的模板与经过修饰的逆转录酶和受体下，PCR扩增反应在单个试管(例如来自步骤(a)和(b)的同一个试管)中进行。在一些情况或第二接头)被设计成允许基于重组或同源性使分子(例如核酸分子和/或模板和/或引物和/或受体)退火和延伸。在一些情况下，核酸扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)或等温扩[0153]本公开涉及使用经过修饰的逆转录酶制备互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子的方转录酶具有与天然存在或未修饰的或野生型酶(例如野生型逆转录酶)相比有所改良的酶补的cDNA分子的条件下将退火到一种或多种引物的模板与经过修饰的逆转录酶和受体核[0155]在一些情况下，用于制备cDNA分子的方法包含在存在核苷酸(例如dNTP)的情况[0157]核糖体RNA可以构成样本中总RNA的高达80％或更高。通常需要将mRNA与rRNA分miRNA、lncrna和lincRNA分离的方法为从样本中耗减rRNA。一个实例为使用寡核苷酸使酸可固定于例如柱或珠粒的表面上。MICROBExpress(注册商标)和MICROBEnrich(注册商入。大部分真核mRNA的3'末端处的多聚(A)尾可以用于分开这些分子与rRNA以及其它缺乏核酸(rRNA)分子的样本的方法，其包含在被阻止转录的该等rRNA分子的存在下使用该等rRNA分子的序列。个单链核酸序列与该等rRNA片段的至少一个子集互补，由此提供一种或多种包含与该等一种或多种rRNA片段复合物的存在下使用逆转录酶由该mRNA合成至少一种互补脱氧核糖式的DNA海绵，而图5B示出滚环扩增(RCA)产物。此图示出DNA海绵的功能，其被退火到包含使该反应混合物经受足以使用该非天然存在的酶将个别的核苷酸掺入至与该单链核链核酸分子为RNA分子。在一些情况下，本文中所公开的方法用于对单链核酸分子进行测足以直接对该单链核酸分子进行测序的条件包含基于光学件的单分子测足以直接对该单链核酸分子进行测序的条件包含基于显微术的单分子测足以直接对该单链核酸分子进行测序的条件包含基于纳米孔的单分子测足以直接对该单链核酸分子进行测序的条件包含基于场效应晶体管的单分子测[0175]在一些方面，本文中所公开的方法由用包括但不限于空间信息的条形码标记的血液并将取出的血液注入容器来直接从受试者获得血液。容器可以包含试剂(例如抗凝[0185]在一些方面，本公开提供了一种用于制备互补脱氧核糖核酸(cD去除3'磷酸、2'磷酸和环状2'3'磷酸基，将多聚A尾加入到该一个或多个脱磷酸化的片段化RNA中；将以下各物加入到该一个或多[0186]在一些方面，本公开提供了一种用于制备互补脱氧核糖核酸(接头3'末端包含3'双脱氧核苷酸。R2酶以3'至5'次序将来自该一个或多个片段化RNA的序列逆转录，其中在到达该一个或多PacBio和Roche454的主要测序技术相容。这允许单个报告探针序列可以用于检测任何所[0192]本公开涉及使用经过修饰的逆转录酶制备互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库的方cDNA分子的条件下将退火到引物的模板或退火到一种或多种引物的模板与经过修饰的逆库的方法包含在存在核苷酸(例如dNTP)的情况下，在单个试管中执行。在一些情况下，本公开的方法进一步包含聚合酶链式反应(PCR)扩增反的情况下，在足以产生核酸(例如cDNA和/或D况下，在足以产生核酸(例如cDNA和/或DNA)分子的条件和/或DNA和/或核酸分子分子的方法通过模板在一些情况下，经过修饰的逆转录酶能够进行模板跳跃和/或包含至少一种相对于野生型在足以产生连续cDNA分子的条件下将引物或一种或多种引物、信使RNA(mRNA)模板、核苷[0200]在一些情况下，本公开方法可以在方法的任何步骤时或之前和/或进行混合步骤和/或逆转录酶和/或核苷酸添加到反应管的同时添加热启动热稳定聚合酶。