SD大鼠灌胃给予CTIY08 4周重复给药毒性预试验

SD大鼠灌胃给予CTIY084周重复给药毒性预试验SD大鼠灌胃给予CTIY084周重复给药毒性预试验ABSTRACTObjective:SDratswerefedCTIY08byconstantlyintragastricadministrationtwiceadayfor4consecutiveweeks,withoutarecoveryperiod.Observetheproperty,theextent,thedose-effectandthetime-effectrelationshipofthetoxicreactionprobablycausedbythesample,judgethetoxicitytargetorgansortargettissues,andstudytheirtoxicokineticfeatureconditioninthemeanwhile,providingareferenceforlaterformaltests.Methods:Acro66SDratswererandomlydividedintosolventcontrolgroup,CTIY08low-dosegroup,CTIY08medium-dosegroup,andCTIY08high-dosegroupbygenderandweight.EachCTIY08dosegroupincluded18rats[6ratspergroupforthemaintest,12ratspergroupforthetoxicsatellitegroup(alternateblooding,6ratsonegroupactually)],12ratsinthesolventcontrolgroup(6ratspergroupforthemaintest,6ratspergroupforthetoxicsatellitegroup),halfmaleandhalffemale.Thesingledoseoflow,mediumandhighCTIY08dosegroupswere15,75and125mg/kg,respectively.ThedoseofhighCTIY08dosegroupwasalteredinto100mg/kgontheseconddayofthetest,andthesingledoseofCTIY08mediumgroupwaschangedinto50mg/kgontheeighthday,thevolumeofeverydosewas10mg/kg,andthecorrespondingdoseconcentrationswererespectively1.5and7.5(thefirstdaytotheseventhday)/5.0(theeighthdaytothe28thday)and12.5(thefirstdayoftest)/10.0(theseconddayoftesttothetenthday)mg/kg,performedtwiceaday,.Thetotaldosewereseparately30,150(thefirstdaytotheseventhday)/100((theeighthdaytothe28thday)and250(thefirstdayofthetest)/200(theseconddayofthetesttothetenthday)mg/kg.Thesolventcontrolgroupwasappliedthesamevolumeofsolvent(0.5%CMC-Na),dosedtwiceaday,withanintervalofcirca6hbetweentwodoses,lasting4consecutiveweeks.Theanimalsinthehigh-doseCTIY08groupwerecontinuouslyfedfor10daysduetointolerance,terminatingontheeleventhday.Results:Noabnormalitywasobservedintheanimalsofthesolventcontrolgroup;AlltheanimalsintheCTIY08low-dosegrouphadabdominaldistensionsinthetest;OnlyonesurvivedintheCTIY08medium-dosegroup;Thereweresomesymptomsshowedintheanimalsbeforethedeath,suchasabnormalgait,activityreducing,abnormalheadmovement,cornealturbidity,proneness,abdominaldistension,hindlimbparalysis,backarching,tilting,chill,weightloss,abnormalmucousmembranecolor,swelling,perianalcontamination,haircontamination,andthechanginginthecolorofeyesecretion,nasalsecretions,fecalsalivation,urine,etc;allanimalsintheCTIY08high-dosegroupdied,andabnormalgait,activityreduction,abnormalheadmovement,cornealturbidity,proneness,tilting,abdominaldistension,hindlimbparalysis,chill,haircontamination,andeyesecretions,salivationandothersymptomswereseenbeforedeath.Conclusion:CTIY08drughadsignificantlyside-toxiceffectsonSDrats.Keywords::CTIY08,Targetorgan,SDrat,Repeateddrugtoxicityexperiment目录摘要 1ABSTRACT 21．前言 62.