3.1重组DNA技术的基本工具第2课时课件高二下学期生物人教版选择性必修3

怎样培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？

我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中常常会受到棉铃虫的侵袭，这会使棉花大量减产。大量施用农药不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染，如果能培育出自身能抵抗棉铃虫的棉花就能解决这个问题。

棉花本身不具有“杀虫基因”，而苏云金杆菌有一种“杀虫基因”，它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。基因重组②操作水平：③操作结果：①操作原理：DNA分子水平定向的改造生物遗传性状，获得人们所需的生物类型和生物产品人的胰岛素基因能通过拼接并在受体细胞大肠杆菌中表达出相同蛋白质--胰岛素的理论基础是？（1）大肠杆菌和人的遗传物质都是

。

（2）同一种基因在不同生物体内表达出来的蛋白质相同，因为

。（3）遗传信息的传递都遵循

。（4）

为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？

所有生物共用一套密码子基因工程DNA中心法则中心法则及其发展①基因是控制生物性状的独立遗传单位②遗传信息的传递都遵循中心法则③生物界共同一套遗传密码【例1】以下说法叙述符合基因工程概念的是 (

)A．在细胞内将DNA进行重组，赋予生物新的遗传特性B．将人的干扰素基因重组到质粒上后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后将其DNA整合到细菌DNA上B基因工程是在生物体外将DNA进行重组，赋予生物新的遗传特性，A项错误；B项符合基因工程的概念；C项属于诱变育种；D项外源基因导入细菌不是人为操作的，不属于基因工程的范畴。第3章基因工程重组DNA技术的基本工具01基因工程的基本操作程序02基因工程的应用03蛋白质工程的原理和应用041961年，尼伦伯格（M.W.Nirenberg,1927-2010)和马太（J.H.Matthaei，1929一）破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被成功破译。1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。1958年，梅塞尔森（M.Meselson,1930-)和斯塔尔（F.W.Stahl,1929-)用实验证明了DNA的半保留复制。随后不久，克里克提出中心法则。1953年，沃森（J.D.Watson,1928-)和克里克（F.Crick,1916-2004)建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。1950年，埃德曼（P.V.Edman,1916-1977)发明了一种测定氨基酸序列的方法。2年后，桑格（F.Sanger,1918-2013)首次完成了对胰岛素氨基酸序列的测定。1944年，艾弗里（O.Avery,1877-1955)等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。科技探索之路基因工程的诞生和发展11953195819441950196119671977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。1982年，第一个基因工程药物－重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA,导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。1972年，伯格（P.Berg,1926-)首先在体外进行了DNA改造的研究，成功地构建了第一个体外重组DNA分子。20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。1970年，科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）科技探索之路基因工程的诞生和发展21972197319701970S1977198221世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。2013年，华人科学家张锋（1982-)及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术－CRISPR(成簇规律间隔短回文重复）技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。1990年，人类基因组计划启动。2003年改计划的测序任务顺利完成1985年，穆里斯（K.Mullis,1944-2019)等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。1984年，我国科学家朱作言（1941-)领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。198519901983198421世纪以来2013科技探索之路基因工程的诞生和发展3从社会中来番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭，当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？环斑病毒的非转基因木瓜转基因木瓜

到社会中去工具分子手术刀分子缝合针分子运输车限制性内切核酸酶：DNA连接酶：载体：准确切割DNA分子将DNA片段连接起来将体外重组好的DNA分子导入受体细胞“工欲善其事必先利其器”“分子运输车”“分子手术刀”“分子缝合针”1、来源：主要从原核生物中分离纯化出来2、作用特点：具有专一性3、作用部位:特定切点上的磷酸二酯键①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。②能够切割特定序列中的特定位点。限制性核酸内切酶--“分子手术刀”磷酸二酯键切点一4.限制酶的识别序列的特点(1)EcoRI、SmaI限制酶的识别序列均为6个核苷酸(2)少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成(3)实例

大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ限制酶能特异性识别

_________序列，并切割___和___之间的____________。切割后产生__________。GAATTCGA磷酸二酯键黏性末端EcoRI限制酶5'5'5'5'3'3'3'3'黏性末端平末端SmaI限制酶只能识别

序列，切割

和

之间的

切开，切割后产生

。CCCGGGCG磷酸二酯键平末端SmaI限制酶你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？P71

