miR-122在小鼠胚胎干细胞向肝细胞分化中的分子调控密码解析

miR-122在小鼠胚胎干细胞向肝细胞分

化中的分子调控密码解析

一、引言

1.1研究背景

肝脏作为人体最大的实质性器官，承担着代谢、解毒、免疫等重要功能。然而，近年来肝脏疾

病的发病率呈显著上升趋势，严重威胁人类健康。据相关数据显示，我国肝病患者已突破4

亿，其中包括6000万酒精性肝病患者、2亿非酒精性脂肪肝患者。各类肝脏疾病，如肝

炎、肝硬化、原发性肝癌、先天性胆道闭锁、先天性酶缺乏性肝病和急性肝功能衰竭等难治性

肝病、终末期肝病，已成为全球医疗领域亟待解决的棘手问题,这些疾病不仅给患者带来了巨

大的痛苦，也给社会和家庭造成了沉重的经济负担。

肝细胞移植(HepatocyteTransplantation,HTx)作为一种新兴的治疗手段，为解决这些肝

脏疾病问题提供了新的途径，有可能与原位肝移植(OrthotopicLiverTransplantation,

OLT)一样，成为上述疾病可供选择的替代治疗方法。肝细胞移植通过将健康的肝细胞移植到

患者体内，有望修复受损的肝脏组织，恢复肝脏功能，从而为肝脏疾病患者带来新的希望。然

而，目前肝细胞移植的临床应用研究进展相当缓慢，主要原因在于肝细胞来源短缺以及增殖困

难等方面的限制。获取足够数量且质量可靠的肝细胞成为了肝细胞移植治疗发展的瓶颈。

人类胚胎干细胞(EmbryonicStemCell,ESC)建系成功无疑为解决细胞移植供体(种子)

