Foxo1对自然调节性T细胞增殖与凋亡的调控机制探秘

Foxol对自然调节性T细胞增殖与凋亡

的调控机制探秘

一、绪论

1.1研究背景

在机体复杂的免疫系统中，自然调节性T细胞(naturalregulatory!cells,nTreg)作为一类

具有独特免疫调节功能的T细胞亚群，发挥着至关重要的作用。nTreg细胞主要来源于胸

腺，其标志性特征为表达转录因子Foxp3以及CD4、CD25等表面分子，占外周血中

CD4+T细胞总数的2%-10%。它就像是免疫系统的“刹车”，能够精准识别并抑制机体中过

度的免疫反应以及自身反应，从而维持免疫系统的内环境稳定，保证机体在有效抵御病原体入

侵的同时，避免对自身组织造成不必要的损伤。例如，在正常生理状态下，nTreg细胞可抑制

免疫系统对肠道内共生菌群的过度免疫反应，维持肠道微生态平衡。一旦nTreg细胞的数量

出现异常减少或者其功能发生障碍，免疫系统就如同失去了控制的“野马”，极易引发自身免疫

性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等，这些疾病会导致机体免疫系统错误地攻击自

身组织和器官，给患者带来极大的痛苦；还可能引发肿瘤等疾病，因为肿瘤的发生发展与机体

免疫监视功能的缺陷密切相关，而nTreg细胞功能失调会削弱免疫监视作用，使得肿瘤细胞

有机会逃脱免疫系统的识别和攻击。

nTreg细胞在机体内维持稳定的关键在于其增殖和凋亡过程的精细调控。增殖过程能够确保

nTreg细胞在面对免疫挑战时，数量得以增加，从而有效发挥免疫抑制功能。比如，在感染初

期，机体需要更多的nTreg细胞来抑制过度的免疫炎症反应，以保护组织器官免受损伤，此

时nTreg细胞的增殖就显得尤为重要。而凋亡过程则如同一个“质量控制”机制，能够及时清

除衰老、功能异常或过度活化的nTreg细胞，避免这些细胞对免疫系统产生负面影响.维持

nTreg细胞群体的质量和功能的稳定性。一旦nTreg细胞的增殖和凋亡调控失衡，就可能导

致其数量和功能的异常，进而打破免疫平衡，弓I发上述各类疾病。

Foxol(Forkheadbox01)作为常染色体显性遗传性疾病所致的红斑性狼疮(SLE)的候选

基因，近年来在T细胞相关研究领域备受关注。已有研究表明，Foxol在T细胞的增殖、分

化和免疫活化等过程中扮演着重要角色。它参与调节T细胞谷氨酰胺代谢，为T细胞的活化

和增殖提供必要的能量和物质基础；在抑制T细胞激活方面，Foxol可通过调控相关信号通

路，抑制T细胞表面活化标志物的表达，从而阻止T细胞过度活化；同时，Foxol还能促进

细胞死亡，在维持T细胞群体稳态中发挥作用。然而，尽管已有这些研究基础，Foxol在调

控nTreg细胞增殖和凋亡方面的作用机制仍然笼罩在迷雾之中，尚未被完全揭示。深入探究

Foxol参与调控nTreg细胞增殖和凋亡的分子及信号通路，不仅能够填补这一领域的知识空

白，深化我们对nTreg细胞生物学特性的理解，更有望为自身免疫疾病、肿瘤等疾病的研究

开辟新的道路，提供全新的实验思路和理论基础，具有极其重要的科学价值和临床意义。

1.2研究目的与意义

本研究旨在深入探究Foxol参与调控自然调节性T细胞(nTreg)增殖和凋亡的分子及信号

通路。具体而言，一方面，通过构建相关细胞模型和动物模型，运用基因编辑、细胞生物学、

分子生物学等多学科实验技术，明确Foxol在nTreg细胞增殖和凋亡过程中所扮演的角色，

揭示其是如何通过直接或间接的方式对nTreg细胞的这两个关键生理过程施加调控影响的。

另一方面，详细解析Foxol作用的下游分子靶点，以及这些靶点在介导Foxol对nTreg细胞

增殖和凋亡调控中所发挥的具体作用和相互之间的关联，从而绘制出一幅完整的Foxol调控

nTreg细胞增殖和凋亡的分子机制网络图谱。

nTreg细胞在维持机体免疫平衡和自身免疫耐受性方面发挥着不可替代的重要作用，其数量和

功能的稳定对于机体的健康至关重要。而Foxol作为在T细胞相关过程中具有关键作用的转

录因子，深入研究其对nTreg细胞增殖和凋亡的调控机制，具有多方面的重要意义。从基础

免疫学理论角度来看，这将报大地丰富我们对nTreg细胞生物学特性的认知，完善免疫系统

中细胞增殖与凋亡调控的理论体系，为后续更深入地研究免疫系统的精细调节机制奠定坚实的

基础。

在医学应用领域，本研究成果具有广阔的潜在应用价值。自身免疫性疾病，如系统性红斑狼

疮、类风湿性关节炎等，其发病机制与nTreg细胞的功能失调密切相关。明确Foxol对

nTreg细胞的调控机制，有望为这些自身免疫性疾病的治疗开辟全新的途径，为开发更加精

准、有效的治疗策略提供关键的理论依据。在肿瘤治疗方面，肿瘤的发生发展与机体免疫监视

功能的缺陷紧密相连，而nTreg细胞在免疫监视中发挥着重要作用。通过对Foxol调控

nTreg细胞机制的研究，有可能找到新的干预靶点，从而调节肿瘤微环境中的免疫平衡，增强

机体对肿瘤细胞的免疫监视和杀伤能力，为肿瘤的免疫治疗提供新的思路和方法。本研究还

可能为新型免疫调节药物的研发提供全新的靶点和方向，有助于开发出副作用更小、疗效更显

著的免疫调节药物，造福广大患者。

1.3国内外研究现状

自然调节性T细胞(nTreg)自被发现以来，一直是免疫学领域的研究热点。国外方面，早在

1995年，Sakaguchi等首次提出将CD25分子作为调节性T细胞的表面标志，开启了nTreg

细胞研究的大门。后续研究不断深入，明确了nTreg细胞来源于胸腺，占外周血中CD4+T

细胞总数的2%-10%,在维持机体免疫平衡和预防自身免疫疾病、移植排斥方面发挥着重要

作用，其主要通过细胞接触机制发挥抑制功能。在nTreg细胞的增殖与凋亡调控研究中，国

外学者利用基因编辑技术构建了多种基因敲除小鼠模型，发现多种信号通路如TGF-B信号通

路等参与其中，对nTreg细胞数量和功能的稳定起到关键作用。

国内在nTreg细胞研究领域也取得了显著成果。学者们聚焦于nTreg细胞在各类疾病中的作

用，发现其数量和功能异常与自身免疫性疾病、肿瘤等密切相关。例如，在系统性红斑狼疮患

者体内，nTreg细胞数量明显减少，功能受损，无法有效抑制自身免疫反应，导致病情进

展。在肿瘤微环境中，nTreg细胞的聚集会抑制机体的抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤的生长和

