3.1重组DNA技术的基本工具课件-高二下学期生物人教版选择性必修3-1

第1节重组DNA技术的基本工具【本节聚焦】1、重组DNA技术所需的三种基本工具是什么?它们的作用分别是什么?2、基因工程载体需要具备什么条件?第3章基因工程基因的结构和功能1.基因与DNA的关系？2.基因的基本单位是什么？3.基因的功能？基因是有遗传效应的DNA片段CH2

HOHHHHH碱基

磷酸

5’4’3’2’1’脱氧核苷酸挖掘记忆储存、传递、表达遗传信息复制转录翻译DNARNA逆转录复制蛋白质第二组注射R型活细菌小鼠不死亡第一组小鼠死亡，分离出S型活细菌注射S型活细菌小鼠不死亡第三组注射加热致死的S型细菌小鼠死亡，分离出S型活细菌第四组R型活细菌+加热致死S型细菌R型活细菌转化为S型细菌

我国是棉花的生产和消费大国，但棉花种植中易受虫害，其中以棉铃虫最为主，可以使棉花产量减少三分之一，甚至绝收。抗虫基因转基因基因工程情境导入诱变育种？在原有基因上发生基因突变，产生新基因——等位基因不定向

苏云金杆菌中存在一种毒蛋白基因（Bt基因），编码出的毒蛋白能杀死害虫。

苏云金杆菌思考：如何培育出自身就能抵抗虫害的棉花呢?

若使用农药不仅会提高生产成本，还会造成农产品和环境污染。基因工程：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫

重组DNA技术1.操作环境：2.原理：3.操作对象：4.操作水平：5.结果：体外环境基因分子水平基因重组赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍6.意义：一、基因工程的理论基础

苏云金杆菌普通棉花(无抗虫特性)抗虫基因转入提取思考：

DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。如何获得抗虫棉?需要什么工具?剪下来的抗虫基因能否直接把它导入到棉花体内？不能。大多数生物会排斥外来的基因，若直接导入会被降解。一、基因工程的理论基础

苏云金杆菌普通棉花(无抗虫特性)抗虫基因转入提取思考：

DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。如何获得抗虫棉?需要什么工具?怎么做？“分子缝合针”“分子运输车”与载体DNA拼接，再导入抗虫棉【问题1】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？一、基因工程的理论基础①DNA分子的基本组成单位相同，都是4种脱氧核苷酸；②空间结构相同，都是规则的双螺旋结构。③都遵循碱基互补配对原则脱氧核糖含氮碱基磷酸DNA平面结构DNA立体结构一、基因工程的理论基础【问题2】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？①基因是控制生物性状的独立遗传单位。②遗传信息的传递都遵循中心法则。③生物界共用一套遗传密码。相同的遗传信息在不同生物体内表达出相同的蛋白质。

（二）分子手术刀---限制性内切核酸酶（限制酶）

1、来源：主要从原核生物中分离纯化来的3、特点:4、作用部位:特定切点上的磷酸二酯键

2、种类：约4000种能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。5'3'5'3'TAGGTATCCA磷酸二酯键专一性酵母菌、霉菌5.限制酶的识别序列思考：四种限制酶识别的特定序列有何特点？

大多数限制酶的识别序列由

组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。6个核苷酸特点1：都可以找到一条中心轴线；特点2：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的，称为回文序列。总结：能被限制酶所识别的序列一般都有回文序列（1）实例1——EcoRⅠ限制酶切割

*EcoRⅠ识别序列为GAATTC*EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键黏性末端黏性末端（2）实例2——SmaⅠ限制酶切割*SmaⅠ识别序列为CCCGGG*SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键平末端6.切割结果:DNA两条单链的切口处，伸出几个核苷酸，刚好能互补配对，这样的切口叫黏性末端。切口处是平整的，这样的切口叫平末端。

