苜蓿精制多糖结构研究

苜蓿精制多糖结构研究苜蓿精制多糖结构研究摘要：本文采用的是用水提醇沉法提取的苜蓿多糖，然后对所得苜蓿多糖进行结构解析。水提醇沉得到的多糖、蛋白质混合溶液，用Sevage法除去蛋白质得到多糖溶液，再经过DEAE纤维素柱把多糖溶液中的酸性多糖与中性多糖分离开。本实验使用的就是此法中得到的中性多糖完成的，把中性粗多糖经过葡聚糖凝胶柱G-75进行分离，得到均一的苜蓿多糖；再把此时均一的苜蓿多糖进行浓缩纯化得到浓度较高的均一苜蓿多糖，最后对这个纯化后的苜蓿多糖进行结构分析。结构分析时采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）进行分子量测定；得到苜蓿多糖的分子量后用水解、衍生联合高效液相色谱法（HPLC）进行多糖中单糖组分测定；再用红外光谱法分析苜蓿多糖的结构；用甲基化分析偶联GC-MS法分析多糖中糖苷键的构型；用核磁共振波谱法检测来佐证多糖中糖苷键的构型。通过用葡聚糖凝胶G-75分离再纯化后得到的多糖大约有100mg；高效凝胶渗透色谱法做出标准曲线再带入苜蓿多糖的测量值测出苜蓿多糖的分子量为9.01×104kDa；测量其单糖结构时先用三氟乙酸把苜蓿多糖水解为单糖再用PMP进行衍生，最终测得其单糖组分为甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖；用红外光谱法测到的图谱与标准图谱进行比对得到苜蓿多糖中含有羟基（-OH），并且知道多糖内有糖环结构，具有α型糖苷键与β型糖苷键；还有甲基化结果与核磁的结果关键字：苜蓿多糖；纯化；结构分析；构型StudyonthestructureofrefinedAlfalfaPolysaccharideAbstract:Inthispaper,thealfalfapolysaccharidewasextractedbywaterextractionandalcoholprecipitation,andthenthestructureoftheobtainedpolysaccharidewasanalyzed.ThemixedsolutionofpolysaccharideandproteinobtainedbywaterextractionandalcoholprecipitationwasusedtoremovetheproteinbySevagemethodtoobtainthepolysaccharidesolution,andthentheacidicpolysaccharideandneutralpolysaccharideinthepolysaccharidesolutionwereseparatedbyDEAEcellulosecolumn.Inthisexperiment,neutralpolysaccharidesobtainedfromthismethodwereusedtoseparateneutralcrudepolysaccharidesbySephadexcolumnG-75,anduniformAlfalfaPolysaccharideswereobtained.ThenuniformAlfalfaPolysaccharidewasconcentratedandpurifiedtoobtainhigherconcentrationofAlfalfaPolysaccharide.Inthestructuralanalysis,themolecularweightwasdeterminedbyhighperformancegelpermeationchromatography(HPGPC).AfterobtainingthemolecularweightofAlfalfaPolysaccharides,themonosaccharidecomponentsinpolysaccharidesweredeterminedbyhydrolysisandderivatizationcombinedwithhighperformanceliquidchromatography(HPLC).ThestructureofAlfalfaPolysaccharideswasanalyzedbyinfraredspectroscopy.TheconfigurationofglycosidicbondsinpolysaccharideswasanalyzedbymethylationanalysiscoupledwithGC-MS,andNMRspectroscopywasused.Toconfirmtheconfigurationofglycosidebondinpolysaccharide.ThepolysaccharideobtainedfromSephadexgelG-75waspurifiedby100mg.Thestandardcurvewasobtainedbyhighperformancegelpermeationchromatography,andthemeasuredvalueofAlfalfaPolysaccharidewasmeasured.ThemolecularweightofAlfalfaPolysaccharidewas9.01*104.KDa;whenthemonosaccharidestructurewasmeasured,thealfalfapolysaccharidewashydrolyzedtomonosaccharidebytrifluoroaceticacidandthenderivatedbyPMP,andthemonosaccharidecomponentwasdeterminedtobemannose,glucose,galactoseandxylose;thespectrummeasuredbyinfraredspectrummethodwascomparedwiththestandardspectrumtoobtainthattherewashydroxyl(-OH)intheAlfalfaPolysaccharide,anditwasknownthattherewassugarringstructureinthepolysaccharide,withα-glucosidebondandβ-typeglucosidebondGlycosidicbond.目录TOC\o"1-3"\h\u18054摘要 211288Abstract 229939第一章文献综述 4294671.1：引言 4241061.2.概述（里面的参考文献来自开题报告） 5238961.2.1苜蓿 530561.2.2苜蓿多糖 6297431.3.化学分析法 6138401.3.1水解法 6154911.3.2高碘酸氧化法 6207601.3.3Smith降解法 7140731.3.4甲基化分析 720891.3.5单糖组成分析 77891.4.酶解法 887151.5.仪器分析法 8175171.5.1高效液相色谱法(HPLC) 851581.5.2气相—质谱联用仪 987811.5.3紫外光谱分析 9230621.5.4红外光谱分析 9157301.5.5核磁共振波谱 107912第二章分离纯化 1053342.1实验材料与试剂设备 10279802.1.1实验材料 10229422.1.2实验试剂及仪器 1115922.2实验方法 11296062.2.1苜蓿粗多糖的分离 11148082.2.1苜蓿多糖的纯化 12172172.3实验结果与数据分析 12155452.3.1苜蓿粗多糖的分离结果与分析 12210312.3.2苜蓿多糖的纯化结果与分析 13913第三章结构分析 14298623.1实验材料与试剂设备 14169223.1.1实验材料 1496203.1.2实验试剂及仪器 14199193.2实验方法 16313813.2.1分子量的测定 16275363.2.2单糖组成的测定 16152703.2.3甲基化、GC-MS分析 1719173.2.4红外光谱分析 17164123.2.5核磁共振分析分析 1842283.3实验结果与数据分析 1811373.3.1红外光谱分析结果 18157283.3.2单糖组成的结果分析 19183203.3.3分子量测定结果与分析 2028553参考文献： 21第一章文献综述1.1：引言多糖、脂质、核酸、蛋白质是构成生命物质最基本的4种物质。天然多糖作为4种构成生命最基本的物质之一，在自然界中来源广泛，目前已经发现多糖具有许多的生物活性，例如：调节机体免疫力、降糖降脂、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、美白，抗辐射等等，还具备强高黏度性、乳化性、吸水性和成膜性等理化特性，凭借其无毒无害，生物活性好，来源广泛等优势越来越受到人们的青睐[1]。因此，多糖具有很大的研究价值。多糖结构复杂，它是由10个及以上相同种类或不同种类的单糖由α-或β-糖苷键组成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式(C6H10O5)n表示。多糖可以形成直链结构也可以形成支链结构，相对分子质量从几万到几千万不等。科学认识多糖结构有利于深入研究其生物活性功能，多糖结构可分为一级结构和二级、三级等高级结构[2]。