材料与方法 72.1实验动物和试剂材料 72.2动物的饲养和管理 82.2.1 动物管理和使用 82.2.2接收和适应 92.2.3 动物饲养 92.2.4 饲养环境 92.2.5 环境改善 102.2.6 饲料 102.2.7 垫料 102.2.8 饮水 112.3实验仪器 112.4实验设计 122.5给药信息 132.6剂量设计依据 142.7观察与检查 142.7.1一般状态观察和体重测量 142.7.2摄食量 152.8临床检验 162.8.1检测时间及样本采集方法 162.8.1.1血液样 162.8.1.2样本用途，收集量和收集管类型 162.8.2临床病理指标与方法 162.8.2.1血液学指标 162.8.2.2凝血指标检测 172.8.2.3样本的保存与运输 172.9毒代动力学血样采集及处理 172.10大体解剖和脏器称量 172.10.1解剖时间 172.10.2解剖动物 172.10.3麻醉及安乐死方法 182.10.4大体解剖观察 182.10.5濒死动物的处置 182.10.6死亡动物的处置 182.11统计分析 193.实验结果 193.1一般状态观察 193.2.体重和摄食量 203.3.血液学指标 223.4.凝血指标 233.5.毒代动力 243.6.非计划死亡动物及大体解剖 263.7计划解剖动物大体解剖观察 273.8.血生化指标 253.9.尿液指标 274.讨论 285.结论 29参考文献 30致谢 32前言根据近几年来的各种调查显示，我国死亡率排行榜前几位疾病分别为脑血管病、恶性肿瘤、心脏病，呼吸系统疾病等，恶性肿瘤致死率位居前三[1]。也就是说，恶性肿瘤对病人的生命存在很大的威胁，为了攻克恶性肿瘤给病人带来的痛苦，越来越多的人开始投身于对恶性肿瘤治疗的研究。随着社会和科技的发展，恶性肿瘤治疗观念正在发生根本性的改变，即由经验科学向循证医学、由细胞攻击模式向靶向性治疗模式转变[2]。应用靶向技术向肿瘤区域精确递送药物的"靶向治疗"和利用肿瘤特异的信号传导或特异代谢途径控制的"靶点治疗"是肿瘤研究的热点[3]。CTIY08为靶向疗法中的双特异性抗体药物，可抑制致瘤因子的产生，临床拟用于治疗恶性肿瘤。所谓靶向治疗，是指在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点的治疗方式也就是说该位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子[4]，也可以是一个基因片段。靶向治疗可设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡[5]，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞，所以分子靶向治疗又被称为"生物导弹"[6]。而双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁[7]，激发具有导向性的免疫反应，是基因工程抗体的一种，现已成为抗体工程领域的热点，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景[8]。双特异性抗体又分为双特异性微抗体和双链抗体。根据相关调查显示，目前已经有超过39种单克隆抗体药物被相关机构认证，并且运用到了临床抗肿瘤治疗中，虽然它们给肿瘤免疫治疗带来了突破性的成效，但是其疗效往往有限，并且其中一些会产生耐药性，从而导致部分患者用药后没有响应，或者在初始响应后出现复发再进展。普通的肿瘤治疗性抗体只能结合单一的抗原，其结合特异性相对较低，容易发生脱靶效应。然而双特异性抗体能分别识别和结合两种不同的抗原，所以它可以把免疫细胞、病毒分子等连接到肿瘤细胞上[9]，进而增强对靶细胞的杀伤作用，同时它也可以结合相同肿瘤细胞上的不同抗原以增强其结合特异性，从而减少脱靶毒性等副作用。这种具有双功能的重组抗体作为治疗肿瘤的药物拥有比单抗药物更高的疗效。1986年，Staerz和Bevan第一次利用双特异性抗体把细胞毒性T淋巴细胞(CTL)运用于癌细胞溶解实验。2014年12月，美国食品和药品监督管理局(FDA)批准安进公司研发的双特异性抗体免疫治疗药物Blinatumomab用于复发性或难治性的费城染色体阴性(Ph-)前B细胞急性淋巴细胞白血病(Acutelymphoblasticleukemia，ALL)的治疗，其临床Ⅱ期数据显示在189个接受Blinatumomab单药治疗的患者中有81个病人(42.9%)在经过两次药物注射后达到完全缓解。随着全球环境的恶化和人们生活习惯的改变，肿瘤的发病率越来越高，肿瘤患者的死亡率也逐渐上升，故抗肿瘤药物的市场将不断扩大。双特异性抗体是抗体药物领域中的一个新概念，被视为肿瘤治疗的第二代抗体，拥有广阔前景。2014年6月由Marketwatch发布的一份报告显示，2023年双特异性抗体药物的市场将达到44亿美元。近10年来，应用双特异性抗体来进行肿瘤治疗的研究已经取得了一定进展，多家生物医药公司也开展了多种相关药物的研发，TrionPharma公司的Catumaxomab和Amgen公司的Blinatumomab在临床试验中表现优秀并成功上市，有利的证明了双特异性抗体药物的有效性。CTIY08为双特异性抗体药物，为探索该药物对动物机体的毒副作用，本实验拟选用SD大鼠通过灌胃给予CTIY08药物，每天给药2次，连续给药4周，观察该供试品是否对SD大鼠产生毒副作用，观察给药后SD大鼠的形态特征变化，可能引起毒副反应的性质、程度、量效、时效关系，判断毒性靶器官或靶组织，为CTIY08药物的临床前研究提供参考信息，从而为该药物的临床开发应用提供实验依据[10]。材料与方法2.1实验动物和试剂材料实验动物：SPF级SD大鼠；来源：北京维通利华实验动物技术有限公司；性别和数量:购入动物70只，雌、雄各半；使用动物66只，雌、雄各半；体重：购入时143.8~177.8g；分组时体重：雄性为209.0~235.1g，雌性为181.9~208.5g，分组时个体体重应在同性别平均体重±20％范围内；年龄：购入时约5~8周龄，分组时约6~9周龄。选择健康（未孕、未育）大鼠作为受试动物。适应期主要对动物进行一般状态观察，检查不合格的动物不纳入试验。试剂材料：供试品，CTIY08；性状：白色固体；含量：96.43%；批号：CTIY08-004-098-1，有效期至：2020-12-31；保存条件：2~8℃、遮光。溶媒名称：羧甲基纤维素钠；生产厂家：Aladdin；性状：白色或灰白色粉末或固体或块状物；规格：500g/瓶；批号：E1804105；有效期至：2020-10-29；保存条件：室温。