rv1451克隆到pET28a载体实验方法

1引言结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的慢性传染病。结核分枝杆菌主要侵犯肺脏，也可侵犯肺脏以外的其他部位如肝、肾、脑、淋巴结等器官。2018年，在全球范围内估计有1000万人(范围900万～1110万人)罹患结核病，相当于每10万人中就有132人(范围118～146人)罹患结核病。据2018年针对结核的疾病负担估计中，中国预估有86.6万新发结核病例，每10万里有61人发病ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>陈文倩</Author><Year>2011</Year><RecNum>666</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[1]</style></DisplayText><record><rec-number>666</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzfxfprauxxrffe2dw95psxgv2d0p2sfvp9v">666</key></foreign-keys><ref-typename="Thesis">32</ref-type><contributors><authors><author>陈文倩</author></authors><tertiary-authors><author>莫志贤,</author><author>马骥,</author></tertiary-authors></contributors><titles><title>大叶钩藤药学及药理学实验研究</title></titles><keywords><keyword>大叶钩藤</keyword><keyword>钩藤碱</keyword><keyword>异钩藤碱</keyword><keyword>中枢抑制</keyword><keyword>苯丙胺</keyword><keyword>条件性位置偏爱</keyword></keywords><dates><year>2011</year></dates><publisher>南方医科大学</publisher><work-type>硕士</work-type><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[\o"陈文倩,2011#666"1]。因此，对结核菌致病机理研究、药物靶标鉴定及药物研发等迫在眉睫。基于其它物种中的同源性分析，揭示结核菌aa3-型细胞色素氧化酶复合体包括血红素o合成酶（Rv1451）、血红素a合成酶（Rv1456c）、细胞色素c氧化酶亚基I（Rv3043c）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>杨运姣</Author><Year>2009</Year><RecNum>667</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[2,3]</style></DisplayText><record><rec-number>667</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzfxfprauxxrffe2dw95psxgv2d0p2sfvp9v">667</key></foreign-keys><ref-typename="Thesis">32</ref-type><contributors><authors><author>杨运姣</author></authors><tertiary-authors><author>彭康,</author><author>莫志贤,</author></tertiary-authors></contributors><titles><title>绒毛钩藤药理学作用的实验研究</title></titles><keywords><keyword>绒毛钩藤</keyword><keyword>钩藤</keyword><keyword>自主活动</keyword><keyword>戊巴比妥钠</keyword><keyword>血压</keyword><keyword>血管紧张素Ⅱ</keyword><keyword>内皮素</keyword><keyword>降压素基因相关肽</keyword></keywords><dates><year>2009</year></dates><publisher>南方医科大学</publisher><work-type>硕士</work-type><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite><Cite><Author>陈霞</Author><Year>2019</Year><RecNum>680</RecNum><record><rec-number>680</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzfxfprauxxrffe2dw95psxgv2d0p2sfvp9v">680</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>陈霞</author><author>王道平</author></authors></contributors><auth-address>毕节医学高等专科学校;贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室;</auth-address><titles><title>华钩藤研究综述</title><secondary-title>中国现代药物应用</secondary-title></titles><periodical><full-title>中国现代药物应用</full-title></periodical><pages>235-236</pages><volume>13</volume><number>03</number><keywords><keyword>华钩藤</keyword><keyword>化学成分</keyword><keyword>药理作用</keyword><keyword>综述</keyword></keywords><dates><year>2019</year></dates><isbn>1673-9523</isbn><call-num>11-5581/R</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[\o"杨运姣,2009#667"2]、细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ（Rv2200c/Rv2199c）和细胞色素c氧化酶亚基I(Rv2193)。但目前对血红素o合成酶（Rv1451）的生化活性及特征还缺乏研究。