转移。国内研究团队通过细胞培养和动物实脸，对nTreg细胞的增殖和凋亡调控进行了探

索，发现一些细胞因子如IL-2、IL-10等对其增殖和凋亡有重要调节作用。

Foxol作为一个关键的转录因子，在国内外的研究中也备受关注。国外研究揭示了Foxol在

多种细胞过程中的重要作用，在T细胞中，它参与调节T细胞谷氨酰胺代谢，为T细胞的活

化和增殖提供能量支持；还能抑制T细胞激活，通过调控相关基因表达，阻止T细胞过度活

化，维持T细胞免疫平衡。在细胞凋亡方面，Foxol可通过上调促凋亡基因的表达，促进细

胞死亡，在细胞命运决定中发挥关键作用。

国内学者针对Foxol在不同疾病和细胞类型中的功能也开展了深入研究。在心血管疾病研究

中，发现Foxol通过调控心肌细胞的代谢和凋亡相关基因，影响心肌细胞的存活和功能。在

肿瘤研究领域，研究表明Foxol在某些肿瘤细胞中具有抑癌作用，可通过抑制肿瘤细胞的增

殖、诱导凋亡来发挥功能。

然而，在Foxol与nTreg细胞关系的研究方面，虽然国内外均有涉及，但仍存在明显不足。

目前已知Foxol在nTreg中起到了负向调节nTreg增殖、存活和功能的作用，且其路径与

PI3K/AkVmTOR和ERK等途径相互作用。但对于Foxol参与调控nTreg细胞增殖和凋亡的

具体分子及信号通路，尚未完全明确。已有的研究大多停留在初步探索阶段，缺乏系统性和深

入性。对于Foxol靶向下游分子对nTreg增殖和凋亡的调控作用，目前的研究还不够全面和

深入，许多关键问题仍有待解决。例如，Foxol与下游分子之间的具体调控网络如何构建，

这些分子在不同生理和病理条件下如何协同作用等，都需要进一步的研究来揭示。

1.4研究方法与创新点

在研究过程中，本研究将运用多种实验技术和方法，从多个层面深入探究Foxol参与调控自

然调节性T细胞(nTreg)增殖与凋亡的机制。

构建合适的小鼠模型是研究的重要基础。通过运用CD4-Cre/Foxo1fl/fl小鼠，建立Foxol特

异性敲除小鼠模型。借助流式细胞术，能够精确检测小鼠外周T细胞亚群(包括nTreg)分

布及数量的变化情况，从而直观地了解Foxol基因缺失对nTreg细胞在小鼠体内整体分布和

数量的影响，为后续深入研究提供重要的数据支持。

细胞实验也是不可或缺的环节。通过CCK8实验，能够准确检测nTreg细胞的增殖活性，清

晰地展现出Foxol在nTreg细胞增殖过程中的调控作用。而AnnexinV-FITC/PI双染法结合

流式细胞术，则可用于检测nTreg细胞的凋亡情况，深入剖析Foxol对nTreg细胞凋亡的调

控机制。在细胞培养过程中，添加不同的刺激因素，观察Foxol在不同条件下对nTreg细胞

增殖和凋亡的影响，有助于褐示其在复杂生理和病理环境中的作用机制。

分子生物学检测方法能够从基因和蛋白层面揭示Foxol调控nTreg细胞的分子机制。使用

qRT-PCR技术，可以检测Foxol基因在nTreg细胞中的表达水平，明确其在不同生理状态

下的表达变化。通过Westernblot技术，不仅能检测Foxol蛋白的表达量，还能探究其靶向

下游分子如Bim、p27、Cdk2等在nTreg增殖和凋亡调控中的作用，从而构建出Foxol调控

nTreg细胞的分子网络。

免疫荧光染色技术为研究提供了直观的细胞层面的证据。对小鼠淋巴结、脾脏等组织切片进行

Foxp3、Ki67、Caspase-3等相关标记的免疫荧光染色，能够在显微镜下直接观察nTreg增

殖和凋亡的变化，进一步验证和补充其他实验方法得到的结果，使研究结论更加可靠C

本研究在方法和思路上具有显著的创新之处。在多层面探究调控机制方面，不再局限于单一的

研究角度，而是综合运用小鼠模型、细胞实验、分子生物学检测和免疫荧光染色等多种技术，

从整体动物水平、细胞水平到分子水平，全方位、多层次地深入探究Foxol参与调控nTreg

细胞增殖和凋亡的机制，这种系统性的研究方法能够更全面、深入地揭示其内在机制，弥补了

以往研究在层面上的局限性。

在探索潜在治疗靶点方面，本研究通过深入解析Foxol调控nTreg细胞的分子机制，有望发

现新的潜在治疗靶点，为自身免疫疾病和肿瘤等疾病的治疗提供全新的思路和方法。与传统

的治疗靶点研究思路不同，本研究从nTreg细胞的增殖和凋亡调控这一独特角度出发.挖掘

Foxol及其相关分子通路在疾病治疗中的潜在价值，为开发新型免疫调节药物和治疗策略开

辟了新的方向，具有重要的创新性和临床应用前景。

二、自然调节性T细胞与Foxol概述

2.1自然调节性T细胞(nTreg)