2.2动物的饲养和管理2.2.1 动物管理和使用苏州华测生物技术有限公司是获得“国际实验动物评估和认可管理委员会（AAALACInternational）”认证的机构，实验动物的使用获得了江苏省科学技术厅的批准。本试验不是以前任何试验的简单重复，没有其他替代试验可以解决；并且经文献检索，没有其他可以引起较少疼痛和紧张的方法可以替代本试验中提到的操作方法。本试验涉及的与动物试验相关的内容和程序都遵从实验动物使用和管理的相关法律法规和本机构实验动物管理和使用委员会（InstitutionalAnimalCareandUseCommittee，IACUC）的相关规定[11]。动物数量、试验设计及动物的处理须通过本机构IACUC审批，并严格按IACUC批准的内容执行[12]。2.2.2接收和适应实验动物接收后需先适应环境7天。2.2.3 动物饲养本机构实验动物使用许可证号：SYXK(苏）2018-0051；饲养地点：苏州华测生物技术有限公司1号楼2楼屏障系统内；饲养笼种类：聚砜大鼠笼具，规格（L×W×H）：50cm×36cm×20cm；饲养密度：≤4只/笼。2.2.4 饲养环境饲养环境条件标准：中华人民共和国国家标准GB14925-2010；饲养环境控制系统：MSEA-MVE6.0江森动物房环境监测系统；温度：20.9~23.6℃（日温差0.3~2.4℃）；相对湿度：42.3%~67.0%；光照：人工照明，12小时明暗交替；换气次数：每小时空气更换不少于15次。2.2.5 环境改善为实验动物提供玩具，作为环境改善措施，参照实验动物的环境丰富相关SOP。2.2.6 饲料种类：SPF大小鼠维持饲料；饲料批号：19093213、19103213；生产单位：北京科澳协力饲料有限公司；生产许可证编号：SCXK（京）2019-0003；给料方法：自由摄取[13]；供应商提供饲料的质量合格证明，合格证号：1112621900012821、1112621900015062、1112621900014480；营养成分：具有谱尼测试提供的检测报告（报告编号：GNABSKGA1S1088570，报告签发日期：2019-09-25），检测指标包括水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙、总磷[14]。检测结果符合检测结果符合国标；化学污染物：具有谱尼测试提供的检测报告（报告编号：GNABSKGA1S1088571，报告签发日期：2019-09-25），检测指标包括砷、铅、镉、汞、六六六、滴滴涕、黄曲霉毒素B1。检测结果符合国标；微生物指标：具有谱尼测试提供的检测报告（报告编号：GNABSKGA1S1088572，报告签发日期：2019-09-25）检测指标包括菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌计数、沙门氏菌[15]。检测结果符合国标。2.2.7 垫料垫料种类：玉米芯；垫料批号：19079811、19109811；生产单位：北京科奥协力饲料有限公司；生产许可证号：SCXK(京)2015-0013；保存与使用：低温、干燥、卫生；将灭菌的垫料铺于大鼠笼盒底部，以铺满整个底部为宜；北京科奥协力饲料有限公司，具有谱尼测试提供垫料的检测报告（报告编号：GNAEQIEA1S1054125，报告签发日期：2019-07-16；报告编号：GNAPXKGA1S10A6409，报告签发日期：2019-10-21）检测指标包括砷、铅、镉、汞、六六六、滴滴涕、黄曲霉毒素B1。检测结果符合要求。2.2.8 饮水种类：反渗透水（生活饮用水）；供水方法：饮水瓶盛装，自由摄取；水质常规指标的检测：具有江苏华测品标检测技术有限公司提供的检测报告（报告编号：A20190208613101，报告签发日期：2019-10-11）检测项目包括：pH值、色度、浑浊度、臭和味、肉眼可见物、总硬度、耗氧量、溶解性总固体、阴离子合成洗涤剂、挥发酚类、氰化物、六价铬、硫酸盐、氯化物、氟化物、硝酸盐氮、氯酸盐、亚氯酸盐、溴酸盐、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、菌落总数、铝、铁、锰、铜、锌、砷、镉、铅、硒、汞、甲醛、氯仿（三氯甲烷）、四氯化碳、总α放射性、总β放射性。检测结果符合国标。2.3实验仪器设备名称制造商型号全自动血液分析仪SiemensADVIA2120i全自动生化分析仪Rochecobas6000全自动血凝分析仪SysmexCA-7000电子天平梅特勒-托利多MS204TS/022.4实验设计组别设计：溶媒对照组、CTIY08低剂量组、CTIY08中剂量组、CTIY08高剂量组；动物数量：CTIY08各剂量组18只/组[主试验6只/组，毒代卫星组试验12只/组（交替采血）]，溶媒对照组12只/组（主试验6只/组，毒代卫星组试验6只/组），共计66只；分组方法：分性别按体重分层随机分组具体分组信息见表1：表1实验分组设计情况组别供试品总给药剂量（mg/kg）单次给药剂量（mg/kg）给药浓度（mg/mL）动物编号雌性雄性溶媒对照组0.5%CMC-Na0001F001~1F0061M001~1M006CTIY08CTIY08130151.52F001~2F0092M001~2M009低剂量组CTIY08CTIY08150757.53F001~3F0093M001~3M009中剂量组CTIY081CTIY0825012512.54F001~4F0094M001~4M009高剂量组注：动物编号的首位数字代表组别（1、2、3、4分别代表溶媒对照组、CTIY08低剂量组、CTIY08中剂量组、CTIY08高剂量组），第二位字母代表性别（F为雌性、M为雄性），最后3位数字代表动物顺序号，每组001~003号动物为主试验组动物，其余号为毒代卫星组动物，其中溶媒对照组毒代卫星组动物为004~006号，剂量组毒代卫星组动物为004~009号。毒代动力学采血时间、动物数和动物编号见表2：表2毒代卫星组采血时间点情况组别采血时间、动物数和动物编号第一次给药的给药前，第二次给药的给药后4h第一次给药的给药后0.5h、4h、24h，第二次给药的给药后2h溶媒对照组(♀3/♂3)1F004~1F0061M004~1M006仅采集给药前(♀3/♂3)1F004~1F0061M004~1M006仅采集第一次给药后4hCTIY08低剂量组(♀3/♂3)2F004~2F0062M004~2M006(♀3/♂3)2F007~2F0092M007~2M009CTIY08中剂量组(♀3/♂3)3F004~3F0063M004~3M006(♀3/♂3)3F007~3F0093M007~3M009CTIY08高剂量组(♀3/♂3)4F004~4F0064M004~4M006(♀3/♂3)4F007~4F009@4M007~4M009注：首次给药（D1）、末次给药（D28）分别进行TK采血。