本论文拟构建结核分枝杆菌Rv1451基因的异源表达质粒，检测其在大肠杆菌中的表达情况，为后期进一步探索结核分枝杆菌Rv1451基因的异源表达条件提供依据以及研究其生物学活性和功能奠定基础ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>杨运姣</Author><Year>2009</Year><RecNum>667</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[2,3]</style></DisplayText><record><rec-number>667</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzfxfprauxxrffe2dw95psxgv2d0p2sfvp9v">667</key></foreign-keys><ref-typename="Thesis">32</ref-type><contributors><authors><author>杨运姣</author></authors><tertiary-authors><author>彭康,</author><author>莫志贤,</author></tertiary-authors></contributors><titles><title>绒毛钩藤药理学作用的实验研究</title></titles><keywords><keyword>绒毛钩藤</keyword><keyword>钩藤</keyword><keyword>自主活动</keyword><keyword>戊巴比妥钠</keyword><keyword>血压</keyword><keyword>血管紧张素Ⅱ</keyword><keyword>内皮素</keyword><keyword>降压素基因相关肽</keyword></keywords><dates><year>2009</year></dates><publisher>南方医科大学</publisher><work-type>硕士</work-type><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite><Cite><Author>陈霞</Author><Year>2019</Year><RecNum>680</RecNum><record><rec-number>680</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzfxfprauxxrffe2dw95psxgv2d0p2sfvp9v">680</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>陈霞</author><author>王道平</author></authors></contributors><auth-address>毕节医学高等专科学校;贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室;</auth-address><titles><title>华钩藤研究综述</title><secondary-title>中国现代药物应用</secondary-title></titles><periodical><full-title>中国现代药物应用</full-title></periodical><pages>235-236</pages><volume>13</volume><number>03</number><keywords><keyword>华钩藤</keyword><keyword>化学成分</keyword><keyword>药理作用</keyword><keyword>综述</keyword></keywords><dates><year>2019</year></dates><isbn>1673-9523</isbn><call-num>11-5581/R</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[\o"陈霞,2019#680"3]。2材料与方法2.1实验材料（1）菌种和载体大肠杆菌菌株EscherichiacoliDH5α、EscherichiacoliBL21及质粒pET28a、PET22b。（实验室保存）（2）主要试剂5×PrimestarBuffer(Mg2+Plus)（Takara公司）；dNTP（Takara公司）；PrimeSTARHSDNAPolymerase(Takara公司)；DMSO（北京索莱宝科技有限公司）；5×In-FusionHDEnzyme(Takara公司)；10×EX•Tagbuffer（Takara公司）；r-Tag（Takara公司）；Kanamycin（50mg/mL）；引物（英潍捷基公司）；MtbH37Rv基因组（实验室保存）；goldviewI型核酸染料（英潍捷基公司）；考马斯亮蓝G-250（北京索莱宝科技有限公司）；SDS（Sigma公司）；LBbroth、SOC、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工)、丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺、Tris、过硫酸铵、甘油、甘氨酸、溴酚蓝、均采购自生物工程(上海)股份有限公司：无水乙醇（成都市科龙化工试剂厂）；异丙醇（天津市致远化学试剂厂）；乙酸（重庆川江化学试剂厂）、TEMED（BBI生命科技公司）、UnstainedProeinMarkerIV.MidRange（BBI生命科技公司）。（3）主要仪器超净工作台CJ-1S-FS，（天津市泰斯特仪器有限公司）；离心机（TG1650-WS，上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；电子天平（M-S/MS-L系列，万分之一，梅特勒利多国际贸易上海有限公司）；BIORAD电泳仪（美国BIO-RAD公司）；紫外透射切胶台（UVTransilluminater，champuv，北京赛智科技有限公司）；PowerB型电泳电源（北京凯元信瑞仪器有限公司）；电泳仪（DYY-6C，北京六一仪器厂）；超微量分光光度计（DS_IIsepectropHotometer，美国DeNovix公司）；三槽三控恒温水槽（DK-8D，常州诺基仪器有限公司）；凝胶成像系统；PCR热循环仪（SimpliAmpTM热循环仪，美国Appliedbiosystems公司）；超低温冷冻储藏箱（中科美菱低温科技股份有限公司）；pH酸度计（PHS-P2，上海大普仪器有限公司）；全自动雪花制冰机（常熟市雪科电器有限公司）；超纯水机（四川沃特尔科技发展有限公司）；台式恒温振荡器（天津市欧诺仪器仪表有限公司）；BIO-DL移液枪（规格10μL、50μL、100μL、200μL、1000μL，百得实验仪器江苏有限公司）；电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；高压灭菌锅；电热恒温培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。