现目前阶段对多糖的结构研究都集中在一级结构的研究上，一级结构研究的对象是糖链中糖苷键的类型、连接位置和连接顺序，同时也包括单糖组成、相对分子质量等一些基本的物理和化学分析[3]。目前人们对多糖一级结构的解析主要包含以下信息：分子量、单糖组成、异头碳的构型、糖苷键种类以及构型、糖残基间的连接顺序、糖残基上羟基被取代的情况、主链和支链的连接位置及支链的长度[4]。多糖的结构分析方法有很多，但由于多糖分子结构十分复杂，使用单一分析方法并不能准确解析多糖结构，往往需要联合使用多种分析方法和手段。对一级结构的分析常用的方法化学法、酶解法、仪器分析法[5]。1.2.概述（里面的参考文献来自开题报告）1.2.1苜蓿苜蓿是对苜蓿属植物的统称，属于豆科植物，它的长得像三叶草，适应多种环境生存，耐干旱和冷热，有一年生与多年生之分。苜蓿的初生根能深入地下，具有保护水土流失的作用。生长20年以上的苜蓿，则主根可深达15公尺以上，因此苜蓿对干旱的耐受能力极强。常见这种情况：新栽种的苜蓿能耐受严重的夏天干旱得以生存，而其它根系较浅、分支较多的豆科植物因不耐干旱而死亡。苜蓿的生长能力十分旺盛，收割之后在适宜条件下又能迅速生长，每个生长季可收割1次到10次，因为它的生长十分迅速和营养价值高，在国内紫花苜蓿以“牧草之王”著称[3]，苜蓿牧草里面含约16%的蛋白质及8%的矿物质又富含维生素A、E、D及K并且口感上佳，十分受牲畜的喜爱[4]。苜蓿中的苜蓿多糖（APS）是价值最高的成分，苜蓿多糖通常经过提取和分离之后用于保健食品和入药。国外也在开展研究苜蓿多糖的作用，研究其与免疫活性物质之间的关系。1.2.2苜蓿多糖苜蓿之所以能用做中草药，是因为它体内的苜蓿多糖。早在很久以前植物多糖的药用保健作用就备受人们的关注，紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上栽培面积最广的豆科牧草之一，具有抗寒、抗旱、耐瘠薄、抗风沙等特点。Zhangchen等人对苜蓿多糖APS(alfalfapolysaccharides)是从苜蓿中提取的植物多糖，由岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸（GlcA）组成，他们的比例为2.6:8.0:4.7:21.3:3.2:1.0:74.2:14.9。研究表明，苜蓿多糖具有体外增强PHA、ConA、LPS和PWM诱导的淋巴细胞的增殖反应，还具有凝结\t"/item/%E8%8B%9C%E8%93%BF/_blank"血管功能的疗法、缓解肠道痉挛、清内热、增强免疫功能和抗感染的作用。1.3.化学分析法1.3.1水解法 水解法一般是在酸性条件下进行，不同的酸性条件可以使多糖水解一部分或者完全水解。完全酸水解是利用多糖在强酸和高温条件下糖苷键会遭到破坏的性质，从而糖苷键全部水解断裂多糖变成单糖，单糖组分分析前都要进行完全水解才可以[7]。部分酸水解是利用弱酸将多糖的部分糖苷键水解，一般部分酸水解会使多糖的支链糖苷键发生断裂，而主链不易断裂，可获得不同分子量大小的多糖片段。水解反应产物聚合度的影响因素是反应时间和酸的浓度[8]。PeipeiWang[9]将从褐藻糖胶中提取出的高分支多糖利用部分酸水解和ES-CID-MS/MS分析得出含有→4GlcA1,2Man→重复单元。1.3.2高碘酸氧化法 高碘酸能让糖分子上连的三羟基或二羟基断裂而产生甲醛或多糖醛。反应过程完全定量进行，即ｎ个碳碳键的断开同时需要消耗ｎ分子量的高碘酸，通过对释放甲酸的量、消耗高碘酸的量的测定就可得到直链多糖聚合度、糖甘键位置、分支多糖的分支数等相关的结论[10]。肖潮勇等人[11]就运用此法对蒲公英多糖进行了结构分析，他们用将12.5mL30mmol.L-1的NaIO4溶液与25mg的蒲公英多糖进行混合，遮光环境中反应后在223nm波长处检测其吸光度，建立标准曲线，最后测得高碘酸耗量与己糖的摩尔比分别为0.53：1和0.51：1，这就证明了蒲公英多糖结构中可能有1→2、1→2/6、1→4、1→4/6等键的存在。1.3.3Smith降解法 Smith降解法是把高碘酸氧化的产物经还原后将其酸水解或部分酸水解，通过鉴定水解产物推断出糖苷键的位置等[12]。郑杰等人用经高氯酸氧化多糖得到的多糖醛，先用硼氢化钠80mg用于还原，再用醋酸溶液调节溶液pH为7，然后分别加入盐酸羟胺和吡啶10mg和0.5mL，吹干后加入1mL三氯甲烷进行气相色谱分析。1.3.4甲基化分析 甲基化是阐明多糖糖苷键连接方式的一种有效方法[13]，用来测量多糖中所含的单糖数目以及糖苷键类型。它是将游离羟基全部甲基化后再衍生化，通过GC-MS（气-质联用色谱）定性、定量分析测出结果。