“@”代表CTIY08高剂量组D1给药后24h雌性采血动物变更为4F006、4F008、4F009。Dn代表给药第n天。2.5给药信息给药剂量：CTIY08低剂量组、CTIY08中剂量组、CTIY08高剂量组单次给药剂量分别15mg/kg、75mg/kg和150mg/kg，每天给药2次，总给药剂量分别30mg/kg、150mg/kg和250mg/kg。其中D2CTIY08高剂量组单次给药剂量变更为100mg/kg，总给药剂量变更为200mg/kg。D8CTIY08中剂量组单次给药剂量变更为50mg/kg，总给药剂量变更为100mg/kg；给药体积：各组每次给药体积均为10mL/kg，每只动物的给药量根据最近一次体重进行调整；给药浓度：CTIY08低剂量组、CTIY08中剂量组、CTIY08高剂量组单次给药浓度分别为1.5mg/mL、7.5（D1~D7）/5.0（D8~D28）mg/mL、12.5（D1）/10.0（D2~D10）mg/mL；给药途径：灌胃，供试品给药组给药制剂在给药前用磁力搅拌器以一定转速搅拌20min及以上（转速设定以形成明显凹陷但不产生漩涡及大量气泡为准）；选择理由：与临床用药途径一致；给药频率及周期：每天给药2次，2次给药间间隔约6h，连续给药4周；其中CTIY08高剂量组动物由于不耐受，连续给药10天，于D11停药；恢复期：不设恢复期；计划解剖动物：给药期结束解剖日（D29）解剖6只/组，雌、雄各半，共计24只；动物进入本专题当天定义为适应期（PretestPhase）第1天（P1），首次给药当天定义为给药期（DosingPhase）第1天（D1）。2.6剂量设计依据CTIY08大鼠药代实验时发现300mg/kg单次给药后大鼠出现活动明显降低（趴伏不动），体凉等明显不良反应，24h内恢复正常；100mg/kg组未见异常。根据ICHM3（R2）及《药物重复给药毒性试验技术指导原则》（原CFDA，2014年05月）重复给药毒性试验低剂量原则上高于动物药效剂量或临床使用剂量的等效剂量，高剂量尽量暴露药物的可能毒性。据此，结合委托方要求，本试验设计CTIY08低、中、高剂量组单次给药剂量分别15mg/kg、75mg/kg和125mg/kg，每天给药2次，总给药剂量分别30mg/kg、150mg/kg和250mg/kg。同时设置溶媒对照组，相同方法给予溶媒。由于试验过程中动物不耐受，D2CTIY08高剂量组单次给药剂量变更为100mg/kg，总给药剂量变更为200mg/kg。D8CTIY08中剂量组单次给药剂量变更为50mg/kg，总给药剂量变更为100mg/kg。2.7观察与检查2.7.1.一般状态观察和体重测量观察时间：动物入室后由兽医观察5天，每天观察1次。适应期分组后每天上、下午各观察1次；给药期每次给药前及给药后各观察1次，动物出现明显毒性症状时，可增加观察频率，并记录时间；观察内容：包括但不限于一般表现、行为状态、眼睛、口腔、鼻口部、耳、毛发及皮肤、粪便、尿、生殖器等毒性症状；观察动物：所有存活试验动物体重测定时间：适应期测定2次，给药期每周测定2次，计划解剖动物解剖前称重1次（该体重仅用于计算脏体比，不纳入对体重指标的统计分析中），毒代卫星组存活大鼠体重仅用于给药量计算不纳入对体重指标的统计分析中；体重测定动物：所有存活的试验动物（解剖当天仅测定待解剖动物）。体重测定时间：适应期测定2次，给药期每周测定2次，计划解剖动物解剖前称重1次（该体重仅用于计算脏体比，不纳入对体重指标的统计分析中），毒代卫星组存活大鼠体重仅用于给药量计算不纳入对体重指标的统计分析中；体重测定动物：所有存活的试验动物（解剖当天仅测定待解剖动物）。2.7.2摄食量测定时间：适应期测定1次，给药期每周测定1次；测定动物：主试验所有存活大鼠；测定方法：第1天测定每一饲养笼给饲料量，第2天在大致相同的时间测定剩余饲料量，二者的差为每一饲养笼动物24小时的总进食量，以此除以每笼动物数，计算得到每只动物的平均摄食量（根据供试品特点可以适当调整测量频率）。2.8临床检验2.8.1检测时间及样本采集方法2.8.1.1血液样本检测时间：给药期结束（D29），计划解剖当日；检测动物：主试验组待解剖大鼠；采集方法：采样检测前大鼠禁食至少8小时。待解剖大鼠经戊巴比妥钠麻醉（腹腔注射，60mg/kg，浓度为20mg/mL）后自腹主动脉采血；处理方法：凝血样本3000r/min，室温，离心10min后上机检测；血液学样本直接上机检测[16]。2.8.1.2样本用途，收集量和收集管类型表3样本的用途和采集量检测项目样本收集量收集管类型血液学检查不少于1mLEDTA•K2抗凝管凝血功能检查约1.8mL枸橼酸钠抗凝管2.8.2临床病理指标与方法2.8.2.1血液学指标表4血液学检测的指标和检测方法检测项目检测方法红细胞计数（RBC）二维激光扫描法血红蛋白（HGB）氰化血红蛋白法红细胞比积（HCT）计算：MCV×RBC平均红细胞体积（MCV）二维激光扫描法平均红细胞血红蛋白含量（MCH）计算：HGB/RBC平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）计算：HGB/(MCV×RBC)×1000网织红细胞计数（#RETIC）Oxazine750染色法网织红细胞百分比（%RETIC）计算：（RET/RBC）×100白细胞计数（WBC）二维激光扫描法中性粒细胞计数（#NEUT）及百分比（%NEUT）过氧化物酶染色法淋巴细胞计数（#LYMPH）及百分比（%LYMPH）过氧化物酶染色法单核细胞计数（#MONO）及百分比（%MONO）过氧化物酶染色法嗜酸性粒细胞计数（#EOS）及百分比（%EOS）过氧化物酶染色法嗜碱性粒细胞计数（#BASO）及百分比（%BASO）过氧化物酶染色法血小板计数（PLT）二维激光扫描法2.8.2.2凝血指标检测表5凝血检测的指标和检测方法检测项目检测方法凝血酶原时间（PT）凝固法活化部分凝血活酶时间（APTT）凝固法凝血酶时间（TT）凝固法纤维蛋白原（FIB）凝固法2.8.2.3样本的保存与运输血液学、凝血样本在采集后放入样品运输箱，2h内送检。