2.2rv1451克隆到pET28a载体实验方法2.2.1pET28a质粒提取和感受态细胞的制备ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>徐佳瑜</Author><Year>2018</Year><RecNum>449</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[4]</style></DisplayText><record><rec-number>449</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzfxfprauxxrffe2dw95psxgv2d0p2sfvp9v">449</key></foreign-keys><ref-typename="Thesis">32</ref-type><contributors><authors><author>徐佳瑜</author></authors><tertiary-authors><author>张明生,</author></tertiary-authors></contributors><titles><title>钩藤主要药效成分积累的适宜条件研究</title></titles><keywords><keyword>钩藤</keyword><keyword>生物碱</keyword><keyword>光照强度</keyword><keyword>海拔高度</keyword><keyword>土壤养分</keyword><keyword>HPLC</keyword></keywords><dates><year>2018</year></dates><publisher>贵州大学</publisher><work-type>硕士</work-type><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[\o"徐佳瑜,2018#449"4]1．大肠杆菌DH5α-pET28a菌株的培养（1）配置LB液体培养基：取LBBroth0.75g到50mL锥形瓶，加入30mLUP水，立式压力蒸汽灭菌锅灭菌120℃、20min。（2）取保存好的30μLDH5α-pET28a、30μLkan（50mg/mL）加入到30mlLB液体培养基摇匀。放入恒温振荡器37℃、150rpm培养过夜。2．质粒提取质粒抽提使用生物工程(上海)有限公司的SnaPrepColumnPlasmidMini-PrepsKit，具体方法如下：（1）准备工作：a.在WashSolution里加入96mL乙醇（100％）并打勾。b.用1mLSolutionⅠ溶解Rnase(RNA酶)反复吹悬，再转移至Solution瓶中并打勾。（2）取1.4mLDH5α-pET28a菌液于1.5ml离心管，做好标记，12000rpm离心1min。（3）弃上清加入250μLSolutionⅠ,彻底重悬菌体、放置2min。（4）加入250μLSolutionⅡ,轻柔颠倒5次，静置1min。（5）加入350μLSolutionⅢ，轻柔颠倒混匀，静置5min。（6）12000rpm，离心10min。（7）转移上清至EZ-10柱子，8000rpm、离心2min。（8）弃掉收集管中离心出的液体加入500μLWashSolution、1000rpm离心1min。（9）重复步骤（8）（10）弃掉离心出的液体，1000rpm离心2min，换离心管，将管子置于50℃、5min。（11）加入50μLElutionBuffer、静置2min、1000rpm离心2min。测浓度以ElutionBuffer作为空白对照，取1μL质粒进行测量，最终浓度为140.04ng∕μL，做好标记置于-20℃保存。3.配制感受态细胞（1）配置CCMB缓冲液100mL试剂：CaCl2：80mMMgCl2：20mMMnCl2：10mM醋酸钾（1M/L，pH=7.5）：1mL甘油10%：10mLUP水：定容至100mL先将上述试剂全部加入烧杯，再加部分UP水，搅拌混匀后定容，用0.45um过滤膜过滤后做好标记，置于冰箱冷藏待用。（2）配置LB液体培养基：取LBBroth0.75g到50mL锥形瓶，加入30mLUP水，LBBroth5g到300mL锥形瓶，加入200mLUP水，立式压力蒸汽灭菌锅灭菌120℃、20min。（3）将50μLDH5α加入到30mL液体培养基150rpm37℃培养过夜。（4）取培养过夜的DH5α一级种2mL于200mL液体培养基中放入恒温振荡器37℃180rpm培养至OD600=0.35-0.5。（5）将菌液倒入离心桶，放于冰上冷却10min后4℃7000rpm离心30min。（6）弃上清，沉淀中加入45mL预冷的CCMB溶液混匀，放冰上20min。（7）4℃7000rpm离心20min，弃上清，沉淀中加入15mL预冷的CCMB溶液混匀，放冰上10min。（8）-70℃保存备用。2.2.2pET28a-rv1451基因表达质粒构建ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>王德群</Author><Year>2019</Year><RecNum>485</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[5]</style></DisplayText><record><rec-number>485</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzfxfprauxxrffe2dw95psxgv2d0p2sfvp9v">485</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>王德群</author></authors></contributors><auth-address>安徽中医药大学;</auth-address><titles><title>六探《神农本草经》药性</title><secondary-title>皖西学院学报</secondary-title></titles><periodical><full-title>皖西学院学报</full-title></periodical><pages>104-112</pages><volume>35</volume><number>04</number><keywords><keyword>神农本草经</keyword><keyword>药性</keyword><keyword>伤寒论</keyword><keyword>中医临床</keyword></keywords><dates><year>2019</year></dates><isbn>1009-9735</isbn><call-num>34-1232/Z</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[\o"王德群,2019#485"5]1.聚合酶链式反应（PCR）扩增rv1451基因片段ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>李思文</Author><RecNum>454</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[6]</style></DisplayText><record><rec-number>454</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzfxfprauxxrffe2dw95psxgv2d0p2sfvp9v">454</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>李思文</author><author>谢明</author><author>王莹</author></authors></contributors><auth-address>辽宁中医药大学药学院;</auth-address><titles><title>本草古籍的现代出版物与其