在一些情况[0203]本公开涉及由多个单细胞制备互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库和/或DNA文库的方录酶能够进行模板跳跃和/或包含至少一种相对于野生型或未修饰的逆转录酶有所改良的织、基于RNA转录的扩增RNA(例如TTR扩增的RNA或其它DNA依赖性RNA聚合酶转录的RNA)、[0212]在一些情况下，RNA分子可以是体外合成的产物，或者可以从细胞或组织分离少约或最多约500个碱基、约或至少约或最多约550个碱基、约或至少约或最多约600个碱或至少约或最多约1100个碱基、约或至少约或最多约1200个碱基、约或至少约或最多约模板)或单链DNA模板(ssDNA模板)。在一些情况下，模板RNA可以是双链RNA模板(dsRNA模等于或小于约250皮克(例如，100皮克)例如模板和/或DNA和/或RNA和/或DNA与RNA的混合小于约0.01微摩尔、等于或为至少约或小于约0.001微摩尔、等于或为至少约或小于约0.0001微摩尔、等于或为至少约或小于约2000纳摩尔、等于或为至少约或小于约500纳摩[0217]在一些情况下，本公开中公开的方法可以进一步包含模板(例如供体模板)的优法进一步包括在允许脱磷酸化的条件下将脱磷酸化RNA)去帽方法包括酶促法(例如通过使用焦磷酸酶，例如碘酸盐氧化和β消除)。核酸(例如RNA)的脱磷酸化方法可以使用碱性磷酸酶。在一些情况下，分离的mRNA经过去帽(例如使用烟草酸性焦磷酸酶(例如指示生物样本中存在目标RNA的可检测量的扩约或约或最多约90个循环、至少约或约或最多约95个循环、至少约或约或最多约100个循[0229]用于扩增得到指示扩增的目标核酸存在的可检测量的扩增产物的时间可以取决的温度(例如预加热温度)和持续时间(例如预加热持续时间)可以取决于例如所分析的具[0231]在一些情况下，进行核酸扩增所需的试剂还可以包括得告剂可得到指示扩增DNA产物和/或扩增的目标RNA存在的可检测信号。可检测信号的强度可能与扩增DNA产物和/或扩增的原始目标RNA的量成比例。报告剂的使用还实现了实时扩一些情况下，光学活性染料(例如荧光染料)可以用作报告剂。染料的非限制性实例包括溴化乙锭、吖啶(acridine)、原黄素(proflavine)、吖啶橙、吖啶黄、荧光香豆素偏端霉素D(distamycinD)、色霉素(chromomycin)、乙菲啶(homidium)、光神霉素(mithramycin)、多吡啶钌(rutheniumpolypyridyl)、安曲霉素(anthramycin)、啡啶(dihydroethidium)、乙锭同二聚体_1和乙锭同二聚体_2、单叠氮溴化乙锭(ethidium别藻蓝蛋白素(allophycocyanin；APC)、SybrGreenI、SybrGreenII、SybrGold、碘乙酰胺基荧光素、5_{[2(和3)_5_(乙酰基巯基)_丁二酰基]氨基}荧光素(SAMSA_荧光8_甲氧基芘_1,3,6_三磺酸三钠盐、3,6_二磺酸盐_4_氨基_萘二甲酰亚胺、藻胆蛋白(包括扩增DNA)的检测可以利用任何适合检测方法实现。使用的检测方法的具体类型可以[0235]在一些情况下，完成方法的要素所需的时间可以取决于方法的具体步骤而变子型和/或两性离子型清洁剂。在一些情况下，非离子型清洁剂选自由以下组成的组：75(聚乙二醇260单(十六烷基/十八烷基)醚和1_十八醇)、TritonX苯基醚)、TritonX_102、TritonX_15、TritonX_TritonX_114、TritonX_165、TritonX_305、TritonX_40酸酯)、TWEEN65(聚氧乙烯山梨醇酐三硬酯酸酯)、TWEEN80(聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)、TWEEN81(聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)、TWEEN85(聚氧乙烯(20)山梨醇酐三油酸335H8KNO4值可以通过加入适当量的pH调节剂来调节到[0243]在一些情况下，足以产生产物的条件包括使反应混合物达到如下范围内的温度：些情况下，足以产生分子或核酸分子的条件包含约8℃至约50℃的温度约1分钟到约24小的非LTR逆转录转座子蛋白质或具有逆转录酶活性的经过修饰的多肽可以进一步纯化。