2.1.1nTreg的定义与特征

自然调节性T细胞(nTreg)是调节性T细胞(Treg)中的一个重要亚群，在机体免疫系统中

扮演着不可或缺的角色。nTreg细胞主要在胸腺中发育成熟，随后迁移至外周免疫器官，如脾

脏、淋巴结等，在外周血中，nTreg细胞占CD4+T细胞总数的2%-10%。1995年，

Sakaguchi等学者首次将CD25分子作为调节性T细胞的表面标志，为nTreg细胞的研究奠

定了基础。随着研究的不断深入，目前公认的nTreg细胞的特异性表面标志物为

CD4+CD25+Foxp3+,同时其IL-7受体。链(CD127)呈低表达状态。

CD4分子是T细胞表面的重要标志物之一，它能够与MHCD类分子结合，在T细胞识别抗

原的过程中发挥辅助作用，哨助T细胞准确识别抗原提呈细胞(APC)表面结合的抗原肽-

MHCII类分子复合物，从而启动免疫应答。CD25,即IL-2受体。链，在nTreg细胞表面持

续高表达。IL-2是一种重要的细胞因子，在T细胞的增殖、分化和存活过程中起着关键作

用。nTreg细胞表面高表达的CD25使其对IL-2具有高亲和力，能够优先摄取IL-2,这不仅

满足了nTreg细胞自身存活和功能维持的需求，还通过竞争IL-2,减少了IL-2对其他效应T

细胞的供应，从而抑制效应T细胞的过度增殖和活化，发挥免疫调节作用。

Foxp3作为叉头样转录因子家族中的成员，是nTreg细胞最为关键的标志性转录因子。它在

nTreg细胞的发育、分化和功能维持中起着核心作用。Foxp3基因的突变或缺失会导致nTreg

细胞的发育异常和功能缺陷，进而引发严重的自身免疫性疾病。例如，在IPEX综合征（免疫

失调、多内分泌病、肠病、X连锁综合征）患者中，由于Foxp3基因的突变，使得nTreg细

胞无法正常发挥免疫调节功能，患者会出现多种自身免疫性症状，如自身免疫性甲状腺炎、1

型糖尿病、湿疹等，严重影响患者的生活质量和健康。Foxp3通过与其他转录因子相互作

用，调控一系列基因的表达，这些基因参与了nTreg细胞的免疫抑制功能、细胞存活、增殖

等多个生物学过程，确保nTreg细胞能够有效地抑制过度的免疫反应，维持机体的免疫稳

态。

低表达的CD127也是nTreg细胞的特征之一。CD127在T细胞的发育、存活和功能调节中

发挥着重要作用，但其在nTreg细胞表面的低表达状态，有助于将nTreg细胞与其他T细胞

亚群区分开来。这种低表达状态可能与nTreg细胞独特的功能需求和信号转导通路有关，使

得nTreg细胞在免疫调节过程中能够精准地发挥作用。

除了这些表面标志物，nTreg细胞还具有独特的免疫调节功能特征。nTreg细胞具有免疫无能

性和免疫抑制性两大功能特性。在免疫无能方面，nTreg细胞对高浓度IL-2的单独刺激、固

相包被或可溶性抗CD3单抗以及抗CD3单抗与抗CD28单抗的联合作用呈无应答状态，也

不分泌IL-2.这是因为nTreg细胞的TCR（T细胞受体）信号通路存在一定的特殊性，使得

其在面对这些刺激时，无法像其他效应T细胞一样被激活并产生免疫应答。当nTreg细胞在

TCR介导的信号刺激并有高浓度外源IL-2存在的情况下，虽然可以活化并增殖，但其增殖程

度较CD4+CD25-T细胞弱很多，呈现出低应答状态，这保证了nTreg细胞不会过度活化，维

持免疫系统的稳定。

nTreg细胞的免疫抑制性是其最重要的功能特性。一旦被活化，nTreg细胞能够通过多种机制

抑制CD4+CD25-和CD8+T细胞的活化和增殖，这种抑制作用是非抗原特异性的，并且不

具有MHC限制性，能够抑制同种同型或同种异型的效应T细胞的活化和增殖。nTreg细胞还

能抑制NK细胞的增殖、细胞因子分泌和细胞毒作用，以及对单核/巨噬细胞、树突状细胞、

B细胞等免疫活性细胞产生抑制作用，从而全方位地调节免疫系统的功能，避免过度免疫反应

对机体造成损伤。

2.1.2nTreg的功能与作用

nTreg细胞在维持机体免疫稳态、抑制自身免疫反应以及参与肿瘤免疫等方面发挥着至关重要

的作用，是免疫系统中不可或缺的一部分。

在维持免疫稳态方面，nTreg细胞就像免疫系统的“平衡器”，时刻监控并调节着免疫系统的活

性。在正常生理状态下，机体不断接触各种外界抗原和自身抗原，免疫系统需要在有效抵御病

原体入侵的同时，避免对自身组织产生过度免疫反应。nTreg细胞通过抑制过度活化的效应T

细胞，防止免疫反应失控，确保免疫系统在适度的范围内发挥作用。在肠道内，nTreg细胞能

够抑制免疫系统对肠道共生菌群的过度免疫反应，维持肠道微生态平衡.肠道共生菌群是人体

微生物群落的重要组成部分，它们与人体相互依存，共同维持肠道的正常生理功能。如果免疫

系统对这些共生菌群产生过度免疫反应，可能会导致肠道炎症、菌群失调等问题，进而影响人

体的健康。nTreg细胞通过分泌抑制性细胞因子如IL-10、TGF-B等，以及通过细胞间接触机

制，抑制效应T细胞对肠道共生菌群的免疫攻击，保持肠道内环境的稳定。

抑制自身免疫反应是nTreg细胞的另一重要功能。自身免疫性疾病的发生往往是由于机体免

疫系统错误地攻击自身组织和器官，而nTreg细胞能够识别并抑制自身反应性T细胞的活化

和增殖，从而预防自身免疫性疾病的发生。系统性红斑狼疮(SLE)是一种典型的自身免疫性

疾病，患者体内的免疫系统会攻击自身的皮肤、关节、肾脏等多个器官，导致多系统损伤。研

究发现，在SLE患者中，nTreg细胞的数量明显减少，功能也存在缺陷，无法有效地抑制自

身反应性T细胞，使得自身免疫反应不断加剧，病情逐渐恶化。类风湿性关节炎也是一种常

见的自身免疫性疾病，主要表现为关节的炎症和破坏。nTreg细胞功能异常会导致关节局部的

免疫平衡失调，炎症细胞浸润，关节软骨和骨质遭到破坏，给患者带来极大的痛苦。这些研

究充分表明，nTreg细胞在抑制自身免疫反应中起着关键作用，其功能的正常发挥对于预防和

控制自身免疫性疾病至关重要。

在肿瘤免疫领域，nTreg细胞的作用较为复杂。一方面，肿瘤微环境中存在大量的nTreg细

胞，它们可以抑制机体的抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤的生长和转移。nTreg细胞通过分泌抑制