利用情况探析——以《神农本草经》《本草经集注》《新修本草》《证类本草》《本草纲目》为例</title><secondary-title>中国现代中药</secondary-title></titles><periodical><full-title>中国现代中药</full-title></periodical><pages>1-12</pages><keywords><keyword>本草文献</keyword><keyword>《神农本草经》</keyword><keyword>《本草经集注》</keyword><keyword>《新修本草》</keyword><keyword>《证类本草》</keyword><keyword>《本草纲目》</keyword></keywords><dates></dates><isbn>1673-4890</isbn><call-num>11-5442/R</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[\o"李思文,#454"6]利用引物对pET28a-rv1451IF-F（5‘CCGCGCGGCAGCCATGTGAACGTTCGCGGGCGCGT3’）和pET28a-rv1451IF-R（5‘TGCGGCCGCAAGCTTTCAGTGCAGCGTGGGCAGCG3‘）对结核菌rv1451基因进行PCR扩增，其体系及扩增程序分别见表2-1和表2-2。表2-1.结核菌rv1451基因PCR扩增体系（25μL）试剂体系（μL）5×PrimestarBuffer(Mg2+Plus)5dNTP（2.5mMeach）228a-rv1451IF-F(10pmoL/μL)128a-rv1451IF-R(10pmoL/μL)1100%DMSO1.25PrimeSTARHSDNAPolymerase0.125ddH2O13.625阳性（×7）Mtb基因组（10ng/μL）1阴性（×1）ddH2O1表2-2.结核菌rv1451基因PCR扩增程序步骤温度时间195℃2min295℃20s345℃-65℃15s472℃1min5gotostep2-429×672℃2min712℃∞凝胶电泳（1）配胶1.5％AgaroseM(琼脂糖)0.5g0.5×TBE50mL微波炉加热熔化待稍冷加入GV-Ⅱ(Goodview核酸染料)7μL倒入凝固板（选择合适的梳子）（2）电泳及观察:各样品根据体积加入适量10ＸDNAloadingbuffer，点样后于120V电泳30~40min。利用凝胶成像系统观察并拍照。将凝胶放在紫外透射切胶台上，将目的条带切下，称重为0.612g。2.聚合酶链式反应（PCR）扩增pET28a基因片段ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>李思文</Author><RecNum>454</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[6]</style></DisplayText><record><rec-number>454</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzfxfprauxxrffe2dw95psxgv2d0p2sfvp9v">454</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>李思文</author><author>谢明</author><author>王莹</author></authors></contributors><auth-address>辽宁中医药大学药学院;</auth-address><titles><title>本草古籍的现代出版物与其利用情况探析——以《神农本草经》《本草经集注》《新修本草》《证类本草》《本草纲目》为例</title><secondary-title>中国现代中药</secondary-title></titles><periodical><full-title>中国现代中药</full-title></periodical><pages>1-12</pages><keywords><keyword>本草文献</keyword><keyword>《神农本草经》</keyword><keyword>《本草经集注》</keyword><keyword>《新修本草》</keyword><keyword>《证类本草》</keyword><keyword>《本草纲目》</keyword></keywords><dates></dates><isbn>1673-4890</isbn><call-num>11-5442/R</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[\o"李思文,#454"6]利用引物对pET28aIF-F（5’AAGCTTGCGGCCGCACTCGAGC3’）和pET28aIF-R（5’ATGGCTGCCGCGCGGCACCAGG3’）对载体pET28a进行PCR扩增，其体系及扩增程序分别见表2-3和表2-4。表2-3.结核菌pET28a基因PCR扩增体系（25μL）试剂体系（μL）5×PrimestarBuffer(Mg2+Plus)5dNTP（2.5mMeach）2pET28aIF-F(10pmoL/μL)1pET28aIF-R(10pmoL/μL)1PrimeSTARHSDNAPolymerase0.125ddH2O14.875阳性（×7）PET28a质粒（10ng/μL）1阴性（×1）ddH2O1表2-4.结核菌pET28a基因PCR扩增程序步骤温度时间195℃2min295℃20s345℃-65℃15s472℃5min30s5gotostep2-429×672℃5min30s712℃∞PCR扩增产物胶回收目的片段运用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行回收，胶回收操作流程步骤如下：（1）准备工作：检查WashSolution中是否加入乙醇。检查BufferB2中是否出现沉淀。（2）将已称重的胶（rv1451：0.612g）（pET28a：0.762g）加入3倍重量（1.836g，2.286g）的BufferB2置于55℃水浴锅溶胶。（3）将溶胶液移入吸附柱中，8000xg离心30s，倒掉收集管中液体（液体较多，重复操作几次）。（4）加入500μLWashSolution，9000xg离心30s，倒掉收集管中液体（重复两次）。（5）空吸附柱于9000xg离心1min。（6）将吸附柱放入一个洁净的1.5mL离心管中，在吸附柱膜中间加入25μLElutionBuffer，室温静置1min，12000rpm离心1min，保存管中DNA溶液。测浓度以ElutionBuffer作为空白对照，各取1μL进行测量，最终浓度为：rv1451：289.83ng/μL，pET28a：196.10ng/μL。将rv1451浓度稀释两倍终浓度为96.61ng/μL，将PET28a浓度稀释一倍终浓度为98.05ng/μL，放-20℃保存。3．融合克隆（1）配置SOC培养基称量3.4gSOC培养基放入100mLUP水，搅拌至完全溶化，用0.22μm过滤灭菌膜过滤灭菌，放入冰箱-4℃储存。（2）配置固体培养基称量4gLB肉汤琼脂混合于100mLUP水中，立式压力蒸汽灭菌锅灭菌120℃20min。待培养基稍微冷却后加入100μLkan混匀，立刻倒入培养皿。（3）将目的基因rv1451重组到载体pET28a中，体系如下表2-5。