2.9毒代动力学血样采集及处理血样采集：CTIY08各给药组首次给药及末次给药（D28）：当天第一次给药的给药前及给药后0.5h（±1min）、4h（±5min）和24h（±15min），第二次给药的给药后2h（±5min）、4h（±5min）各采集1个点。溶媒对照组：首次给药及末次给药（D28）的给药前及给药后4h（±5min）；采样方法：颈静脉采血约0.2mL全血，采样后放入EDTA•K2抗凝管；血样处理：全血样品离心前冰盒中放置，于冰盒中运输，于2~8℃，4000r/min，离心10min；分离血浆，分装2管保存，30μL/管，于-60℃以下冻存。检测其毒代参数。2.10大体解剖和脏器称量2.10.1解剖时间给药期结束（D29）。2.10.2解剖动物所有主试验待解剖动物：解剖6只/组，雌雄各半，共计24只（CTIY08高剂量组4F001于D2发现濒死，4F003、4F002、4M003、4M001、4M002分别于D5、D7、D8、D9、D10发现死亡。CTIY08中剂量组3F001、3M002分别于D10、D14发现死亡，3F002、3F003均于D11发现濒死，3M001于D15发现濒死；故实际按计划解剖13只）。2.10.3麻醉及安乐死方法麻醉前待解剖大鼠禁食至少8小时，采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，注射剂量为60mg/kg，浓度为20mg/mL，注射容积约为3mL/kg，麻醉后腹主动脉放血安乐死。2.10.4大体解剖观察先进行一般检查，检查动物外观，包括体型，营养状况，被毛，皮肤和给药局部，外生殖器及各腔道等。打开腹腔，盆腔，胸腔并检查各腔内脏器，观察各脏器在体位置，颜色，大小，硬度，有无出血及粘连等，并记录剖检所见。2.10.5濒死动物的处置CTIY08高剂量组4F001、4F009分别于D2、D6发现濒死；CTIY08中剂量组3F002、3F003均于D11发现濒死，3M001于D15发现濒死。以上所有主试验组动物均进行临床病理检查、大体解剖观察及脏器称量，毒代卫星组动物仅进行大体解剖观察。2.10.6死亡动物的处置主试验组动物死亡时进行如下处理：记录大鼠死亡时间或发现死亡时间，测定体重后迅速解剖进行大体观察，尽量查明死因。明显自溶的脏器组织则不再进行固定保存及组织病理学检查。不能及时检查时，把死亡动物装入塑料袋，放入冰箱中暂存（2~8℃），尽快解剖。非主试验组动物记录大鼠死亡时间或发现死亡时间，仅进行大体观察，对肉眼所见异常进行组织病理学检查。2.11统计分析数据经Excel2010和SPSS22.0软件进行录入与统计分析。定量指标均采用均数±标准差描述，定性指标采用频数与百分率描述。定量指标先采用LEVENE检验进行方差齐性检验，当方差齐时（P>0.05），则采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计学检验，差异有统计学意义时（P＜0.05），采用Dunnett’st检验（Dunnett法）比较组间差异[6-9]。当LEVENE方差齐性检验，提示方差不齐时（P＜0.05），采用Kruskal-WallisH秩和检验（K-W法）进行分析；差异有统计学意义时（P＜0.05），采用Mann-WhitneyU秩和检验（M-W法）比较组间差异。定性指标采用χ2检验进行分析，差异有统计学意义时（P＜0.05），则继续用χ2检验比较组间差异。组间差异比较在CTI08各剂量组与溶媒对照组之间进行。所有检验均为双侧检验，P＜0.05确认为有统计学意义。3.实验结果3.1一般状态观察试验期间，CTIY08高剂量组雌性动物于D2~D9全部发现死亡或濒死，雄性动物于D6~D117/9发现死亡，死前可见步态异常、活动减少、异常头部移动、角膜浑浊、俯卧、倾斜、腹部膨胀、后肢瘫痪、身体发冷、被毛污染、眼分泌物、流涎等症状；CTIY08中剂量组雌性动物于D8~D149/9发现死亡或濒死，雄性动物于D10~D267/9发现死亡或濒死，死前可见步态异常、活动减少、异常头部移动、角膜浑浊、俯卧、腹部膨胀、后肢瘫痪、背部弓起、垫脚走路、倾斜、身体发冷、消瘦、粘膜颜色异常、肿胀、肛周污秽、被毛污染、眼分泌物、鼻分泌物、粪便异常、流涎、尿液变色等症状；溶媒对照组和CTIY08低剂量组所有动物均存活至给药期结束。试验期间，CTIY08中剂量组存活的一只主试验组雄性动物D4开始可见步态异常、活动减少、异常头部移动、腹部膨胀等症状。CTIY08低剂量组主试验组所有动物D15开始均可见腹部膨胀。溶媒对照组所有动物均未见明显异常。表8SD大鼠灌胃给予CTIY08毒性试验一般状态观察结果汇总表（症状动物数）症状溶媒对照组CTIY08低剂量组CTIY08中剂量组CTIY08高剂量组动物数12181818腹部膨胀0181818步态异常001818活动减少001818倾斜001818异常头部移动001818眼睛分泌物001818双眼角膜浑浊001818背部弓起001818被毛污染001818垫脚走路001818俯卧001818后肢瘫痪001818身体发冷001818粘膜颜色异常001818濒死00211发现死亡001573.2体重和摄食量试验期间，与溶媒对照组相比，CTIY08各剂量组D3开始体重显著升高或有一定升高趋势，直至给药期结束。非计划死亡动物死前体重有一定下降趋势。体重的升高有一定剂量效应关系，考虑药物相关。试验期间，与溶媒对照组相比，CTIY08各剂量组D7开始摄食量有一定增加趋势。当笼中有动物出现非计划死亡时，该笼动物平均摄食量有下降趋势。结果提示：本试验条件下，供试品给药后可使动物体重、摄食量显著增加或有一定增加趋势。