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA?旁栏思考题?DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列,或者DNA

分子被修饰（甲基化），使限制酶不能将其切开限制酶名字的由来限制酶是如何命名的呢？是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌（Escherichiacoli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRI。例如：流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:HindIHindIIHindIIIDNA连接酶——“分子缝合针”2.分类：二将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，形成重组DNA分子。1.作用:类型来源功能相同点差别E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？P72DNA连接酶DNA连接酶ATAGTCCGAATT连接两个DNA片段DNA连接酶CAATTDNA聚合酶GAGTATCDNA聚合酶连接单个脱氧核苷酸形成单链DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象

作用结果 用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制3.DNA连接酶与DNA聚合酶的比较只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键补充：与DNA相关的五种酶的比较（大本P70）名称作用部位作用结果限制酶磷酸二酯键将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链根据所学知识，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA连接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶baA.切断a处的酶为_______

B.连接a处的酶为_______C.切断b处的酶为_______①③④②a：磷酸二酯键；b：氢键练习：【例1】下列关于DNA连接酶的叙述错误的是 (

) ①催化相同黏性末端的DNA片段之间的连接②催化不同黏性末端的DNA片段之间的连接③催化两个黏性末端互补碱基间氢键的形成④催化DNA分子两条链的脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键的形成A．①③

B．②④C．②③D．①④在DNA重组技术中，两个DNA片段间必须有相同的黏性末端，这样黏性末端的碱基才能通过氢键连接而互补配对，再由DNA连接酶连接双链DNA分子间的磷酸二酯键。C基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”三1.作用:①

．

②

．2.作为运载体需具备的条件:

3.种类将目的基因转移到受体细胞中去利用运载体在受体细胞内对目的基因进行大量复制①能够在宿主细胞中自我复制并稳定保存

②有1个至多个限制酶切点，以便与外源基因连接③具有标记基因，便于进行筛选④对受体细胞无害种类用途不同点质粒、噬菌体植物病毒动物病毒将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞将外源基因导入植物细胞将外源基因导入动物细胞来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别标记基因的作用是？4.最常用的载体——质粒:一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。DNA分子复制的起点，并带着插入的目的基因一起复制有一个或多个限制酶酶切位点标记基因用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞①抗生素的抗性基因②荧光蛋白基因最好回答：将含有目的基因的受体细胞筛选出来细菌和酵母菌5.其他载体噬菌体或动植物病毒作为运载体的原理是：病毒对宿主细胞的侵染具有一定的

性。利用病毒对宿主细胞的侵染性物种（组织）特异若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用

作为载体，其原因是

。噬菌体噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕霍乱弧菌中含有质粒，但

（填“能”、“不能”）用来做载体，因为选择的载体应该

。对受体细胞无害不能【例2】质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述不正确的是(

)A．质粒是不只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子B．在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点C．携带目的基因的重组质粒整合到宿主细胞的染色体DNA上会随后者的复制而复制D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择质粒不只分布于原核生物中，在真核生物——酵母菌细胞内也有分布，A正确；并不是所有的质粒都能找到限制酶的切割位点，从而成为合适的运载目的基因的工具，B错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合后复制，C正确；质粒上的抗性基因常作为标记基因，D正确。B（1）质粒与拟核中的DNA有哪些相同点：（至少写出两点）

①

。

②

。

③

。（2）质粒

（是/不是）一种细胞器。（3）细胞膜上的载体蛋白与基因工程中的载体的区别

①化学本质不同：细胞膜上的载体：

。基因工程中的载体可能是物质，如

；也可是生物，如

；也可是λ噬菌体的衍生物。

②功能不同：细胞膜上的载体功能是

;基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把

。化学本质和结构相同能够自我复制具有遗传效应或都能够指导蛋白质的合成等不是蛋白质质粒动植物病毒协助细胞膜控制物质进出细胞目的基因导入受体细胞【例3】辨析填空

5’-ATAGCATGCTATCCATG3’-TATCGTACGATAGGTACTTAAAATTCGGCATAC-3’GCCGTATG-5'目的基因5’-TCCTAG3’-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC-3’

GGTATG-5’重组DNA分子请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后,用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后,将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处,并用透明胶条将切口粘连起来。