表2-5.目的基因rv1451转换到载体pET28a体系试剂体积（μL）rv1451（96.61ng/μL）1pET28a（98.05ng/μL）15×In-FusionHDEnzyme2ddH2O650℃孵育15分钟，然后置于冰上将目的基因转入DH5α中，转化体系如下表2-6。表2-6.目的基因转入DH5α体系试剂体积（μL）阴：DH5α100μL阳：DH5α+PET28a(质粒)100μL+5μL转化：DH5α+转换管100μL+10μL取3个离心管，按表2-6体系加入到感受态细胞中，混匀，冰上放置30min。②放入水浴锅24℃75s热激。③立即放置冰上1~2min。④加入900μL无抗生素SOC培养基，37℃45min。⑤12000rpm离心2min，吸去上清900μL。⑥剩下的溶液重悬，涂布于平板，做好标记，37℃培养过夜。（4）菌落PCR验证ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>李思文</Author><RecNum>454</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[6]</style></DisplayText><record><rec-number>454</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzfxfprauxxrffe2dw95psxgv2d0p2sfvp9v">454</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>李思文</author><author>谢明</author><author>王莹</author></authors></contributors><auth-address>辽宁中医药大学药学院;</auth-address><titles><title>本草古籍的现代出版物与其利用情况探析——以《神农本草经》《本草经集注》《新修本草》《证类本草》《本草纲目》为例</title><secondary-title>中国现代中药</secondary-title></titles><periodical><full-title>中国现代中药</full-title></periodical><pages>1-12</pages><keywords><keyword>本草文献</keyword><keyword>《神农本草经》</keyword><keyword>《本草经集注》</keyword><keyword>《新修本草》</keyword><keyword>《证类本草》</keyword><keyword>《本草纲目》</keyword></keywords><dates></dates><isbn>1673-4890</isbn><call-num>11-5442/R</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[\o"李思文,#454"6]取1.5mL离心管，加入1mLLB液体培养基和1μLkan，摇匀，再分装到9个1.5mL离心管，每管50μL，用移液枪头挑取菌落，打入离心管与LB液体培养基混匀。放入台式恒温振荡器，37℃150rpm1h。对菌落中的目的基因rv1451进行PCR扩增，扩增体系及条件如下表2-7和表2-8。表2-7.菌落验证PCR扩增体系（25μL）试剂体系（μL）ddH2O1310×Ex·Taqbuffer2.5dNTP（2.5mMeach）2rv1451IF-F(10pmoL/μL)2.5rv1451IF-R(10pmoL/μL)2.5100%DMSO1.25rTag0.25①阴性对照+1μLddH2O②阴性对照+1μL阳性培养皿中的菌落③阳性对照+1μLMtb④菌落验证各加1μL挑取的菌落表2-8.菌落验证rv1451基因PCR扩增程序步骤温度时间195℃5min295℃1min360.9℃45s472℃1min5gotostep2-429×672℃2min74℃∞2.2.3pET28a-rv1451基因的异源表达研究ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>王志刚</Author><Year>2020</Year><RecNum>483</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[7]</style></DisplayText><record><rec-number>483</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzfxfprauxxrffe2dw95psxgv2d0p2sfvp9v">483</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>王志刚</author><author>程俊伟</author></authors></contributors><auth-address>郑州市第六人民医院结核病鉴别诊断科;</auth-address><titles><title>天麻钩藤汤加减治疗肝阳上亢型原发性高血压疗效观察及对神经递质节律的影响</title><secondary-title>世界中医药</secondary-title></titles><periodical><full-title>世界中医药</full-title></periodical><pages>81-84+89</pages><volume>15</volume><number>01</number><keywords><keyword>天麻钩藤汤</keyword><keyword>肝阳上亢型</keyword><keyword>原发性高血压</keyword><keyword>神经递质节律</keyword><keyword>血压水平</keyword><keyword>中医症状积分</keyword><keyword>钙离子拮抗剂</keyword><keyword>β受体阻滞剂</keyword></keywords><dates><year>2020</year></dates><isbn>1673-7202</isbn><call-num>11-5529/R</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[\o"王志刚,2020#483"7]1.将基因rv1451转至BL21中（1）将携带有目的基因的大肠杆菌转移到30mL加有抗生素的LB培养基，150rpm37℃培养过夜。标记为：连-1（2）取连-1中700μL菌液加700μL甘油到保种管，做好标记放入-70℃保种。取1.4mL菌液到1.5mL离心管待送测序。（3）取连-1中1.4mL菌液提取质粒，将质粒转至BL21中。①取感受态BL21放于冰上融化，取1.5mL离心管至于冰上预冷。②阴性：BL21：100μL阳性：BL21+连-1质粒：100μL+3μL按以上体系加入离心管后置于冰上30min。③42℃水浴75s，放冰上2min，加入900μLSOC培养基，37℃培养45min。④12000rpm离心2min，吸去上清900μL，剩余部分重悬，涂布于加有抗生素的培养皿，37℃培养过夜。