表9体重个体汇总表动物编号P1P6D3D7D10D14D17D21D24D281F001162.1197.1207.6220.2219.8233.3241.4248.4248.5249.3动物编号P1P6D3D7D10D14D17D21D24D281F002156.4196.9211.0227.5234.7249.9252.1260.8270.0273.21F003154.3194.7196.6215.9232.6247.1248.2261.2268.1279.42F001165.4205.7232.3271.2286.9339.2373.8409.5401.5449.02F002169.3195.1221.3240.1270.4309.1315.8340.8374.5399.32F003148.3189.8219.4249.8270.3314.8334.4360.0382.1401.53F001158.5207.2222.3256.33F002143.8181.9196.4206.7176.03F003150.7186.9215.6235.1231.64F001165.1195.94F002154.1193.8206.54F003163.9208.5203.01M001173.7221.9252.6273.5289.8314.3328.7345.3351.1369.41M002160.4225.6257.3294.2321.2354.4379.5412.9429.8458.51M003177.8230.6251.2293.9319.8346.8371.8396.4410.9428.32M001162.8223.7271.5327.8367.2425.4466.0495.9534.7562.72M002171.3233.3284.2343.7380.5425.4458.5497.7522.4556.72M003163.4209.7238.3301.7329.4372.5386.1433.6457.6491.03M001157.1211.3257.7298.2307.4298.13M002160.2220.0278.4331.4343.43M003158.7233.7281.0353.6403.5458.7504.5516.5545.9567.34M001162.7220.7269.2321.14M002162.4235.1287.1341.44M003159.2222.4262.9279.6注：Pn表示适应期第n天；-代表不适用表10平均摄食量汇总表动物编号P7D7D14D21D281F00116.8721.4021.0020.1720.831F00216.8721.4021.0020.1720.831F00316.8721.4021.0020.1720.832F00117.9733.1741.2744.7045.902F00217.9733.1741.2744.7045.902F00317.9733.1741.2744.7045.903F00116.1331.173F00216.1331.173F00316.1331.174F00116.274F00216.271.90动物编号P7D7D14D21D284F00316.271M00122.7026.2726.6028.9328.901M00222.7026.2726.6028.9328.901M00322.7026.2726.6028.9328.902M00122.0042.4046.7746.4047.772M00222.0042.4046.7746.4047.772M00322.0042.4046.7746.4047.773M00122.8045.9017.50--3M00222.8045.9017.50--3M00322.8045.9017.5047.8048.504M00124.3030.474M00224.3030.474M00324.3030.473.3血液学指标与溶媒对照组相比，CTIY08中剂量组存活动物可见WBC、#NEUT、%NEUT、#MONO、%MONO、#EOS、%EOS、PLT、#RETIC、%RETIC轻微升高，%LYMPH轻微降低。CTIY08低剂量动物MCH、MCV、#NEUT、%NEUT、#MONO、%MONO、PLT显著升高（P<0.05）或有升高趋势，其余指标变化幅度不大，均在正常范围内波动。表11血液学指标检测结果统计汇总组别溶媒对照组CTIY08低剂量组CTIY08中剂量组检测日期D29D29D11RBC(x10^12/L)7.000±0.25876.563±0.12506.505±1.2374HCT(%)40.50±1.37540.00±0.81937.85±6.152HGB(g/L)133.3±3.06131.3±2.31123.0±22.63MCH(pg)19.07±0.32120.03±0.30618.90±0.141MCHC(g/L)329.3±4.16328.7±2.89323.5±6.36MCV(fL)57.93±0.77760.93±1.43658.35±1.626#RETIC(x10^12/L)0.1737±0.010410.1560±0.015390.0265±0.00071%RETIC(%)2.490±0.23582.383±0.28430.415±0.0919WBC(x10^9/L)3.640±0.76543.977±1.21418.830±11.2289#LYMPH(x10^9/L)3.017±0.67352.907±0.87651.685±1.8880%LYMPH(%)82.87±2.47973.17±0.23128.60±14.991#NEUT(x10^9/L)0.450±0.08540.827±0.36535.300±6.8872%NEUT(%)12.67±3.25020.20*D±3.07954.30±9.051#BASO(x10^9/L)0.010±0.00000.013±0.00580.090±0.1131%BASO(%)0.27±0.1150.33±0.1531.20±0.283#MONO(x10^9/L)0.073±0.02890.130±0.03000.680±0.9334%MONO(%)1.97±0.5773.50±1.4425.10±4.101#EOS(x10^9/L)0.040±0.01730.033±0.00580.015±0.0212%EOS(%)1.07±0.2521.00±0.5200.25±0.071PLT(x10^9/L)813.0±57.58926.7*D±16.501614.0±579.833.4凝血指标与溶媒对照组相比，CTIY08中剂量组存活雄性动物血凝结果均在正常范围内波动，未见异常。CTIY08低剂量组雌性动物PT显著延长（P<0.01）、TT显著降低（P<0.05），雄性动物未见明显异常。