在法(FPLC)(例如AKTAFPLC系统和Bio_RadFPLC系统)、高压液相色谱法(HPLC)(例如分析。在一些情况下，合理设计/诱变是基于关于确定且已知的酶和蛋白质的序列比对分诱变(site_saturationmutagenesis)、扫描诱变(scanningmutagenesis)、插入诱变等人,7:2139_44[1999])、SCRACHY(参见Lutz等人98:11248_53[2001])、SHIP法(参见Ness等人,20:1251_5[2002]；Coco等人,20:1246_50[2002]；Zha等人,4:34_9质或酶可以通过在重组之前借助易错PCR、随机核苷酸插入或其它方法进行随机诱变来改468号；以及Patten等人,《生物技术当前述评(Curr.OpinionBiotechnol.)》8:724_33一些情况下，可以使用用于突变PCR的试剂盒，例如DiversifyPCR随机诱变试剂盒(Clontech)或GeneMorph随机诱变试文所用的相关蛋白或变异蛋白是指显著区域数目不同于另一相关蛋白或亲本蛋白的蛋白菌体呈现(Benhar,2001)。在一些情况下，筛选方法可以是选自以下的方法：酵母双杂交(yeast_2_hybrid)、n杂交(n_hybrid)、反向双杂交(reverse_2_hybrid)、反向n杂交基因具有特异性的非LTR逆转录转座子(R4,anon_LTRRetrotransposonSpecificto约100,000单位/毫克、约1000单位/毫克到约100,000单位/毫克、约5000单位/毫克到约约20,000单位/毫克到约100,000单位/毫克的比活试剂盒包含一种或多种引物。试剂盒还可以包含用于引物延伸和扩增的反应组分(例如[0261]试剂盒可以包括关于采用试剂盒组分以及使用试剂盒中未包括的任何其它试剂成核苷酸的底物(例如个别或共同在适合溶液中的三磷酸脱氧核苷酸(例如dATP、dCTP、Torrent、离子半导体测序、单分子SMRT(注册商标)测序、聚合酶克隆测序(Polony其任何产物的序列可以使用测序平台，包括但不限于Illumina提供的GenomeAnalyzerIIx、HiSeq和MiSeq；单分子实时(SMRT(注册商标))技术，例如Pacific生物科学公司(California)提供的PacBioRS系统，和Solexa测序仪；准确单分子测序(TrueSingle序可以包含每次运行小于或等于约200,000,0[0272]可以用于本公开方法的循环病变细胞包括可能受疾病或病况影响或被感染因子巴液中。循环病变细胞还可以脱离已受疾病或病况影响或被感染因子感染的组织或器官。量是一锅或单个容器反应中的模板总量。在一些情况下，模板总量为约1飞摩尔(fM)到约内含子RNA、病毒RNA、游离RNA和其片段。非编码RNA或ncRNA可以包括snoRNA、微小RNA、[0286]多个样本可以包含一个或多个恶性细胞。一个或多个恶性细胞可以来源于肿瘤、[0294]小规模和中等规模：将关于经过修饰的R2非长末端重复序列(LTR)逆转录转座子或SEQIDNo:1_20的经过修饰的R2逆转录酶之一的表达载体pET_45b转化到大肠杆菌BL21约8到12小时后，可以将200μL预培养物转移到25mL自诱导表达培养基OvernightExpress15分钟。接着可以根据制造商的方案将离心块与250μLHis亲和凝胶(ZymoResearch的板/引物和酶浓度比较延伸的DNA引物比未延伸的DNA引物的分数来估计RT活性和活性分光标记的引物退火的0.2μM模板/引物在室温下培育20分钟。