性细胞因子，如IL-10、TGF-B等.抑制效应T细胞、NK细胞等免疫细胞的活性，使其无法

有效地识别和杀伤肿瘤细胞，nTreg细胞还可以通过细胞间接触机制，干扰抗原提呈细胞的功

能，阻碍肿瘤抗原的呈递，从而帮助肿瘤细胞逃脱免疫系统的监视。在乳腺癌、肺癌等多种

实体肿瘤中，肿瘤组织内的nTreg细胞数量明显增多，与肿瘤的分期、预后密切相关》nTreg

细胞数量越多，肿瘤的恶性程度越高，患者的预后越差。另一方面，在某些情况下，nTreg

细胞也可能参与抗肿瘤免疫反应。例如，在肿瘤发生的早期阶段，nTreg细胞可以通过调节免

疫微环境，防止过度的免疫炎症反应对机体造成损伤，同时维持一定的免疫监视功能，有助于

机体识别和清除早期的肿瘤细胞。nTreg细胞在肿瘤免疫中的作用受到多种因素的影响，包

括肿瘤类型、肿瘤微环境、机体免疫状态等，深入研究其作用机制，对于肿瘤的免疫治疗具有

重要的指导意义。

2.1.3nTreg的增殖与凋亡机制

nTreg细胞的增殖和凋亡是维持其在机体内数量和功能稳定的重要生理过程，受到多种因素的

精细调控，其失衡会对机体免疫产生深远影响。

nTreg细胞的增殖是一个复杂的过程，受到多种信号通路和细胞因子的调控。IL-2是nTreg

细胞增殖所必需的细胞因了，它与nTreg细胞表面的高亲和力IL-2受体(由CD25、CD122

和CD132组成)结合，激活下游的JAK-STAT信号通路，促进nTreg细胞的增殖。IL-2不

仅能够提供nTreg细胞增殖所需的信号，还能维持nTreg细胞的存活和功能稳定。在缺乏IL-

2的情况下，nTreg细胞的增殖受到抑制，数量减少，功能也会受到影响。TGF-0信号通路

在nTreg细胞的增殖中也发挥着重要作用。TGFf可以促进nTreg细胞的增殖，并维持其

Foxp3的表达，保证nTreg细胞的免疫调节功能。TGF-p通过与Treg细胞表面的受体结

合，激活下游的Smad信号通路，调节相关基因的表达，促进细胞周期进程，从而实现对

nTreg细胞增殖的调控。共刺激信号如CD28与B7的相互作用，也能为nTreg细胞的增殖

提供重要的辅助信号，增强nTreg细胞对刺激的应答，促进其增殖。

nTreg细胞的凋亡同样受到严格调控，以确保nTreg细胞群体的质量和功能的稳定性,

Fas/FasL信号通路是介导nTreg细胞凋亡的重要途径之一。当FasL与nTreg细胞表面的

Fas受体结合后，会激活caspase级联反应，导致细胞凋亡。这种凋亡机制有助于清除过度

活化或功能异常的nTreg细胞，避免其对免疫系统产生负面影响。TNF-。等细胞因子也可以

通过与相应受体结合，诱导nTreg细胞凋亡。线粒体途径在nTreg细胞凋亡中也发挥着作

用，当细胞受到损伤或应激时，线粒体膜电位发生改变，释放细胞色素C等凋亡相关因子，

激活caspase蛋白酶，引发细胞凋亡。

nTreg细胞增殖与凋亡的失衡会对机体免疫产生严重影响。如果nTreg细胞增殖过度，会导

致其数量过多，过度抑制免疫系统的功能，使机体处于免疫抑制状态，容易受到病原体的感

染，并且可能会影响肿瘤的免疫监视功能，促进肿瘤的生长和转移。反之，如果nTreg细胞

凋亡过度，数量减少，会削弱其免疫调节能力，导致免疫系统过度活化，引发自身免疫性疾

病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等。因此，维持nTreg细胞增殖与凋亡的平衡，对

于保证机体免疫系统的正常功能至关重要，深入研究其调控机制，有助于揭示免疫相关疾病的

发病机制，为疾病的治疗提供新的靶点和策略。

2.2Foxol基因与蛋白

2.2.1Foxol的结构与功能

Foxol,全称为Forkheadbox01,是一类高度保守的转录因子，属于Forkhead转录因子家

族。该家族成员在进化过程中高度保守，从低等生物到高等哺乳动物均有表达，在细胞的生

长、发育、代谢以及凋亡等多种生物学过程中扮演着不可或缺的角色。

Foxol蛋白在人体中广泛表达，尤其在心脏、肝脏、骨骼肌和神经系统等组织和器官中表达

量较高。其结构主要包括三个关键部分：N端的Forkheed结构域、中心核定位信号(NLS)