甲基化分析的主要步骤就是1)样品的甲基化→2)水解及还原→3)乙酰化→4)GC-MS色谱分析[14]。王亚涛[15]等人多糖经过甲基化后，测定其红外图谱，在3100-3600cm-1间的羟基吸收峰消失表明多糖已经完全甲基化。测出了灵芝孢子粉中3种多糖都由6种不同的糖残基组成。宋苗苗等人[16]用甲基化分析法测得榴莲皮多糖结果表明→6,2)-D-Man-(1→是主要的糖残基，占总糖残基的22.89%；半乳糖糖残基中10.6%以1,2,6连接的糖苷键形式存在；葡萄糖残基中4.19%以1,4,6糖苷键连接的形式存在。1.3.5单糖组成分析研究多糖结构首先要研究多糖的单糖组成[17]。任何大分子物质都是由小分子物质按一定的规律聚集起来的，单糖的种类众多，常见的单糖有葡萄糖、岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖以及甘露糖等[18]。要想研究一个多糖必须先从它的单糖组成入手，在了解了单糖组成的基础上再对单糖间的连接方式、顺序等进行进一步的研究。陈贝贝等人[19]采用水解及其产物的硅胶薄层层析法、水解及其产物的GC-MS分析法水解联合硅胶薄层色谱法是把多糖样品酸水解后的产物放在展开剂中进行展开，再与对照标准品在硅胶薄层色谱中的结果进行对比得出水解单糖的种类；水解联合GC-MS分析法是将水解产物与3mg内标物和10mg盐酸羟胺均匀混合，加入吡啶1.5mL，置于90℃水浴加热并振荡反应30min，生成糖肟。取出反应物冷却至室温，加入2mL醋酸酐，90℃水浴加热反应45min进行乙酰化，即生成糖腈乙酸酯衍生物溶液。向反应产物中反复加入二氯甲烷(2mL×3)进行减压蒸干，最终溶于1mL氯仿溶液，即可进行GC-MS分析。高效液相色谱法(HPLC)是目前测量单糖成分的主要方法，这个方法的优点是该方法的灵敏度高、分离效果好，线性范围宽、检出限低，精密度、重复性、稳定性和回收率良好，操作简便，结果稳定可靠。黄小兰、朱照武等人[20]采用了高效液相色谱法对地参多糖进行了单糖组分进行主成分分析，在249nm下检测吸收度，建立了高效液相色谱—二极管阵列检测器(HPLC—PDA)检测，通过对每个数据进行标准偏差分析得到了地参多糖由8种单糖成分组成，8种单糖组分的平均物质的量比为半乳糖醛酸：甘露糖：鼠李糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：阿拉伯糖：岩藻糖：半乳糖=5.15：1.00：0.60：0.54：266.53：4.12：1.05：890.11。此外，ZhangChen等人[21]使用了离子色谱（IC）分析法对苜蓿多糖（APS）进行了单糖成分研究，并测出了APS由岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸（GalA）和葡萄糖醛酸（GlcA）组成，他们的比例为2.6：8.0：4.7：21.3：3.2：1.0：74.2：14.9。1.4.酶解法酶解法是通过特异性酶对不同的糖苷键进行降解，得到寡糖片段，再用色谱-质谱对寡糖片段进行更好的分析的方法，因为酶具有特异性和高效性，这个方法的酶解效率很高。常用的酶有α-阿拉伯糖苷酶、α-1,5-阿拉伯内切酶、β-半乳糖苷酶以及β-1,4-半乳糖内切酶等。周晓欢等人[22]使用果胶酶酶解知母多糖，再联合凝胶柱层析分级和甲基化法对酶解产物进行分析，最后得出知母多糖可能含有较多高度分支的α-1,5-Arabinan和一部分β-1,4-Galactan，可能含有AG-I型侧链和少量的AG-II型侧链。1.5.仪器分析法1.5.1高效液相色谱法(HPLC) 高效液相色谱法是用来检测物质浓度的好方法[23]。依据组分间的相对速度，样品经过分离柱之后对样品进行有序分离，再通过检测器，检测特定的结构以达到定性分析的目的。然后再通过数据处理器，对样品经过分离柱所产生的峰高进行分析，得到相应组分的浓度以达到定量分析的目的。低聚果糖通常会用HPLC法进行测定，但因HPLC中的紫外检测器对紫外吸收弱的物质反应不灵敏，而低聚果糖的紫外吸收很弱，因此低聚果糖不能用紫外检测器，而一般采用的是MS检测器[24,25]。郑杰等人就是通过HPLC—MS法对刺糖中蔗果三糖进行了定性与定量分析。目前，最常用的色谱方法是凝胶色谱法和高效液相色谱法,这两种方法都是以己知分子量的标准多糖作对照来测定待测多糖的分子量[26]。康雨芳[27]等人采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)分析方法，以不同分子量的葡聚糖为标准品，绘制的标准曲线。根据葡聚糖标准曲线计算测出了胶红酵母胞外多糖的分子量为1.23×106Da.1.5.2气相—质谱联用仪 质谱分析是测量被测样品离子的质荷比来进行结构分析的一种方法。