（4）PCR验证ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>李思文</Author><RecNum>454</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[6]</style></DisplayText><record><rec-number>454</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzfxfprauxxrffe2dw95psxgv2d0p2sfvp9v">454</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>李思文</author><author>谢明</author><author>王莹</author></authors></contributors><auth-address>辽宁中医药大学药学院;</auth-address><titles><title>本草古籍的现代出版物与其利用情况探析——以《神农本草经》《本草经集注》《新修本草》《证类本草》《本草纲目》为例</title><secondary-title>中国现代中药</secondary-title></titles><periodical><full-title>中国现代中药</full-title></periodical><pages>1-12</pages><keywords><keyword>本草文献</keyword><keyword>《神农本草经》</keyword><keyword>《本草经集注》</keyword><keyword>《新修本草》</keyword><keyword>《证类本草》</keyword><keyword>《本草纲目》</keyword></keywords><dates></dates><isbn>1673-4890</isbn><call-num>11-5442/R</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[\o"李思文,#454"6]挑取阳性培养皿中3颗菌落于加加有抗生素的50μLLB液体培养基，放于放入台式恒温振荡器，37℃150rpm1h。对BL21菌落中的目的基因rv1451进行PCR扩增，扩增体系及条件如下表2-9、2-10。表2-9.BL21菌落验证PCR扩增体系（25μL）试剂体系（μL）ddH2O1310×Ex·Taqbuffer2.5dNTP（2.5mMeach）2rv1451IF-F(10pmoL/μL)2.5rv1451IF-R(10pmoL/μL)2.5100%DMSO1.25rTag0.25①阴性对照+1μLddH2O②菌落验证+1μL挑取的菌落表2-10.BL21菌落验证rv1451基因PCR扩增程序步骤温度时间195℃5min295℃1min360.9℃45s472℃1min5gotostep2-429×672℃2min712℃∞将验证后的BL21-rv1451菌落放于加有抗生素的30mLLB中，150rpm37℃培养过夜。2.蛋白表达（1）IPTG诱导配置IPTG组份浓度：24mg/mL配置量：50mL配置方法：①称量1.2gIPTG置于50mL离心管中。倒入40mL灭菌水，待充分混合溶解后再定容至50mL。③用0.22μm过滤器过滤除菌。④小份分装（1mL/份）后，-20℃保存。目的组：按体积1％接种于50mLLB中，加入50μLKan500μLBL21-rv1451对照组：按体积1％接种于另一瓶50mLLB中，加入50μLKan500μLBL21-pET28a将两组一同放于台式恒温振荡器180rpm37℃中培养至OD600=0.8-1，加入IPTG到终浓度为0.1mM，放入台式恒温振荡器25℃180rpm中培养过夜。（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶检测分析ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>许浩游</Author><Year>2020</Year><RecNum>484</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[8]</style></DisplayText><record><rec-number>484</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzfxfprauxxrffe2dw95psxgv2d0p2sfvp9v">484</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>许浩游</author><author>方素鹏</author></authors></contributors><auth-address>广州中医药大学第二附属医院中医内科;</auth-address><titles><title>羚角钩藤汤加味治疗痰火瘀闭型急性脑梗死的疗效观察</title><secondary-title>世界中西医结合杂志</secondary-title></titles><periodical><full-title>世界中西医结合杂志</full-title></periodical><pages>111-114</pages><volume>15</volume><number>01</number><keywords><keyword>羚角钩藤汤加味</keyword><keyword>痰火瘀闭证</keyword><keyword>急性脑梗死</keyword></keywords><dates><year>2020</year></dates><isbn>1673-6613</isbn><call-num>11-5511/R</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[\o"许浩游,2020#484"8]配制考马斯亮蓝R-250染色液：组分浓度：0.1％（W/V）考马斯亮蓝R-25025％（V/V）异丙醇10％（V/V）冰醋酸配制量：500mL配制方法：⑴称取0.5g考马斯亮蓝R-250，放入大于500mL烧杯中。⑵量取125mL异丙醇倒入上述烧杯中，充分搅拌溶解。⑶加入5mL冰醋酸，搅拌均匀。⑷加入325mL去离子水，搅拌均匀。⑸用滤纸过滤去除颗粒物质后室温保存。①菌液取1mL于1.5mLEP管中12000rpm离心2min，留沉淀去上清，用100μL水重悬，加25μL5×SDSLoadingbuffer,煮沸5min，12000rpm离心10min，上样。②剩余的菌液倒于50mL离心管中7000rpm离心20min,留沉淀，去上清，加20mL水重悬，超声破碎，取1.4mL12000rpm离心10min。取300μL上清加入75μL5×SDSLoadingbuffer，煮沸5min，上样。沉淀加入100μL水重悬，加入25μL5×SDSLoadingbuffer，煮沸5min，12000rpm离心10min，上样。配蛋白胶下沉胶：7.5mLH2O：2.4mL30％Acrylamide：3mL1.5MTris-HCl(PH8.8)：1.95mL10％SDS：0.075mL10％过硫酸铵：0.075mLTEMED：0.003mL混合后加入至胶板，用正丁醇和水混合液压线，待凝固后倒去正丁醇和水混合液，并用滤纸吸干。上胶：2mLH2O：1.4mL30％Acrylamide：0.33mL1.0MTris-HCl(PH6.8)：0.25mL10％SDS：0.02mL10％过硫酸铵：0.02mLTEMED：0.002mL插入梳子待凝固。