预先培育条件可以包括40mM和dNTP(各25μM，最终)和任选的DNA捕获剂(最终3μM的未标记DNA寡核苷酸双链体或肝素)的序列的一实例是rCrArGrUrCrArGrUrCrArGrUrCrArGrUrCrArGrUrGrCrCrArArArU的材料的实例：用于利用T7引物CTGCAGTAATACGACTCACTATAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGC(SEQIDNO:24)进行PCR扩增的模板pUC18；供体引物GCCATTCGCCATTCAGGCTGC(SEQIDNO:102)板ACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTC扩增的两种引物(T7引物ACGGCCAGTGAATTGTAATACGAC(SEQIDNO:104)和第二引物GGAAACAGCTATGACCATG温下培育20分钟。预先培育条件：40mMTrispH7.5、200mMNaCl、5mMTCEP和0.1%体外RNA合成来产生模板，两种引物之一包括T7启动子序列。第二引物还可以用作供体模进行PCR扩增的模板pUC18，RT引物CAGGGTTATTGTCTCATGAGCG(SEQIDNO:101)(用于供体[0306]随机引发的实例：具有含接头的若干引物或含接头的随机引物的较长RNA模板；天然存在的R2和H2O的反应可以用于检测模板跳跃。将含有R2酶或R2缓冲液的反应物在30[0314]这个实验可以用于展示，可以使用非天然存在的R2酶(P8变异R2酶)捕获含有DNA片段(通过PCR产物的热变性和快速冷却制备的200bpP使用RNA供体捕获DNA片段。简单来说应物可以包括H2O、5XR2缓冲液、0.25mMdNTP、200bpDNA片段(0ng(无DNA模板对照(100μLPCR总体积中10μLRT反应物)。用于第二方法(RNA供体)的PCR扩增反应可以包括H2应可以包括H2O、TrispH8.0(20mM可以使用5μL的20μM接头(P320+P321)代替2.5μL的20μM接头(P312+P313)和2.5μL的20μM接用聚合酶(例如多聚一A聚合酶)进行R[0325]2',3'环状磷酸由于天然RNA磷酸二酯键不稳定性而十分常见，且可以天然产生状磷酸或3'磷酸的RNA样本可以用磷酸酶(例如T4多核苷酸激酶(PNK)酶)处理以产生3'激酶磷酸酶复原RNA2',3'环状磷酸末端的机制(MechanismofRNA2',3'cyclicphosphateendhealingbyT4polynucleotidekinase一phosphatase)》,《核酸研究[0326]表1.复原2',3'环状磷酸末端[0331]例如illumina或iontorrent的主要DNA测序技术在测序读段长度方面受到限制(意味着每个单独的读段中可以进行测序的碱基的数目有限)。两种技术都具有最多约利用RNA的天然化学不稳定性。RNA可能由于内部磷酸转移作用而经历自发性非酶促片段用逆转录酶或经过修饰的逆转录酶或具有类似于逆转录酶的功能的酶[0335]简单地说，片段化方案可以包括1μL的10×缓冲液A和9μL的样本(例如游离RNA样[0336]简单地说，5×2DPNK缓冲液可以包括645μLH2O、10μL的1000mMTris_HCltween和15μL的1000mMDdTTP、375μL的100mMdGTP和375μL的100mMdCTP。5×R2缓冲液+dNTP可以包括430μLH2O、100mMdGTP和18.75μL的100mMdCTP。