首先要把被测样品离子化，再利用不同离子的质荷比不同，从而在磁场或者电场中的运动行为不同而把不同离子分开得到质谱。把质谱图与标准离子的质谱图进行比对从而对样品进行定量和定性分析。当气相色谱仪与质谱仪联用时，以质谱仪作为它的检测器，这种组合的仪器就是气相色谱-质谱联用仪[28,29]。余新松等人[30]尝试了采用不同极性溶剂的分级萃取方法以及利用气-质和液-质测定技术相结合对灵芝孢子粉的萃取物中化学成分进行分析与鉴定。1.5.3紫外光谱分析 有的物质接收了能量之后可以使核外电子发生跃迁，在相应的检测器下就能检测到其发出的信号。利用这一原理，山珊等人[31]在280nm与260nm下对桔梗抗氧化多糖进行了扫描未发现有吸收峰，这就表明多糖里没有蛋白质与核酸的存在。雍潘[32]也在260nm与280nm处对多黄花精的多糖进行扫描，没有发现吸收峰证明无核酸和蛋白质的杂质，这就说明多糖溶液较为纯净，最后集中对多糖的结构进行研究。1.5.4红外光谱分析 多糖在红外光谱中有着特定的吸收，我们可以根据红外光谱中的特定吸收峰来初步推断多糖的结构，比如我们可以在图中知道的信息有：是否是多糖、是否含有糖醛酸、糖苷键构型是α-还是β-、硒的键合方式、糖环类型是吡喃糖环还是呋喃糖环等信息[33]。因此，赵楚华[34]等人就用红外光谱法对剑花多糖进行了分析，3356cm-1、2925cm-1和1605cm-1分别表示O-H伸缩振动峰、C-H振动吸收峰以及C=O结合水峰，是典型的糖类物质吸收峰，说明这三个样品都是糖类。在1042cm-1处左右有吸收峰，表明三者均含有吡喃糖环。三种纯化多糖在892cm-1处有吸收峰，说明均含有β构型糖苷键；样品在575cm-1处的吸收峰说明存在α构型糖苷键。1.5.5核磁共振波谱 核磁共振（NMR）是目前分析多糖结构的最有效手段之一，尤其是二维核磁共振的出现，使多糖的结构表征有了突破性的发展。NMR可以提供很多多糖结构相关的信息，如糖苷键异头异构形式，糖苷键连接顺序，糖环的类型等，用来检测多糖里面的一级微结构[35]。因此，吴少微等人[36]采用核磁共振波谱法对鸡骨草多糖进行了分析，先把鸡骨草多糖制成样品，再用0.6mLD2O充分溶解在核磁管中进行核磁共振分析，分别在δ4.396ppm、δ4.262ppm、δ4.095ppm、δ5.05ppm和δ5.21ppm处出现异头氢的信号，表明鸡骨草多糖AP-ACl-3II的糖苷键至少存在两种α-连接方式和三种β-连接方式。δ1.211-δ1.328ppm处较强的信号归属于鼠李糖残基C6上CH3质子的共振峰。δ5.15ppm和δ5.12ppm分别归属于1,5-α-阿拉伯糖残基和T-阿拉伯糖残基的异头氢。第二章分离纯化2.1实验材料与试剂设备2.1.1实验材料分离纯化所用的材料是苜蓿粗多糖溶液，先水提醇沉得到混合的多糖、蛋白溶液，再用sevage[氯仿:正丁醇=5:1(v/v）]除去蛋白后经过DETE纤维素柱粗分离后，得到的粗多糖溶液。就对这个粗多糖溶液进行分离与纯化。2.1.2实验试剂及仪器主要仪器见表3-1仪器名称型号生产厂家凝胶柱（1m）G-75上海沪西仪器厂有限公司旋转蒸发仪RE-2000上海亚荣生化仪器厂多用真空泵SHB-Ⅲ郑州长城科工贸有限公司紫外可见分光光度计WFZUV-2100尤尼柯（上海）仪器有限公司铁架台圆底烧瓶主要试剂见表3-2试剂名称型号生产厂家苯酚浓硫酸乙醇蒸馏水葡聚糖凝胶SephadexG-75冷冻干燥仪2.2实验方法2.2.1苜蓿粗多糖的分离①放置好铁架台把凝胶柱（1m）垂直固定好，接好恒流泵。②打开恒流泵，在凝胶柱中加入1/4的蒸馏水，装凝胶柱，注意要一次性装柱，不能使床层出现气泡、断层、龟裂等现象。③用水做洗脱液洗脱两个床层体积后开始上样，上样体积为7ml，然后收集流出液。④取每管流出液1ml加入9ml蒸馏水稀释，再加入1ml苯酚，3ml硫酸，然后用紫外分光光度计测量其在490nm处的吸光度。⑤根据吸光度的不同对流出液分类，重复上述分离操作三次，即把多糖进行了分离。2.2.1苜蓿多糖的纯化①根据分离后的吸光度不同，把上述三次得到的三个峰分别对应的流出液融合于圆底烧瓶中。②把含流出液的圆底烧瓶用旋转蒸发仪蒸馏至5-10ml。③把最后得到的蒸馏液放在蒸发皿中，在冷冻条件下结成冰。④把结成冰的样品用冷冻干燥仪进行冷冻干燥，这样就得到纯化的均一苜蓿多糖。2.3实验结果与数据分析2.3.1苜蓿粗多糖的分离结果与分析图3-1紫外可见分光光度计测流出液的吸光度通过紫外可见分光光度法测得的三次流出液吸光度值如图3-2、3-3、3-4：图3-2图3-3图3-4通过三次的收集与对苜蓿多糖流出液的吸光值作图得到了以上三组数据，在三组数据里面都可以看出含有三组不同的峰。