点蛋白样：用蛋白专用板头滴①unstainedProeinMarkerIV.MidRange(500u)=5μL②BL21+pET28a全菌液15μL③BL21+rv1451全菌液15μL④BL21+pET28a上清（破）35μL⑤BL21+rv1451上清（破）35μL⑥BL21+pET28a下沉（破）15μL⑦BL21+rv1451下沉（破）15μL考马斯亮蓝G-250染色液染色2h，接着用考马斯亮蓝染色液脱色剂脱色至出现清晰条带ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>张倩</Author><Year>2018</Year><RecNum>594</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[9]</style></DisplayText><record><rec-number>594</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzfxfprauxxrffe2dw95psxgv2d0p2sfvp9v">594</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>张倩</author></authors></contributors><auth-address>江西中医药大学;</auth-address><titles><title>天麻钩藤四物汤联合针刺治疗眼睑痉挛22例</title><secondary-title>全科口腔医学电子杂志</secondary-title></titles><periodical><full-title>全科口腔医学电子杂志</full-title></periodical><pages>120</pages><volume>5</volume><number>36</number><keywords><keyword>天麻钩藤四物汤</keyword><keyword>针刺治疗</keyword><keyword>眼睑痉挛</keyword></keywords><dates><year>2018</year></dates><isbn>2095-7882</isbn><call-num>11-9337/R</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[\o"张倩,2018#594"9]。2.2.4蛋白表达条件探究配制300mLLB液体培养基，按体积1％接种于液体培养基，加入300μLKan3000μLBL21-rv1451，放入台式恒温振荡器180rpm，37℃中培养至OD600=0.8-1。分装到9个灭过菌的锥形瓶，每瓶30mL。选3瓶加入IPTG到终浓度为1mmol/L(加入300μLIPTG)选3瓶加入IPTG到终浓度为0.1mmol/L(加入30μLIPTG)选3瓶加入IPTG到终浓度为0.01mmol/L(加入3μLIPTG)选终浓度为1mmol/L、0.1mmol/L、0.01mmol/L各一瓶放入台式恒温振荡器180rpm37℃培养过夜。选终浓度为1mmol/L、0.1mmol/L、0.01mmol/L各一瓶放入台式恒温振荡器180rpm25℃培养过夜。选终浓度为1mmol/L、0.1mmol/L、0.01mmol/L各一瓶放入台式恒温振荡器180rpm16℃培养过夜。取不同诱导条件培养过夜的9瓶菌液各1mL到9个1.5mL离心管，12000rpm离心2min，留沉淀去上清，各加入100μL水重悬，各加25μL5×SDSLoadingbuffer，煮沸5min，12000rpm离心10min，取上清上样。点蛋白样：用蛋白专用板头滴⑴unstainedProeinMarkerIV.MidRange(500u)=5μL⑵pET28a-BL21全菌液：15μL⑶BL21-rv1451(1mmol/L、37℃)：15μL⑷BL21-rv1451(1mmol/L、25℃)：15μL⑸BL21-rv1451(1mmol/L、16℃)：15μL⑹BL21-rv1451(0.1mmol/L、37℃)：15μL⑺BL21-rv1451(0.1mmol/L、25℃)：15μL⑻BL21-rv1451(0.1mmol/L、16℃)：15μL⑼BL21-rv1451(0.01mmol/L、37℃)：15μL⑽BL21-rv1451(0.01mmol/L、25℃)：15μL⑾BL21-rv1451(0.01mmol/L、16℃)：15μL⑿BL21-pET28a上清（破）：35μL⒀BL21-pET28a下沉（破）：15μL考马斯亮蓝G-250染色液染色2h，接着用考马斯亮蓝染色液脱色剂脱色至出现清晰条带。2.2.5蛋白纯化研究配制1L液体培养基，分装到两个锥形瓶各500mL，各加入5mLBL21-rv1451，500μLKan，于180rpm37℃中培养至OD600=0.8-1，加入IPTG到终浓度为0.1mM，于25℃180rpm中培养过夜。将诱导后的菌液倒入离心桶，4000rpm离心40min，加入NPI-1025mL，震荡摇匀，倒入50mL离心管，再加入25mLNPI-10清洗倒入离心管，分装到两个离心管各25mL。各加入PMSF(100mM)25μL，超声破碎后倒入加厚的离心管，12000rpm离心20min，将上清倒入50mL离心管，用0.22μm过滤膜过滤。用铁架台固定cartridge，取出入口和出口塞子，用纯净水注满注射器，待自然流尽后加入BufferNPI-10自然流尽。用滴管将上清液适量滴入注射器，达到适量的流速，用50mL离心管接住下流液体，重复滴入注射器。待溶液流尽后加入NPI-10，用蛋白纯化检测无蛋白流出再加入NPI-40，检测无蛋白流出再加入NPI-250，收集流出的蛋白。依次加入NPI-250、NPI-10、0.5mol/LNaOH、纯净水清洗注射器，再加入适量20％乙醇加塞子4℃保存。取收集到的蛋白50μL，加入12.5μL5×SDSLoadingbuffer，煮沸5min，上样进行电泳，将电泳后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝G-250染色液染色2h，接着用考马斯亮蓝染色液脱色剂脱色至出现清晰条带。2.3rv1451克隆到pET22b载体实验方法2.3.1pET22b-rv1451表达质粒构建ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>王德群</Author><Year>2019</Year><RecNum>485</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[5]</style></DisplayText><record><rec-number>485</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzfxfprauxxrffe2dw95psxgv2d0p2sfvp9v">485</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>王德群</author></authors></contributors><auth-address>安徽中医药大学;</auth-address><titles><title>六探《神农本草经》药性</title><secondary-title>皖西学院学报</secondary-title></titles><periodical><full-title>皖西学院学报</full-title></periodical><pages>104-112</pages><volume>35</volume><number>04</number><keywords><keyword>神农本草经</keyword><keyword>药性</keyword><keyword>伤寒论</keyword><keyword>中医临床</keyword></keywords><dates><year>2019</year></dates><isbn>1009-9735</isbn><call-num>34-1232/Z</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[\o"王德群,2019#485"5]1.