表12凝血指标检测结果统计表（雌性动物）组别溶媒对照组CTIY08低剂量组CTIY08中剂量组检测日期D29D29D11PT(sec)7.90±0.1008.30±0.1008.35±0.212APTT(sec)16.30±1.48014.43±0.97116.60±0.849TT(sec)53.2±2.1146.2±3.6639.0±0.92FIB(g/L)1.6547±0.127561.6527±0.152116.9330±0.75943表13凝血指标检测结果统计表（雄性动物）组别溶媒对照组CTIY08低剂量组CTIY08中剂量组PT(sec)9.60±0.2009.50±0.1009.20APTT(sec)17.90±0.30018.63±0.50318.50TT(sec)58.7±1.6356.3±1.6253.4FIB(g/L)1.8550±0.018002.1327±0.121072.74203.5毒代动力学结果表明，在本研究条件下，D1和D28给药后，各剂量组CTIY08的系统暴露量（AUC0-24h和Cmax）均存在明显性别差异。与D1相比，D28给药后，CTIY08低剂量组雌性动物的系统暴露量（AUC0-24h和Cmax）无蓄积，CTIY08低剂量组雄性动物的AUC0-24h无蓄积，Cmax存在蓄积。D1给药后，各剂量组CTIY08的系统暴露量（AUC0-24h和Cmax）的增加比例均高于剂量的增加比例。表14SD大鼠首次（D1）给予CTIY08血浆中CTIY08浓度（ng/mL）SD大鼠首次（D1）给予CTIY08血浆中CTIY08浓度（ng/mL）组别动物号时间点（h）TmaxCmaxAUC0-24h给药前0.5481024hng/mLh*ng/mL溶媒对照组1F004BLOQ/BLOQ//////1F005BLOQ/BLOQ//////1F006BLOQ/BLOQ//////1M004BLOQ/BLOQ//////1M005BLOQ/BLOQ//////1M006BLOQ/BLOQ//////CTIY08低剂量组(30mg/kg)2F004/2F007BLOQ1457.91797.91218.71150.8130.223145.123367.432F005/2F008BLOQ1518.91631.33654.91221.8BLOQ83654.925872.732F006/2F009BLOQ2463.220895560.73155.4BLOQ85560.747623.6Mean01813.331839.43478.11842.6743.464120.2332287.92SD0563.63231.652176.391137.4175.173.461273.2613340.032M004/2M007BLOQ421.6450.21162.9828.5BLOQ81162.912074.982M005/2M008BLOQ770.6317.91785.7631.9BLOQ81785.711120.632M006/2M009BLOQ568.3286.3974.3837.7BLOQ8974.310576.68Mean0586.83351.471307.63766.03081307.6311257.43SD0175.2486.95424.62116.2500424.62758.46CTIY08中剂量组(150mg/kg)3F004/3F007BLOQ72842897427104.517337.22053.7428974306919.283F005/3F008BLOQ10435.333346.426105.525017.45397.4433346.4424743.053F006/3F009BLOQ6510.919419.310097.427898.56464.61027898.5373176.68Mean08076.7327246.5721102.4723417.74638.57630072.97368279.67SD02078.837122.439543.755459.352301.283.462885.4359064.343M004/3M007BLOQ2080.92729.71896.83276.81350.32540657170.93M005/3M008BLOQ2129.22907.67362.74475313.387362.767545.133M006/3M009BLOQ2520.82494.86386.27474367.810747496212.6Mean02243.632710.75215.235075.27677.136.676747.5773642.88SD0241.25207.052915.032162.03583.624.161163.1620222.52CTIY08高剂量组(250mg/kg)4F004/4F007BLOQ8468.529666.540276.122719.61071.7840276.1453901.734F005/4F008BLOQ862725279.428354.3725635527.51072563871982.64F006/4F009217.25370.921772.112531.144740.93099.71044740.9550117.15Mean72.47488.825572.6727053.8346674.53232.979.3352526.67625333.83SD125.41835.873955.3613918.1424977.892230.891.1517494.99218954.484M004/4M007BLOQ2300.34319.32698.96328323.927853.890045.954M005/4M00854.81619.25781.6124267068.7131.8812426115789.554M006/4M00996.93974.25347.110603.78698917.8810603.7137394.13Mean50.572631.235149.338576.27364.9457.83610294.5114409.88SD48.591211.88750.945170.81212.45409.763.462301.7323704.22表15SD大鼠末次（D28）给予CTIY08血浆中CTIY08浓度（ng/mL）SD大鼠末次（D28）给予CTIY08血浆中CTIY08浓度（ng/mL）组别动物号时间点（h）TmaxCmaxAUC0-24h给药前0.5481024hng/mLh*ng/mL溶媒对照组1F004BLOQ/BLOQ//////1F005BLOQ/BLOQ//////1F006BLOQ/BLOQ//////1M004BLOQ/BLOQ//////1M005BLOQ/BLOQ//////1M006BLOQ/BLOQ//////CTIY08低剂量组(30mg/kg)2F004/2F007BLOQ2514.42302.926272268.7BLOQ29169.850166.752F005/2F008