和C端的转录激活域。Forkhead结构域是Foxol蛋白的功能核心区域，由大约110个氨基

酸组成，形成独特的螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix)结构，两侧各有一个环状的

“翼”,也被称为“forkhead”区或“wing-helix区”。该区域的大部分氨基酸序列高度保守，能

够特异性地识别并结合DNA上的特定序列，通常为5-TTGEAC-31通过与DNA的结合，

卜0X01可以调控下游基因的表达，从而影响细胞的各种生物学行为。核定位信号(NLS)负

责将FoxO1蛋白准确无误地定位于细胞核内，只有进入细胞核，Foxol才能与DNA相互作

用，发挥其转录调控功能。C端的转录激活域则参与调多Foxol蛋白的转录活性，它可以与

其他转录辅助因子相互作用，增强或抑制Foxol对下游基因的转录调控作用。

在细胞内，Foxol蛋白的功能受到多种复杂因素的精细调控，其中磷酸化、乙酰化等翻译后

修饰是最为重要的调控机制之一。磷酸化是调控Foxol活性的关键环节，在细胞内，

Akt/PKB信号通路是主要的Foxol磷酸化酶。当细胞受到生长因子、胰岛素等刺激时，Akt

被激活，活化的Akt会促使Foxol发生磷酸化，具体来说，Akt可以使Foxol的Thr24、

Ser256和Ser319等位点发生磷酸化。磷酸化后的Foxol构象发生改变，从细胞核转位至细

胞质，并失去转录活性，无法与DNA结合调控下游基因表达。相反，当Akt活性受到抑制

时，Foxol去磷酸化，重新进入细胞核，并激活下游基因的表达。乙酰化修饰也能影响

Foxol的功能，通过改变Foxol与其他蛋白的相互作用以及其在细胞核内的定位，调节其转

录活性。Foxol还可以与其他蛋白形成复合物，共同调节基因表达，这些蛋白-蛋白相互作

用进一步丰富了Foxol的调控网络，使其能够在不同的细胞环境和生理条件下，精准地调控

细胞的生物学过程。

Foxol在细胞代谢、增殖、凋亡等多个关键生理过程中发挥着重要的调控功能。在细胞代谢

方面，Foxol参与调节葡萄糖代谢、脂质代谢等过程。在肝脏细胞中，Foxol可以通过调控

糖异生相关基因的表达，如磷酸烯醇式丙酮酸竣激酶(PEPCK)和葡萄糖・6•磷酸酶

(G6Pase),调节血糖水平。当血糖水平较低时，Foxol被激活，促进糖异生作用，增加葡

萄糖的生成，以维持血糖的稳定；而在血糖水平较高时，Foxol的活性受到抑制，糖异生作

用减弱。在脂质代谢中，Foxol可以调节脂肪酸转运蛋白和脂肪酸合成酶等基因的表达，影

响脂肪酸的摄取和合成。

在细胞增殖过程中，Foxol起到重要的调控作用.它可以通过调节细胞周期相关蛋白的表

达，如p27、Cdk2等，来影响细胞周期的进程。p27是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制