个别图中含有少量的杂峰，可能是由于含有少量的杂质而引起的，但并不会影响主要几种多糖的吸光度值，所以可以忽略小峰不计。三组不同的峰表示苜蓿粗多糖中含有三种不同的均一多糖。这是一次成功的分离，通过利用不同分子量的大分子糖类物质经过葡聚糖凝胶柱的速率不同，把苜蓿粗多糖中的混合多糖成功分离开来，并得到其吸光度值，为下一步多糖的纯化奠定了良好的基础。2.3.2苜蓿多糖的纯化结果与分析通过对苜蓿多糖的合并，干燥得到下图的苜蓿多糖：在上述操作下得到的吸光度峰的前提下，选择各个峰顶与紧挨峰顶左右两边的吸光度值所对应的苜蓿多糖流出液进行合并，然后置于旋转蒸发仪中浓缩提纯到5mL，浓缩过程中要注意避免液体喷出，最后采用冷冻干燥法冻干。从冻干的情况可以看出，培养皿中的水分已经蒸发，只剩下多糖还残留在骨架中，此时得到的多糖就是我们提纯后要进行结构分析的多糖，每个培养皿分离纯化后得到的均一苜蓿多糖大约有50mg左右。第三章结构分析3.1实验材料与试剂设备3.1.1实验材料这次实验所用的多糖材料是由分离纯化得到的均一苜蓿多糖。先把新鲜苜蓿晒干后用粉碎机粉碎制成苜蓿粉末，用水提醇沉法提取多糖、Sevage法脱蛋白，经过两次DETE-52纤维素柱后冻干后得到混合的苜蓿粗多糖。苜蓿粗多糖经一次SephadexG-75柱（葡聚糖凝胶柱）分离最后得到均一的苜蓿多糖。就对这个苜蓿多糖进行结构分析。3.1.2实验试剂及仪器仪器名称型号生产厂家电子静水天平MP51001J上海舜宇恒平科学仪器有限公司超声波清洗机SB-5200DT宁波新芝生物科技股份有限公司旋转蒸发仪RE-2000上海亚荣生化仪器厂电热恒温水浴锅DK-S26型上海森信实验仪器有限公司红外压片机YP-15中世沃克（天津）科技发展股份有限公司GC-MS气质联用色谱仪TraceFinder赛默飞世尔科技（中国）有限公司红外色谱仪FTIR-7600天津港东科技发展股份有限公司核磁共振波谱仪Agilent600MHzDD2苏州纽迈分析仪器股份有限公司HPLC高效液相色谱Agilent1260谱质分析检测技术（上海）有限公司主要仪器见表3-1主要试剂见表3-2试剂名称级别生产厂家氯化钠分析纯AR国药集团化学试剂有限公司三氟乙酸（TFA）分析纯AR国药集团化学试剂有限公司氢氧化钠分析纯AR国药集团化学试剂有限公司PMP分析纯AR国药集团化学试剂有限公司甲醇分析纯AR国药集团化学试剂有限公司盐酸分析纯AR国药集团化学试剂有限公司三氯甲烷分析纯AR国药集团化学试剂有限公司乙腈分析纯AR国药集团化学试剂有限公司磷酸氢二钠分析纯AR国药集团化学试剂有限公司磷酸二氢钠分析纯AR国药集团化学试剂有限公司DMSO分析纯AR上海申翔化学试剂有限公司碘甲烷分析纯AR国药集团化学试剂有限公司氯仿分析纯AR国药集团化学试剂有限公司硫酸钠分析纯AR国药集团化学试剂有限公司硫代硫酸钠分析纯AR国药集团化学试剂有限公司硼酸氢钠分析纯AR国药集团化学试剂有限公司冰乙酸分析纯AR江苏彤晟化学试剂有限公司硼酸分析纯AR国药集团化学试剂有限公司吡啶分析纯AR国药集团化学试剂有限公司乙酸酐分析纯AR国药集团化学试剂有限公司二氯甲烷分析纯AR国药集团化学试剂有限公司氯化钾粉末分析纯AR国药集团化学试剂有限公司重水分析纯AR国药集团化学试剂有限公司氘代丙酮分析纯AR国药集团化学试剂有限公司3.2实验方法3.2.1分子量的测定①先选取6种不同分子量葡聚糖标准品，分子量分别为T5、T10、T20、T40、T70、T100，将其配置成2mg/mL的分子量标准样品溶液。②把配置好的各浓度葡聚糖标准溶液通过0.45μm的水系滤头过滤，得到滤液。③把各浓度的葡聚糖标准溶液通过凝胶柱的高效液相色谱进行分析，以标准样品分子量的对数值logMw作为纵坐标，洗脱体积作为横坐标得到标准样品分子量的分布曲线。（色谱条件：柱温30℃；流动相为超纯水；流速为0.5mL/min，进样量20μL；其中示差折光检测器检测条件为：灵敏度4，内温30℃。分析时间为30min。）④把苜蓿多糖制成2mg/mL的溶液在相同条件下进样，得到凝胶色谱图，以上述做法得到的标准曲线计算出苜蓿多糖分子量分布情况。3.2.2单糖组成的测定①苜蓿多糖的水解：取上述苜蓿多糖溶液1.0mL于顶空瓶中，加入2.0mol/L三氟乙酸（TFA）溶液2.0mL，迅速密封。110℃条件下水解5h，取出，冷却至室温，用5mol/LNaOH溶液调节PH至7.0，转移至5ml容量瓶中并定容至刻度，摇匀备用。