链霉亲和素磁珠可以包括160μL链霉亲和素磁珠GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTT)(SEQIDNO:93)；[0340]1)AA/iSp9/ACACTCTTTCCCTA[0342]2)AA/iSp9/ACACTCT[0343]3)AA/iSp9/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCTGGG/3ddC/(SEQIDNO:[0344]4)AA/iSp9/ACA[0345]5)AA/iSp9/AC[0346]6)AA/iSp9/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTrGrGrG/3ddC/(SEQIDNO:[0347]7)AAAA/iSp9/ACACTCTTTC[0349]8)AA/iSp9/ACA[0350]9)AA/iSp9/ACAC[0351]10)AA/iSp9/ACA[0352]11)AA/iSp9/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN/ideoxyI//3ddC/(SEQID[0353]12)AA/iSp9/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC/iSuper_dT//3ddC/(SEQID[0354]13)A/iSp9/CCGTG[0356]多聚A聚合酶是一种常用以在RNA的3'末端上的两种通用方法：1)使用连接到磁珠或固体载体的互补寡核苷酸牵拉rRNA/tRNA或PCR产件是分子量通常超过100kD的多域元件。这些元件由三个主要具有特异性识别和通过目标引发的逆转录机制(TPRT)结合于目标DNA的能力；(2)逆转录[0363]这种方法基于N端域的存在干扰R2逆转录元件的表达和稳定性的基本原理，集中[0366]基元1和基元0的诱变.文献中最多研究和最佳描述的逆转录酶(RT)是逆转录病度保守的氨基酸序列基元。由非LTR逆转录元件编码的RT以及由端粒酶编码的RT包括位于告还展示基元1和基元0在与特异性R2RNA模板以及其它模板的相互作用中有所涉及，引[0367]拇指域的诱变.拇指域主要负责容纳引物或引物/模板和/或与引物或引物/模板要与RNA模板进行碱基配对(参见图10)。R2的这种特性可能与目标引发的逆转录(TPRT)相[0369]用于单细胞文库制备的方法包括但不限于集中在乳液和纳米制造上的约束技15％由转运RNA(tRNA)和其它翻译RNA机构组成。已经研发了多种方法来耗减rRNA和tRNA。这些方法是基于两种通用想法：第一，使用连接至固体载体的特异性寡核苷酸探针牵拉[0374]本公开的非天然存在的R2逆转录酶(RT)可以直接用于集中在单分子测序技术上序允许在固定细胞和固定组织中原位进行基因表达细胞和组织可以来自可能得益于本公开方法的任何动物，包括例如人类和非人类哺乳动或通过用包括空间信息的条形码信息加标签来直接测序。接着该cDNA可以转化成测序文[0379]在本公开的方法中，非天然存在的R2酶和跳跃方法可以用于空间特异性文库产生。引物可以用多聚T寡核苷酸特异性条形码化(参见图6)并且应用基于多聚A的文库制备外净化。最后一步是使用与引物接头和受体接头互补的引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩序技术建议的接头序列，这些测序技术例如Illumina、IonTorrent和PacBio以及Roche[0400]这种方法集中在使用RNA样本的随机片段化与R2酶的独特特性组合进行随机引发包括但不限于利用镁的自发性RNA水解或酶促裂解(参见图11)。在这个第一片段化步骤之技术相容/主要测序技术建议的接头序列，这些测序技术例如Illumina、IonTorrent、[0406]细胞中的总RNA的约80％由核糖体RNA(rRNA)构成，另外15％是转运RNA(tRNA)和述预先扩增步骤之后，将样本与策略上设计的与核[0408]引物包括允许结合/固定到固体载体的核苷酸修饰，例如包含允许结合于链霉亲[0410]细胞中的总RNA的约80％由核糖体RNA(rRNA)构成，另外15％是转运RNA(tRNA)和到3'核酸外切酶酶促降解的修饰。[0413]实例22：使用条形码作为PCR扩增的选择性目标对所选单细胞文库进行富集和深[0420]本实例描述了在无RNA纯化下，通过选择小的具有所选形态的组织或组织的