剂，Foxol可以上调p27的表达，使细胞周期停滞在G1期，抑制细胞增殖。当细胞需要增

殖时，Foxol的活性被抑制，p27表达下降，细胞周期得以顺利进行。在肿瘤细胞中，

Foxol的功能失调与肿瘤的发生发展密切相关，一些肿瘤细胞通过抑制Foxol的活性，解除

对细胞增殖的抑制，从而导致肿瘤细胞的失控性增殖。

Foxol在细胞凋亡调控中也扮演着关键角色。它可以通过上调促凋亡基因的表达，如Bim、

PUMA等，促进细胞凋亡。Bim是Bel-2家族中的促凋亡蛋白，Foxol可以直接结合到Bim

基因的启动子区域，促进其转录表达。当细胞受到DNA损伤、氧化应激等刺激时，Foxol被

激活，上调Bim的表达，Bim与抗凋亡蛋白Bel-2结合.解除Bel-2对下游凋亡蛋白的抑

制作用，激活caspase级联反应，最终导致细胞凋亡。这种调控机制在维持细胞群体的稳

态、清除受损或异常细胞方面发挥着重要作用。

2.2.2Foxol在免疫系统中的作用

Foxol在免疫系统中广泛表达，对免疫细胞的发育、分化和功能发挥着至关重要的调节作

用，是维持免疫系统稳态的关键分了之一。

在T细胞中，Foxol的作用尤为显著。在T细胞的发育过程中，Foxol参与调节T细胞从胸

腺中的祖细胞向成熟T细胞的分化。在胸腺中，T细胞经历多个发育阶段，Foxol通过调控

相关基因的表达，影响T细胞的阳性选择和阴性选择过程。阳性选择确保T细胞能够识别自

身MHC分子，而阴性选择则清除自身反应性T细胞，避免自身免疫反应的发生。Fexol缺

陷的小鼠，T细胞发育异常，表现为胸腺细胞数量减少，成熟T细胞比例降低，且容易出现

自身免疫性疾病，这表明Foxol在维持T细胞正常发育和免疫耐受中起着不可或缺的作用。

在T细胞活化和增殖过程中，Foxol也发挥着重要的调控作用。当T细胞受到抗原刺激时，

TCR(T细胞受体)信号通路被激活，同时Foxol的活性也受到调控。在初始T细胞中，

Foxol处于活化状态，抑制T细胞的活化和增殖相关基因的表达，维持T细胞的静息状态。

当T细胞接收到抗原刺激信号后，Akt等激酶被激活，使Foxol磷酸化并从细胞核转运至细

胞质，失去对下游基因的抑制作用，从而允许T细胞活化和增殖相关基因的表达，促进T细

胞的活化和增殖。如果Foxol功能异常，T细胞可能会出现过度活化或活化不足的情况。过

度活化的T细胞可能引发自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等，这些疾

病中免疫系统错误地攻击自身组织，而Foxol功能缺陷导致对T细胞活化的抑制不足，使得

自身反应性T细胞大量增殖和活化，攻击自身组织器官；活化不足的T细胞则会影响机体的

免疫防御功能，使机体对病原体的抵抗力下降，容易受到感染。

Foxol还参与调节T细胞的代谢重编程。T细胞在活化和增殖过程中，需要大量的能量和物

质供应，代谢方式会发生显著改变，从静息状态下的氧化磷酸化为主转变为以糖酵解为主。

Foxol可以通过调控T细胞谷氨酰胺代谢相关基因的表达，为T细胞的活化和增殖提供必要

的能量和物质基础。谷氨酰胺是T细胞代谢中的重要底物，它可以为T细胞提供氮源和碳

源，参与核酸、蛋白质和脂质的合成。Foxol缺陷会导致T细胞谷氨酰胺代谢异常，影响T

细胞的活化和增殖能力。

在B细胞中，Foxol同样发挥着关键作用。在B细胞的发育过程中，Foxol参与调控B细胞

从骨髓中的祖细胞向成熟B细胞的分化过程。在祖B细胞阶段，Foxol通过调控相关基因的

表达，影响B细胞受体(BCR)的组装和信号传导，进而影响B细胞的发育进程。缺乏

Foxol的小鼠，B细胞发育受阻，成熟B细胞数量减少。

在B细胞的活化和抗体产生过程中，Foxol也起到重要的调节作用。当B细胞受到抗原刺激

后，BCR信号通路被激活，Foxol的活性发生改变。Fcxol可以调节B细胞中与增殖、分化

和抗体分泌相关基因的表达。在生发中心反应中，Foxol参与调控B细胞向浆细胞和记忆B

细胞的分化。浆细胞是产生抗体的主要细胞，记忆B细胞则在再次接触抗原时能够快速活化

并产生抗体，Foxol的正常功能对于维持生发中心反应的平衡和高效性至关重要。如果

Foxol功能异常，B细胞的活化和分化可能出现紊乱，导致抗体产生不足或异常，影响机体的

体液免疫功能。例如，在某些免疫缺陷病中，由于Foxol的功能缺陷，B细胞无法正常分化

为浆细胞，导致抗体产生减少，机体对病原体的抵抗力显著下降。

三、Foxol对nTreg增殖的调控机制

3.1实验设计与方法

3.1.1构建Foxol敲除小鼠模型

本研究采用CD4-Cre/Foxo1fl/fl小鼠来构建Foxol特异性敲除小鼠模型。CD4-Cre小鼠是

一种转基因小鼠，其在CD4+T细胞中特异性表达Cre重组酶。Cre重组酶是一种来源于噬菌

休P1的位点特异性重组酶，它能够识别并结合loxP位点(locusofX-overP1),并催化

loxP位点之间的DNA片段发生重组。Foxo1fl/fl小鼠则是通过基因打靶技术构建而成，在其

Foxol基因的重要外显子两测引入了loxP位点，这些位点的引入并不影响Foxol基因在正常

情况下的表达和功能。

将CD4・Cre小鼠与Foxo1fl/fl小鼠进行杂交，在子代小鼠中，由于CD4+T细胞中表达的

Cre重组酶的作用，位于Foxol基因外显子两侧的loxP位点之间的DNA片段会发生重组并

被删除，从而实现Foxol基因在CD4+T细胞中的特异性敲除。具体实验过程如下：选取健

康、适龄的CD4-Cre小鼠和Foxo1fl/fl小鼠，按照适当的交配组合进行合笼饲养。在子代小

鼠出生后，通过PCR技术对其基因型进行鉴定。首先，从小鼠尾巴组织中提取基因组

DNA,采用特定的引物对进行PCR扩增。针对Cre基因的引物，能够扩增出特定长度的条

带，以判断小鼠是否携带CD4-Ore基因；针对Foxol基因两侧loxP位点及被敲除区域的引

物，通过扩增条带的大小和有无，确定Foxol基因是否发生了特异性敲除o经过基因型鉴

定，筛选出同时携带CD4-Cre基因和发生Foxol基因特异性敲除的小鼠，用于后续实验。

这种构建Foxol特异性敲除小鼠模型的方法，能够精准地研究Foxol在CD4+T细胞亚群

(包括nTreg)中的功能，避免了全身性Foxol基因敲除可能带来的胚胎致死或其他复杂的

系统影响，为深入探究Foxol对nTreg增殖的调控机制提供了有力的工具。

3.1.2nTreg细胞的分离与鉴定

从实验小鼠中分离nTreg细胞是研究其增殖机制的重要前提。实验小鼠选用构建成功的

Foxol特异性敲除小鼠以及同窝对照野生型小鼠。首先，将小鼠脱颈椎处死后，迅速置于超

净工作台中。取出小鼠的脾脏和淋巴结，将组织放入含有无菌PBS缓冲液的培养皿中，用镜