②苜蓿单糖的衍生：分别取上述的单糖混合标准溶液及苜蓿多糖水解溶液200μL于10mL离心管中，加入0.5mol/LNaOH溶液200μL，混匀，再加入0.5mol/LPMP甲醇溶液500μL，混匀，在70℃水浴条件下衍生1h，取出，冷却至室温，加入0.5mol/LHCl溶液200μL，混匀，加入三氯甲烷1.0mL，涡旋1min，8000r/min冷冻离心5min，弃去下层液，重复3次，除掉多余的PMP溶液，取上清液定容至2mL，用0.22µm微孔滤膜过滤，即得。③将PMP衍生后的样品进行HPLC分析。设置色谱条件为：色谱柱：资生堂CAPCELLPAKC18柱（4.6mm×250mm，5μm）；检测波长：249nm；柱温：30℃；进样量：10µL；流速：1.0mL/min；流动相：A为乙腈，B为0.1mol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱程序为：时间/min（0→28→40→45→45.1→50）、流动相A/%（17→17→30→30→17→17）、流动相B/%（83→83→70→70→83→83），要一一对应。④获得苜蓿样品以及各种单糖标准品的液相图谱。3.2.3甲基化、GC-MS分析①溶解样品：取多糖样品20mg至三颈烧瓶中，加DMSO2mL，搅拌12h使样品完全溶解。②NaOH-DMSO的制备：NaOH80mg加入2mLDMSO让其尽可能完全溶解，充N2密封，持续搅拌12h，制成均一的NaOH-DMSO。③甲基化：取上述制备液，置于DMSO溶解的样品中N2密封，持续搅拌1h，加入CH3I1mL超声30min，再加入CH3I0.3mL，再次超声30min，加入CH3I的过程一定要慢。加4mol/L的Na2S2O3的水溶液1mL终止反应，此过程静置3-4h。反应液转移至具塞玻璃离心管中，添加氯仿1mL混旋，静置分层取氯仿层，重复上述操作4-5次，取所获得的氯仿液体合并，水洗4-5次并弃去水相。向氯仿溶液加入无水Na2SO4约20mg，取氯仿相50℃旋蒸浓缩至干，经红外鉴定其在3400cm-1处无特征吸收，证明其甲基化完全。④甲基化后样品的水解：取完全甲基化制备品，加2mol/LTFA（三氟乙酸）2mL，110℃控温3h，旋干，加入甲醇重复旋干4-5遍，直至无酸味存在。⑤甲基化后样品的还原：取水解后的多糖样品，加0.5mL0.05mol/LNaOH和5mgNaBH4，室温下反应2h，加冰乙酸至酸性，反复加甲醇旋干，除去硼酸和过量的冰乙酸。⑥甲基化后样品的乙酰化：取上述制备品，先加吡啶0.5mL，再添加乙酸酐0.5mL，N2密封，90℃水浴控温30min、取出温度降至室温、甲醇旋干重复4-5次，加入二氯甲烷2mL混匀，过滤⑦进行GC-MS分析。3.2.4红外光谱分析①称取干燥的KBr粉末0.5g，研钵中研磨10min，过筛（2μm）后压片，放入样品池中，扫描获得背景谱图，并保存。②称取2mg的样品，加入干燥的KBr粉末0.5g，在研钵中研磨10min，过筛（2μm）后压片，然后在波数为4000-400cm-1的范围中，仪器分辨率：2cm-1，多次扫描得样品图谱。3.2.5核磁共振分析分析①称取60mg左右的多糖样品，置于真空干燥器中减压干燥48h，使样品完全干燥。②将干燥的多糖样品溶于3mLD2O中充分交换，进行氘代，室温下放置5h后冷冻干燥，反复进行3次。③最后将氘代后的样品溶于0.6mLD2O中，再转移至核磁管中进行核磁共振波谱分析。3.3实验结果与数据分析3.3.1红外光谱分析结果通过红外分光光度计测量的结果见下图3-1图3-1红外光谱分析苜蓿多糖峰2从图3-1我们可以看出，苜蓿多糖在3423.72cm-1处有吸收说明峰2对应的苜蓿多糖里含有-OH；2929.54cm-1有吸收说明多糖中含有烷烃类基团；1635.39cm-1处是游离羟基的羰基特征吸收峰；1409.42cm-1处有吸收峰也说明多糖含有向内的C-H伸缩振动，在1152.14、1083.76、1026.88cm-1三处有强烈的吸收峰表示多糖里面还有C-O-C的呋喃结构，应该属于环状的多糖自身形成的迷键；756.81cm-1处表示多糖内部含有β类型的糖苷键，579.98cm-1处表示多糖含有α型糖苷键。3.3.2单糖组成的结果分析由于在紫外检测下糖类物质没有紫外的特征吸收基团，所以不能被紫外检测器检测到，因此用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）对单糖进行衍生，使单糖带上能被紫外检测到的特征基团后再经过高效液相色谱仪进行检测。