5’-ATAGCATGCTATCCATG3’-TATCGTACGATAGGTACTTAAAATTCGGCATAC-3’GCCGTATG-5'GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”?剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。【典例1】图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。（1）上述操作中不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________和_____________。（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，__________________________________________________。目的基因抗性基因目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中【典例2】如图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线

用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是

（从“EcoRⅠ”、“BamHⅠ/HindⅢ”、“SmaⅠ/HindⅢ”中选择）．不能选择其他限制酶的理由分别是：

。

BamHⅠ/HindⅢ若选EcoRⅠ会破坏质粒的复制原点；若选SmaⅠ/HindⅢ，则构建的重组质粒没有标记基因或复制原点方法总结：---选择酶切位点的原则1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因、复制原点。某细菌质粒如图所示,通过标记基因可以推知外源基因插入的位置,图示中的a、b、c是外源基因插入位置,请根据表中提供的细菌生长情况,推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点,正确的一组是 (

)细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况细菌在含四环素的培养基上的生长状况①能生长能生长②能生长不能生长③不能生长能生长

【典例3】重组质粒的筛选（金榜P67）A.①是c;②是b;③是aB.①是a和b;②是a;③是bC.①是a和b;②是b;③是aD.①是c;②是a;③是bA

随着生物技术的飞速发展，生产和销售“分子工具”的公司大量涌现。感兴趣的话，你可以登录这些公司的网站，查询和了解相关产品的特点、价格和使用说明等。有些这样的公司已成功上市，你还可以通过分析公司的股票价格走势，大致了解公司的经营状况以及投资者目前对该行业的认可程度。提示：在调查中需要了解企业的生产技术、产品的种类和产量、销售渠道和销售情况等，这样才有可能对企业的经营状况进行正确的判断。2.实验原理：探究·实践·DNA的粗提取与鉴定（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。（3）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。00.14NaCI浓度（mol/L）DNA溶解度1.实验设计思路：四DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。探究·实践·DNA的粗提取与鉴定四

不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。3.选材：不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。你认为如下提供的材料中哪些不适合提取DNA？为什么？供选材料：（括号内为染色体条数）新鲜洋葱（16）、香蕉、菠菜（12）、菜花、猕猴桃（58）；猪肝（38）、鱼卵、鸡血（78）、哺乳动物的成熟红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌（1）探究·实践·DNA的粗提取与鉴定四4.试剂：①研磨液②体积分数为95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺试剂⑤蒸馏水——洗涤剂和食盐，加人洗涤剂的目的是溶解细胞膜、核膜，释放出细胞内含物。加人食盐的目的是使构成染色体的DNA和蛋白质加速解聚，游离出DNA分子，并使DNA充分溶解于浓NaCI溶液中——析出DNA——溶解DNA——鉴定DNA，要现配现用5.方法步骤析出DNADNA的鉴定研磨称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。过滤取上清液在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。或用离心的方法在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或用离心的方法取两支试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。注意事项1．以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。2.利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。3．加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA量就会减少。4．加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。5．预冷的酒精具有以下优点：①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。四

结果分析与评价1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？*观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。*二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；*如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。

结果分析与评价3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法；对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果；如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等；看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。

进一步探究

本实验只是对DNA进行了粗提取，请在阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿一异丙醇混合液(体积比为24:1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。DNA的粗提取与鉴定三.探究•实践刑侦破案拓展：DNA提取的应用基因组测序插入人胰岛素基因的大肠杆菌基因工程亲子鉴定四1.取一段长约2cm的去皮香蕉，剪碎置于玻璃杯中；2.加入10mL温水，2g食盐，5滴洗洁精，充分研磨；3.用双层纱布过滤研磨液，收集滤液；4.向滤液中加入2g嫩肉粉，混合均匀；5.将滤液置于55-60℃的水浴中加热5-10min；6.冷却，加入等体积、冷却的高度酒；7.静置2-3min，用玻璃棒（或筷子）挑取白色絮状析出物。参考方案“家庭版”DNA的粗提取

限制酶DNA连接酶载体①对受体细胞无害；②有一个至多个限制酶切割位点；③有特殊的标记基因；④能自我复制或能整合到宿主DNA上。质粒、噬菌体、动植物病毒小结基因工程的基本工具作为载