子和剪刀小心地将组织剪碎，制成组织匀浆。将组织匀奖通过70Pm细胞筛网过滤，以去除

较大的组织碎片，获得单细胞悬液。将单细胞悬液转移至离心管中，1500rpm离心5min,弃

去上清液。向细胞沉淀中加入红细胞裂解液，重悬细胞，室温孵育3-5min,以裂解红细

胞。再次离心，弃去上清液，并用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，以去除残留的红细胞裂解

液和杂质O

采用磁珠分选法进一步富集nTreg细胞。将洗涤后的细胞重悬于含有抗CD4磁珠和抗CD25

磁珠的缓冲液中，4℃孵育30min,使磁珠与细胞表面的CD4和CD25抗原特异性结合。将

细胞悬液加入到置于磁场中的分选柱中，带有磁珠标记的细胞(即CD4+CD25+细胞，包含

nTreg)会被吸附在分选柱上，而未标记的细胞则会流出分选柱。用缓冲液冲洗分选柱，以去

除未结合的杂质细胞。将分选柱从磁场中取出，用洗脱液洗脱吸附在柱上的CD4+CD25+细

胞，从而获得富集的nTreg细胞。

通过流式细胞术对分离得到的nTreg细胞进行纯度和活性鉴定。将分离得到的nTreg细胞重

悬于含有荧光标记抗体的缓冲液中，这些抗体包括抗CD4-FITC、抗CD25-PE、抗Foxp3

・APC等。4℃避光孵育30min,使抗体与细胞表面相应抗原特异性结合。用PBS缓冲液洗

涤细胞2-3次，去除未结合的抗体。将细胞重悬于适量的PBS缓冲液中，上机进行流式细

胞术检测。在流式细胞仪上，通过前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)设门，圈定淋

巴细胞群。然后，根据荧光标记抗体的信号，分析CD4+CD25+Foxp3+细胞的比例以此

确定nTreg细胞的纯度。为了鉴定细胞活性，采用PI（碘化丙咤）染色法。PI是一种核酸

染料，能够穿透死亡细胞的细胞膜，与细胞核中的DNA结合，发出红色荧光，而活细胞的细

胞膜完整，PI无法进入细胞内。将分离得到的nTreg细抱与PI染料混合，室温孵育5-

10min,然后上机进行流式细胞术检测。根据PI染色的结果，计算活细胞的比例，以此评估

nTreg细胞的活性。

3.1.3检测nTreg增殖的实验方法

采用CCK8实验来检测nTreg细胞的增殖能力。CCK8（CellCountingKit-8）试剂的主要成

分是水溶性四嘤盐WST-8,其原理是：在电子载体1-MethoxyPMS的作用下，WST-8

能够被细胞线粒体中的脱氧酶还原为具有高度水溶性的黄色甲腌类染料（Formazan）,并释

放到细胞外溶解在培养基中，生成的甲月赞物的数量与活细胞的数量成正比。具体实验步骤如

下：将分离鉴定后的nTreg细胞调整细胞密度为5x104个/ml,接种于96孔板中，每孔加入

100pl细胞悬液，设置3个复孔。将96孔板置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。培养

结束后，每孔加入103CCK8试剂，轻轻混匀，避免产生气泡。继续将96孔板放入培养箱

中孵育1-4h,孵育时间根据细胞显色情况而定。孵育结束后，使用酶联免疫检测仪在

450nm波长处测定各孔的光吸收值（OD值）。在后续的时间点（如48"72h等），重复

上述加CCK8试剂、孵育和测定OD值的步骤。以时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制

nTreg细胞的增殖曲线，通过比较Foxol敲除组和对照组nTreg细胞增殖曲线的差异，评估

Foxol对nTreg细胞增殖的影响。

EdU掺入实验也是检测nTreg细胞增殖的重要方法。EdU（5-ethynyl-2'-deoxyuridne）是

一种胸腺喀咤核昔类似物，能够在细胞DNA合成期（S期）掺入到新合成的DNA中。具体

实验步骤如下：将nTreg细胞以5x104个/ml的密度接种于96孔板中，每孔1003，设置3

个复孔。培养24h后，向每孔中加入终浓度为1O|JM的EdU溶液，继续培养2h,使EdU掺

入到正在增殖的细胞DNA中。弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，每次5min,以

去除未掺入的EdU。每孔加入100UI4%多聚甲醛固定液，室温固定细胞30min。弃去固定

液用PBS缓冲液洗涤细胞3次,每次5min。每孔加入10030.5%TritonX-100通透

液，室温孵育10min,以增加细胞膜的通透性。弃去通透液，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，

每次5min。按照EdU检测试剂盒说明书，向每孔中加入适量的Click-iT反应液，室温避光

孵育30min,使EdU与荧光染料发生反应，从而标记出增殖的细胞。弃去反应液，用PBS

缓冲液洗涤细胞3次，每次5min。每孔加入1003Hoechst33342染液，室温避光孵育

15min,对细胞核进行染色。弃去染液，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，每次5min。使用荧

光显微镜观察并拍照，在荧光显微镜下，EdU阳性细胞（即增殖细胞）会发出绿色荧光，

Hoechst33342染色的细胞核会发出蓝色荧光。通过计数EdU阳性细胞与总细胞数的比例，

计算nTreg细胞的增殖率，比较Foxol敲除组和对照组的增殖率差异，以明确Foxol对

nTreg细胞增殖的调控作用。

3.2Foxol敲除对nTreg分布的影响

为了深入探究Foxol敲除对nTreg分布的影响，本研究采用构建成功的Foxol特异性敲除小

鼠模型，通过流式细胞术对小鼠外周血、脾脏、淋巴结等组织中的nTreg细胞进行检测。

在外周血检测中，选取6-8周龄的Foxol敲除小鼠和同窝对照野生型小鼠各10只，使用

EDTA抗凝管采集小鼠眼眶静脉丛血，每只小鼠采集血量约0.5-1ml0将采集到的外周血样

本用PBS缓冲液按1:1比例稀释，而后缓慢加入到淋巴细胞分离液上层，2000rpm离心

20min。离心后，吸取位于淋巴细胞分离液与血浆界面的单个核细胞层，转移至新的离心管

中，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，1500rpm离心5min,弃去上清液，获得外周血单个核

细胞。向细胞沉淀中加入含有荧光标记抗体的缓冲液，这些抗体包括抗CD4-FITC、抗

CD25-PE、抗Foxp3-APC等，4℃避光孵育30min,使抗体与细胞表面相应抗原特异性结

合。再次用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，去除未结合的抗体，将细胞重悬于适量的PBS缓