称取8种多糖各5mg做成混合的标准样品经过衍生后进行HPLC得到的结果如图3-1图中的缩写分别为：甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、葡糖糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc）、半乳糖(Gal）、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara）取苜蓿多糖的峰2进行衍生后得到的HPLC结果如图3-2苜蓿多糖经衍生化后的HPLC信号图可以看出在10~15和30~35左右存在强烈的吸收峰，并且在40分钟之后便没有信号吸收值，这说明苜蓿多糖里不含信号值在40分钟以后的单糖；在10~40之间除图上几个强吸收峰外并未出现其他强烈的吸收峰，这就表明10~40分钟里面并不含有除上图5种响应值之外的单糖。通过用苜蓿多糖的色谱图与混合标准样品的色谱图进行对照我们可以得出，此苜蓿多糖里含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖这几种单糖。3.3.3分子量测定结果与分析从图中可以看出只有一处峰，这就表明此苜蓿多糖是一个均一的多糖，具有比较高的纯度。通过用3.2.1中分子量测定的方法得到的标准曲线为logMw=-0.554T+9.27777其中R2=0.9968计算得到苜蓿多糖的分子量为9.01×104kDa。参考文献：[1]魏晶.三叶木通藤茎多糖的分离纯化、生物活性研究及其在护肤霜中的应用初探[D].江西农业大学,2019.[2]XinyanGe,WeiweiHuang,XiaoqiXu.Production,structure,andbioactivityofpolysaccharideisolatedfromTremellafuciformisXY[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2020,148:173-181.[3]刘玉峰,马海燕,李鲁盼等.天然活性多糖提取工艺及结构解析研究进展[J].辽宁大学学报(自然科学版),2018,45(02):154-161.[4]陈光静.方竹笋的加工废笋渣中多糖的分离纯化和结构解析及其生物活性研究[D].西南大学,2019.[5]孙赵龙.龙血树叶活性糖的分离纯化及结构解析[D].云南大学,2018.[6]吴梦琪,夏玮,徐志珍等.植物多糖的分离纯化、结构解析及生物活性研究进展[J].化学世界,2019,60(11):737-747.[7]CiliangGuo,ShihaiZhang,YeqingWang.IsolationandstructurecharacterizationofapolysaccharidefromCrataeguspinnatifidaanditsbioactivityongutmicrobiota[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2020:82-91.[8]杨金磊.马齿苋多糖的分离纯化及结构分析[D].东北师范大学,2019.[9]PeipeiWang,XiaoliangZhao,YoujingLv,etal.AnalysisofstructuralheterogeneityoffucoidanfromHizikiafusiformebyES-CID-MS/MS[J].CarbohydratePolymers,2012,90:602-607.[10]陈阳阳.石耳子实体多糖的分离纯化、结构解析及生物活性研究[D].南京农业大学,2015.[11]肖潮勇.蒲公英多糖结构及活性研究[D].佳木斯大学,2016.[12]EvelinaL.Zdorovenko,AlexandraA.Kadykova,AlexanderS.Shashkov.O-specificpolysaccharidesstructuresofPseudomonasstrainsisolatedfromthestrawberryleaves[J].CarbohydrateResearch,2020,489:10.1060/j.carres.2020.107932.[13]郑杰.刺糖多糖分离纯化、结构分析及降血糖作用研究[D].新疆医科大学,2016.[14]曹娟娟.香椿叶多糖的结构表征、理化性质及肝损伤保护作用研究[D].合肥工业大学,2019.[15]王亚涛.灵芝孢子粉多糖的分离纯化与结构鉴定[D].上海海洋大学,2017.[16]宋苗苗.榴莲皮多糖结构表征及抗凝血活性研究[D].河南大学,2019.[17]霍琛鑫,刘忠义,严开川等.多糖结构分析的研究进展[J].牡丹江医学院学报,2019,40(06):109-111.[18]汪紫薇.毛酸浆多糖的结构解析及体外活性研究[D].沈阳化工大学,2018.[19]陈贝贝.叶瓜参多糖成分结构和生物活性的初步研究[D].江西师范大学,2012.[20]朱照武,庄洋,向春林等.单糖柱前PMP衍生HPLC测定方法探讨[