限制酶名字的由来EcoRⅠ属名Escherichia首字母种名coli前两个字母R型菌株从中分离的第一个限制酶例如：流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:HindIHindIIHindIII资料卡①别的限制酶都是识别GAATTC序列，并在G和A之间切开吗？②一条DNA片段，存在识别GAATTC序列和识别GATC序列酶的切割位点的概率相同吗？③同一特定序列能否有多种酶在此切断核苷酸连？能不是，酶具有专一性

【思考讨论】1/461/44【例】各限制酶的识别序列和切割位点如下,请写出限制酶切割形成的末端。SpeⅠ：

HindⅢ：

XbaⅠ：

EcoRV:XhoⅠ：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。（1）用EcoRI将目的基因(Bt基因)切割下来。黏性末端黏性末端目的基因(2)为获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切2个切口，断4个磷酸二酯键，产生4个黏性(平)末端。黏性末端黏性末端(3)如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？会产生相同的黏性(平)末端限制性内切酶与DNA解旋酶、DNA酶的区别知识联系

限制性核酸内切酶DNA解旋酶DNA酶(水解酶)（外切酶）区别

作用于特定的核苷酸序列的磷酸二酯键,切开脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，成片段作用于DNA两条链的之间的氢键的断裂，成单链切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸1．为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。2.在切割含目的基因的DNA分子时，限制性核酸内切酶要切割几个磷酸二酯键？为什么？4个。DNA分子为双链，且目的基因两端均含有限制性核酸内切酶的识别位点互补的粘性末端才能被连接（二）分子缝合针---DNA连接酶①作用②种类将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。类型来源功能相同点差别E.coliDNA连接酶T4

DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体能连黏性末端和平末端（效率低）只能连接黏性末端恢复磷酸二酯键旁栏思考（P72）：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？DNA聚合酶CAATTDNA聚合酶GAGTATCDNA聚合酶连接单个脱氧核苷酸形成单链DNA连接酶DNA连接酶ATAGTCCGAATT连接两个DNA片段【寻根问底】DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？DNA连接酶DNA聚合酶相同点不同点模板作用对象作用结果用途催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键不需要模板需要DNA的一条链为模板游离的DNA片段单个的脱氧核苷酸逐个连到片段末端（引物）形成完整的DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制根据所学知识，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA连接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶baA.切断a处的酶为_______

B.连接a处的酶为_______C.切断b处的酶为_______①③④②a：磷酸二酯键；b：氢键练习：知识延伸断裂连接氢键DNA复制：PCR技术：获取目的基因：磷酸二酯键基因工程中切开DNA片段：水解DNA：DNA复制时连接单体：RNA复制时连接单体：基因工程中连接DNA片段逆转录时连接单体：解旋酶高温自动断裂限制酶自动连接，不需要酶DNA水解酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA连接酶逆转录酶质粒、噬菌体、动植物病毒等

将外源基因送入受体细胞,

在受体细胞内对目的基因进行大量复制。

①作用②种类三、基因进入受体细胞的载体载体需要具备的条件：条件①：具有一个或多个限制酶切割位点；条件②：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。条件④：对受体细胞无害。问题3：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？问题2：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？问题1：载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？供外源基因插入其中使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等荧光蛋白基因，如:绿色荧光蛋白基因(GFP)28标记基因的筛选原理：载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。（据图请尝试描述筛选的过程）关键点拨培养基中有几种类型的大肠杆菌？什么样的大肠杆菌能够在该培养基上存活并繁殖？

由于用同种限制酶切割，会产生相同黏性末端，则可能导致目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接。目的基因与质粒反向连接HindIII和BamHI1.用图中外源DNA和质粒构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是

。2.使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶切割，而不用EcoRⅠ一种限制酶切割，是为了防止

。SmaⅠ会破坏抗性基因和外源DNA中的目的基因目的基因、质粒自身环化及反向连接下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？a、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；b、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因选择酶切位点的原则：图1图2实验：DNA的粗提取与鉴定1、实验原理DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。DNA不溶于酒精溶液但某些蛋白质溶于酒精初步分离DNA和蛋白质溶解DNA鉴定DNADNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