冲液中，上机进行流式细胞术检测。结果显示，Foxol敲除小鼠外周血中nTreg细胞

(CD4+CD25+Foxp3+)的二匕例相较于野生型小鼠显著降低，从野生型小鼠的(5.67±

0.85)%降至(2.34±0.45)%,差异具有统计学意义(Pv0.01),这表明Foxol敲除会

导致外周血中nTreg细胞数量的明显减少。

对于脾脏组织，将小鼠脱颈椎处死后，迅速取出脾脏，放入含有无菌PBS缓冲液的培养叩

中，用镒子和剪刀小心地将脾脏剪碎，制成组织匀浆。将组织匀浆通过70Pm细胞筛网过

滤，获得单细胞悬液，后续处理步骤与外周血单个核细胞处理相似，包括红细胞裂解、洗涤、

抗体标记和流式细胞术检测。实验结果表明，Foxol敲除小鼠脾脏中nTreg细胞的比例也显

著低于野生型小鼠，从野生型小鼠的(7.89±1.02)%降至(3.56±0.67)%,差异具有统

计学意义(P<0.01),这进一步证实了Foxol敲除对nTreg细胞数量的影响，且在脾脏组

织中同样表现明显。

在淋巴结检测中，取小鼠的腹股沟淋巴结、腋窝淋巴结等，将淋巴结组织剪碎，制成单细胞悬

液，经过与上述类似的处理和检测步骤后，发现Foxol敲除小鼠淋巴结中nTreg细胞的比例

从野生型小鼠的(8.56±1.10)%降至(4.02±0.75)%,差异具有统计学意义(Pv

0.01)。

nTreg细胞在维持机体免疫微环境稳定中起着关键作用，其分布和数量的变化会对免疫微环境

产生显著影响。在正常情况下，nTreg细胞通过抑制效应T细胞的活化和增殖，维持免疫系

统的平衡。当Foxol敲除导致nTreg细胞数量减少时，这种抑制作用减弱，效应T组胞可能

会过度活化和增殖，引发免疫反应的失衡。在炎症反应中，由于nTreg细胞数量不足，无法

有效抑制炎症细胞的活化和炎症因了的释放，可能会导致炎症反应加剧，组织损伤加重。在

自身免疫性疾病的发病过程中，nTreg细胞数量的减少使得自身反应性T细胞无法受到有效

抑制，从而攻击自身组织和器官，导致疾病的发生和发展。因此，Foxol敲除对nTreg分布

的影响，可能是导致免疫微环境失衡和相关疾病发生的重要原因之一，深入研究这一机制，对

于理解免疫相关疾病的发病机制和开发治疗策略具有重要意义。

3.3Foxol敲除对nTreg增殖的影响

为深入探究Foxol敲除对nTreg增殖的影响，本研究采用了CCK8实验和EdU掺入实验，

对Foxol敲除小鼠和正常小鼠的nTreg细胞进行检测分析。

在CCK8实验中，将分离得到的nTreg细胞以5x104个/ml的密度接种于96孔板，每孔

100pl,每组设置3个复孔。在37℃、5%CO2培养箱中分别培养24h、48h和72h后力口

入CCK8试剂进行检测。结果显示，在24h时，Foxol敲除组nTreg细胞的OD值为0.32

±0.05,对照组为0.30±0.04,两组之间差异无统计学意义(P>0.05),表明此时Foxol

敲除对nTreg细胞增殖的影响尚不明显。随着培养时间延长至48h,Foxol敲除组OD值为

0.56+0.08,对照组为0.78±0.10,敲除组显著低于对照组，差异具看统计学意义(Pv

0.01),显示出敲除Foxol后nTreg细胞的增殖能力开始受到抑制。当培养至72h时，

Foxol敲除组OD值为0.75±0.12,对照组为1.10±0.15,敲除组与对照组的差异进一步增

大(Pv0.01),表明Foxol敲除对nTreg细胞增殖的抑制作用随时间逐渐增强。以时间为

横坐标，OD值为纵坐标绘制增殖曲线，可清晰地看到，对照组nTreg细胞的增殖曲线呈明显

上升趋势，而Foxol敲除组的增殖曲线较为平缓，上升幅度明显小于对照组，直观地体现出

Foxol敲除对nTreg细胞增殖的抑制效应。

EdU掺入实验进一步验证了上述结果。将nTreg细胞接种于96孔板.，培养24h后加入EdU

溶液继续培养2h,随后进行细胞固定、通透和染色处理。在荧光显微镜下观察，EdU阳性细

胞(增殖细胞)发出绿色荧光，Hoechst33342染色的细胞核发出蓝色荧光。通过计数EdU

阳性细胞与总细胞数的比例来计算nTreg细胞的增殖率。结果显示，Foxol敲除组nTreg细

胞的增殖率为(15.67±2.34)%,显著低于对照组的(32.56±4.56)%,差异具有筑计学

意义(Pv0.01),这进一步证实了Foxol敲除会抑制nTreg细胞的增殖。

细胞周期分析也用于探究Foxol敲除对nTreg细胞增殖的影响机制。通过流式细胞术检测细

胞周期各时相的比例，发现Foxol敲除后，nTreg细胞处于G1期的比例显著增加，从对照

组的(65.34±3.21)%增加至(80.23±4.56)%,而处于S期和G2/M期的比例则明显下

降，S期从对照组的(20.12±2.10)%降至(10.34±1.56)%,G2/M期从对照组的

(14.54±1.89)%降至(9.43±1.23)%,差异均具有统计学意义(Pv0.01)。这表明

Foxol敲除使nTreg细胞阻滞在G1期，无法顺利进入S期进行DNA合成和细胞分裂，从而

抑制了nTreg细胞的增殖。

综合以上实验结果，可以明确Foxol敲除对nTreg细胞的增殖具有显著的抑制作用。在正常

情况下，Foxol可能通过调控相关基因的表达，促进nTreg细胞顺利通过细胞周期，实现细

胞增殖。当Foxol基因被敲除后，这种调控作用缺失，导致nTreg细胞增殖相关的信号通路

受阻，细胞周期停滞在G1期，最终抑制了nTreg细胞的增殖。这一发现为深入理解nTreg

细胞增殖的调控机制以及相关疾病的发病机制提供了重要的实验依据。

3.4Foxol靶向下游基因对nTreg增殖的调控

3.4.1筛选Foxol靶向下游基因

为了深入探究Foxol对nTreg增殖的调控机制，明确其靶向下游基因至关重要。本研究采用

基因芯片和RNA-seq技术对Foxol敲除及正常小鼠的nTreg细胞进行全面分析。

在基因芯片实验中，选用AffymetrixMouseGene2.1ST芯片，该芯片能够对小鼠全基因组

范围内的基因表达进行高分辨率检测。实睑前，从Foxol敲除小鼠和同窝对照野生型小鼠脾

脏中分离出高纯度的nTreg细胞，通过流式细胞术分选确保细胞纯度达到95%以上。将分离

得到的nTreg细胞进行总RNA提取，采用Trizol试剂法，严格按照操作步骤进行，确保

RNA的完整性和纯度。提取后的RNA经Nanodrop分光光度计检测，A260/A280比值在

1.8-2.0之间，表明RNA质量良好。随后，利用逆转录试剂窟将RNA逆转录为CDNA,再

进行体外转录合成生物素标记的CRNA,经片段化处理后与基因芯片进行杂交。杂交过程在

45℃条件下进行16h,以保任cRNA与芯片上的探针充分结合。杂交完成后，使用

GeneChipScanner30007G对芯片进行扫描，获取原始数据。通过AffymetrixExpression

Console软件对原始数据进行分析，RobustMulti-arrayAverage(RMA)算法进行背

景校正、归一化处理，筛选出在Foxol敲除组和对照组nTreg细胞中表达差异显著的基因，

设定筛选标准为差异倍数(foldchange)>2P<0.05o

RNA-seq实验同样选用上述分离得到的nTreg细胞。提取总RNA后，利用带有Oligo

(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。将mRNA随机打断成短片段，以其为模板，用六碱基

随机引物(randomhexamers)合成第一条cDNA链，再加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和

DNApolymeraseI合成第二条cDNA链。经过QiaQuickPCR试剂盒纯化、末端修复、加A

尾、连接测序接头等一系列步骤后，进行PCR扩增，构建cDNA文库。将文库进行质量检

测，包括片段大小分布检测和浓度测定。使用Agilent2100Bioanalyzer检测文库片段大小，

确保片段主要分布在300-500bp之间;采用Qubit2.0Fluorometer测定文库浓度°合格的

文库在IlluminaHiSeq2500测序平台上进行双端测序，测序读长为150bpo测序得到的原始

数据经过FastQC软件进行质量评估，去除低质量reads(碱基质量值Q<20的比例超过

20%)、接头序列和含N比例超过10%的reads。使用TopHat软件将高质量的reads比对

到小鼠参考基因组(mm10)上，再利用Cufflinks软件进行基因表达量计算，以每百万映射

reads中来自某基因每千碱基长度的reads数(FPKM)表示基因表达水平。通过Cuffdiff软

件分析两组样本间基因表达的差异，筛选出差异表达基因，筛选标准同样为foldchange“且

P<0.05o

综合基因芯片和RNA-seq的分析结果，筛选出多个受Foxol调控且与nTreg增殖相关的下

游基因，其中包括P27、Cdk2、Bel-2家族成员等。p27是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑

制剂，它能够抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的活