BLOQ3993.82604.532162675.4169.824924.850360.82F006/2F009199.73649.94014.54523.61600.4BLOQ2582045994.83Mean66.573386.032973.973455.532181.556.626638.248840.79SD115.3774.19913.66970.72542.7898.0302237.652466.592M004/2M007137.41205.31555.22152.61096.4BLOQ23583.524797.582M005/2M008BLOQ1271.2790.81430.1765BLOQ22209.416740.852M006/2M009BLOQ2025.91267.71847.4614.9BLOQ22302.317788.13Mean45.81500.81204.571810.03825.43022698.419775.52SD79.33455.94386.09362.7246.3700767.934380.64CTIY08中剂量组(150mg/kg)3M009BLOQ2037.94229.76995.74078.565.686995.771009.23注：“BLOQ”均以“0”计算，“/”表示无数据。3.6非计划死亡动物及大体解剖表16非计划死亡动物及大体解剖动物编号死亡状态Day肉眼病变4F001濒死2肝脏颜色黄；肺脏右前叶、副叶颜色红，膨隆，气管内白色泡沫；4F005死亡2肺脏颜色暗红，膨隆，气管内白色泡沫；4F007死亡2自溶4F003死亡5肺脏颜色红4M006死亡6胸腺小；肺脏颜色红，膨隆，气管内白色泡沫；4F004死亡6未见异常4F009濒死6胸腺小；肺脏颜色暗红，膨隆，气管内白色泡沫；4F002死亡7脾脏小；胸腺小；肺脏颜色红，膨隆，气管内白色泡沫；4F006死亡7胸腺小；肺脏颜色暗红，膨隆，胃局灶红色灶4M003死亡8睾丸小、附睾小；肺脏颜色暗红，膨隆，气管内白色泡沫；胃黏膜多个白色和红色灶3F008死亡8脾脏小；胸腺小；肺脏颜色暗红，膨隆，气管内白色泡沫；4M001死亡9肺脏颜色红，膨隆，气管内暗红色泡沫；脾脏小：4M007死亡9肺脏颜色暗红，膨隆，气管内白色泡沫；肝脏颜色黄；胸腺小；脾脏小；胃黏膜白色多灶凸起；膀胱膨大，内充满淡黄色透明液体4F008死亡9自溶3M005死亡10自溶4M002死亡10自溶4M005死亡10自溶3F001死亡10肺脏颜色暗红，膨隆胸腺小；脾脏小。4M009死亡11自溶3F002濒死11心脏局灶暗红色，胸腺小，大肠（结肠）末端粗大，肺脏膨隆，颜色红，前胃黏膜表面粗糙；3F003濒死11前胃黏膜表面粗糙，白色，肺脏局灶棕色3F009死亡11自溶3M002死亡14膀胱膨大，内充盈暗红色液体；肺脏颜色局灶暗红；膨隆；胸骨畸形（剑状软骨处向胸腔弯曲）；舌腹侧一凹陷，直径约3mm；眼球混浊，局灶白色；3F004死亡14自溶3F005死亡14胸腺小；脾脏小；肝脏黄；肺脏颜色灰白，可见多灶白色点状灶；胃（前胃）黏膜表面粗糙；眼球混浊，局灶白色；3F006死亡14眼球混浊，局灶白色；肺脏颜色暗红；膨隆；3F007死亡14自溶3M001濒死15膀胱膨大，局灶颜色暗红；精囊小，前列腺小，胸腺小，眼球浑浊，颜色白3M008死亡17肺脏局灶颜色暗红3M004死亡19肝脏颜色黄3M007死亡25肺脏颜色暗红3M006死亡26肺脏左侧叶颜色暗红，右侧叶颜色红；眼球混浊，局灶颜色颜色白；肾脏多灶白色点状灶呈条索状分布。3.7计划解剖动物大体解剖观察给药期结束，3M003、2M001、2F001肝脏大，颜色黄。除此之外，所有动物大体解剖未见明显异常。4.讨论本试验条件下，CTIY08高剂量组雌性动物于D2~D99/9发现死亡或濒死，雄性动物于D6~D117/9发现死亡，死前可见步态异常、活动减少、异常头部移动、角膜浑浊、俯卧、倾斜、腹部膨胀、后肢瘫痪、身体发冷、被毛污染、眼分泌物、流涎等症状；CTIY08中剂量组雌性动物于D8~D149/9发现死亡或濒死，雄性动物于D10~D267/9发现死亡或濒死，死前可见步态异常、活动减少、异常头部移动、角膜浑浊、俯卧、腹部膨胀、后肢瘫痪、背部弓起、垫脚走路、倾斜、身体发冷、消瘦、粘膜颜色异常、肿胀、肛周污秽、被毛污染、眼分泌物、鼻分泌物、粪便异常、流涎、尿液变色等症状。CTIY08中剂量组存活的一只主试验组雄性动物D4开始可见步态异常、活动减少、异常头部移动、腹部膨胀等症状；CTIY08低剂量组主试验组所有动物D15开始均可见腹部膨胀。以上结果表明，≥100mg/kg剂量下CTIY08对神经系统、消化系统、眼部有一定影响；≥30mg/kg剂量下CTIY08对消化系统有一定影响。本试验条件下，CTIY08各剂量组D3开始体重显著升高或有一定升高趋势，直至给药期结束。非计划死亡动物死前体重有一定下降趋势。CTIY08各剂量组D7开始摄食量有一定增加趋势。当笼中有动物出现非计划死亡时，该笼动物摄食量有下降趋势。以上结果表明，≥30mg/kg剂量下可使动物体重、摄食量显著增加或有一定增加趋势。本试验条件下，非计划死亡动物血液学指标可见WBC、#NEUT、%NEUT、#BASO、%BASO、#MONO、%MONO、PLT升高，红系相关指标（RBC、HCT、HGB、MCH、MCHC）降低，#LYMPH、%LYMPH、#EOS、%EOS、#RETIC、%RETIC降低。计划解剖动物血液学指标可见CTIY08中剂量组WBC、#NEUT、%NEUT、#MONO、%MONO、#EOS、%EOS、PLT、#RETIC、%RETIC轻微升高，%LYMPH轻微降低。CTIY08低剂量组雄性动物MCH、MCV、WBC、#NEUT、%NEUT、#MONO、%MONO、PLT轻微升高，%LYMPH轻微降低。以上结果表明，药物对动物粒系和红系有影响。本试验条件下，非计划解剖动物凝血指标可见TT降低、FIB升高。由于动物处于濒死状态，凝血指标的变化仅供参考。但计划解剖动物凝血指标仍可见CTIY08低剂量组雌性动物PT延长、TT降低，结果显示，供试品对动物凝血功能可能存在影响，且对雌性动物影响较重。本试验条件下，非计划死亡动物大体观察可见心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、胸骨、舌、眼球、胃黏膜、大肠（结肠）、睾丸、附睾、膀胱、精囊、前列腺等异常。计划解剖动物可见CTIY08中剂量组存活雄性动物肝脏异常；CTIY08低剂量组2/6肝脏异常。以上结