聚合酶链式反应（PCR）扩增rv1451基因片段ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>李思文</Author><RecNum>454</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[6]</style></DisplayText><record><rec-number>454</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzfxfprauxxrffe2dw95psxgv2d0p2sfvp9v">454</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>李思文</author><author>谢明</author><author>王莹</author></authors></contributors><auth-address>辽宁中医药大学药学院;</auth-address><titles><title>本草古籍的现代出版物与其利用情况探析——以《神农本草经》《本草经集注》《新修本草》《证类本草》《本草纲目》为例</title><secondary-title>中国现代中药</secondary-title></titles><periodical><full-title>中国现代中药</full-title></periodical><pages>1-12</pages><keywords><keyword>本草文献</keyword><keyword>《神农本草经》</keyword><keyword>《本草经集注》</keyword><keyword>《新修本草》</keyword><keyword>《证类本草》</keyword><keyword>《本草纲目》</keyword></keywords><dates></dates><isbn>1673-4890</isbn><call-num>11-5442/R</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[\o"李思文,#454"6]利用引物对pET22b-rv1451IF-F(5‘ATTAATTCGGATCCGGTGAACGTTCGCGGGCGCGT3’)和pET22b-rv1451IF-R(5‘GTGGTGGTGGTGGTGGTGCAGCGTGGGCAGCGCGA3’)对结核菌rv1451基因进行PCR扩增，其体系及扩增程序分别见表2-11和表2-12。表2-11.结核菌rv1451基因PCR扩增体系（25μL）试剂体系（μL）5×PrimestarBuffer(Mg2+Plus)5dNTP（2.5mMeach）222b-rv1451IF-F(10pmoL/μL)122b-rv1451IF-R(10pmoL/μL)1100%DMSO1.25PrimeSTARHSDNAPolymerase0.125ddH2O13.625阳性（×7）Mtb基因组1阴性（×1）ddH2O1表2-12.结核菌rv1451基因PCR扩增程序步骤温度时间195℃2min295℃20s360.9℃15s472℃1min5gotostep2-429×672℃2min712℃∞凝胶电泳120V40min①DNAMarker5μLPCR产物（阴性）+10×LoddingBuffer25μL③-⑨PCR产物（阳性）+10×LoddingBuffer25μL将目的条带切下，称量，胶重0.414g。2.聚合酶链式反应（PCR）扩增pET22b基因片段ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>李思文</Author><RecNum>454</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[6]</style></DisplayText><record><rec-number>454</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vzfxfprauxxrffe2dw95psxgv2d0p2sfvp9v">454</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>李思文</author><author>谢明</author><author>王莹</author></authors></contributors><auth-address>辽宁中医药大学药学院;</auth-address><titles><title>本草古籍的现代出版物与其利用情况探析——以《神农本草经》《本草经集注》《新修本草》《证类本草》《本草纲目》为例</title><secondary-title>中国现代中药</secondary-title></titles><periodical><full-title>中国现代中药</full-title></periodical><pages>1-12</pages><keywords><keyword>本草文献</keyword><keyword>《神农本草经》</keyword><keyword>《本草经集注》</keyword><keyword>《新修本草》</keyword><keyword>《证类本草》</keyword><keyword>《本草纲目》</keyword></keywords><dates></dates><isbn>1673-4890</isbn><call-num>11-5442/R</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[\o"李思文,#454"6]提前培养大肠杆菌DH5α-pET22b菌株并提取质粒，将质粒稀释至10ng/μL。利用引物对pET22bIF-F(5’CACCACCACCACCACCACTGAG3’)和pET22bIF-R(5’CGGATCCGAATTAATTCCGATA3’)对载体PET22b进行PCR扩增，其体系及扩增程序分别见表2-13和表2-14。表2-13.结核菌pET22b基因PCR扩增体系（25μL）试剂体系（μL）5×PrimestarBuffer(Mg2+Plus)5dNTP（2.5mMeach）2pET22bIF-F(10pmoL/μL)1pET22bIF-R(10pmoL/μL)1PrimeSTARHSDNAPolymerase0.125dd