来源问题带来了曙光.ESC具有无限的增殖潜能和发育的全能性，理论上，它可在特定条件

下定向分化为成体所有种类的细胞，这使得ESC成为细胞移植中极具潜力的种子细胞来源。

如果能够成功诱导ESC定向分化为肝细胞，将为肝细胞移植提供源源不断的细胞资源，有望

突破当前肝细胞来源短缺的困境，推动肝细胞移植治疗的广泛应用。目前，已有不少研究成功

在体外通过自发分化或者外源性因子的诱导将ESC诱导分化为肝细胞。然而，由于对胚胎发

育过程中基因激活与沉默的机制以及胚层、组织和细胞间的信息调捽网络所知甚少,我们尚难

以全面、有序地掌控ESC定向分化为肝细胞的进程。当前所获取的目的细胞在分化效率、均

质性等方面离临床应用的要求还相距甚远◎低分化效率导致难以获得足够数量的肝细胞用于治

疗，而不均质的细胞群体可能会影响治疗效果，甚至带来潜在的风险。因此，深入研究ESC

向肝细胞分化的调控机制，提高分化效率和细胞均质性，是目前亟待解决的关键问题C

在ESC体外分化这一被认为是人体组织细胞发育重演的过程中，涉及了基因有序地激活与沉

默、增强与衰减，众多转录调节机制精确地控制着这一进程。其中，microRNA(miRNA)作

为广泛存在于真核细胞内的转录后基因调节机制，在细胞生长与分化过程中扮演着极为重要的

角色。miRNA通过与靶基因的互补配对，抑制靶基因的翻译过程或者促使靶mRNA降解，

从而实现对基因表达的精细调控。目前已初步证明，miR-122在肝脏特异性高表达，并且在

调控肝脏发育、肝细胞代谢等方面起着重要作用。研究发现，miR-122在肝脏发育过程中参

与调控肝细胞的增殖、分化和成熟，对维持肝脏正常功能具有不可或缺的作用。在肝细胞代谢

方面，miR-122能够调节脂质代谢、糖代谢等关键代谢途径，影响肝细胞的能量平衡和物质

合成。因此，探索miR-122在ESC分化为肝细胞过程中的调控作用与机制，对于深入理解

肝脏发育和肝细胞分化的分子机制，提高ESC向肝细胞分化的效率和质量，具有重要的理论

意义和潜在的应用价值。

1.2miR-122的研究现状

miR-122是一种在肝脏中特异性高表达的微小RNA,在肝脏的生理和病理过程中都发挥着

至关重要的作用。

在生理状态下，miR722参与了肝脏发育的多个关键阶段。在胚胎肝脏发育过程中，miR-

122的表达水平呈现动态变化，对肝细胞的增殖、分化和成熟起到精细的调控作用。研究发

现，miR-122能够通过靶向调控一系列与细胞周期、分化相关的基因，促进肝细胞从肝祖细

胞向成熟肝细胞的转变。例如，它可以抑制某些抑制肝细胞分化的基因表达，从而推动分化

进程顺利进行，确保肝脏正常的形态发生和功能建立。

在肝细胞代谢方面，miR-122也扮演着不可或缺的角色。它在脂质代谢中发挥关键调控作

用，通过靶向参与脂质合成、转运和代谢的相关基因，维持肝脏内脂质稳态。有研究表明，

miR-122可直接作用于脂肪酸合成酶(FAS)等基因的mRNA,抑制其翻译过程，减少脂肪

酸的合成，进而影响肝脏内脂质的含量和分布。在糖代谢方面，miR-122能够调节肝脏中糖

异生和糖原合成相关基因的表达，对血糖水平的稳定起到一定的调节作用。当机体血糖水平发

生变化时，miR・122的表达也会相应改变，通过调控下游靶基因，调整肝脏对葡萄糖的摄

取、利用和储存，维持血糖的动态平衡。

此外，miR-122还参与了肝细胞的应急应答过程。当肝脏受到损伤或面临应激刺激时，miR-

122的表达会发生显著变化，启动一系列细胞内信号通路，帮助肝细胞应对损伤和应激，促进

肝脏组织的修复和再生。在氧化应激条件下，miR-122可通过调节抗氧化酶相关基因的表

达，增强肝细胞的抗氧化能力，减轻氧化损伤对肝细胞的损害。

在病理状态下，miR-122与多种肝脏疾病的发生发展密切相关。在丙型肝炎病毒(HCV)感

染中，miR-122被发现能够与HCV的基因组RNA相互作用，促进HCV的复制和翻译过

程。研究显示，miR-122可以结合到HCVRNA的S丰编码区，稳定病毒RNA的结构，增

强其翻译效率，从而促进病毒的增殖。在肝细胞癌(HCC)中，miR-122却表现出抑癌基因

样的作用。许多研究表明，在肝癌组织中，miR-122的表达水平显著下调。低表达的miR-

122会导致其对一系列促癌基因的抑制作用减弱，使得这些基因过度表达，进而促进肝癌细胞

的增殖、侵袭和转移.例如，miR-122可靶向抑制与肝癌细胞增殖和转移密切相关的基因如

c-Myc、MMP-9等，当rriR-122表达降低时，这些基因的表达水平升高，促进了肝癌的

发生发展。

综上所述，miR-122在肝脏的生理和病理过程中都具有重要的调控作用，深入研究其在胚胎

干细胞向肝细胞分化过程中的作用机制，将有助于我们更好地理解肝脏发育和肝脏疾病的发生

发展，为肝脏疾病的治疗提供新的靶点和策略。

1.3研究目的和意义

本研究旨在深入探究miR-122在小鼠胚胎干细胞向肝细胞分化过程中的调控作用及其潜在机

制，主要聚焦于以下几个关键目标：其一，明确miR-122在小鼠胚胎干细胞向肝细胞分化不

同阶段的表达变化规律，为后续研究其调控作用奠定基础；其二，通过功能性实验，如过表达

或敲低miR-122,分析其对小鼠胚胎干细胞向肝细胞分化效率和质量的影响；其三，运用生

物信息学分析、荧光素酶报告基因实验、蛋白质免疫印迹等技术，鉴定miR-122在这一分化

过程中的下游靶基因，并深入解析其调控的分子信号通路。

本研究具有重要的理论意义和实际应用价值。在理论层面，深入剖析miR-122对小鼠胚胎干

细胞向肝细胞分化的调控机制，将有助于填补我们在胚胎干细胞分化调控领域的知识空白，进

一步完善肝脏发育和细胞分化的分子机制理论体系。miR-122作为肝脏特异性高表达的微小

RNA,其在胚胎干细胞向肝细胞分化过程中的作用机制研究，有望揭示新的基因调控网络和

信号通路，为理解细胞分化的本质提供新的视角。

从实际应用角度来看，本研究成果对肝脏疾病的治疗和再生医学的发展具有重要推动作用。首

先，肝细胞移植是治疗终末期肝病的一种潜在有效方法，但目前面临肝细胞来源短缺的困境。

通过本研究深入了解miR-122的调控机制，有可能为优化胚胎干细胞向肝细胞分化的诱导方

案提供理论依据，从而提高分化效率和质量，获得大量高质量的肝细胞，为肝细胞移植提供充

足的细胞来源，推动肝细胞移植治疗肝脏疾病的临床应用o其次，对于肝脏疾病的治疗，深

入认识miR-122与肝脏疾病发生发展的关系，有助于开发以miR-122为靶点的新型治疗策

略。在丙型肝炎病毒感染中，针对miR722与HCV的相互作用机制开发靶向药物，有可能

阻断病毒的复制和传播，为丙肝的治疗提供新的手段；在肝细胞癌中，通过上调miR-122的

表达，恢复其对促癌基因的抑制作用，有望为肝癌的治疗开辟新的途径。最后，本研究在再生

医学领域也具有潜在的应用价值，为肝脏组织工程和肝脏再生治疗提供理论支持，可能为肝脏

损伤修复和肝脏功能重建提供新的方法和策略。

二、小鼠胚胎干细胞向肝细胞分化的机制与方法

2.1胚胎干细胞特性与分化潜能

胚胎干细胞(EmbryonicStemCells,ESCs)是一类来源于早期胚胎内细胞团或原始生殖细

胞的细胞，具有独特的生物学特性，在再生医学和细胞治疗领域展现出巨大的应用潜力。

自我更新是胚胎干细胞最为显著的特性之一。在适宜的培养条件下，胚胎干细胞能够不断进行

分裂，维持自身细胞数量的稳定，同时保持未分化状态。这种自我更新能力与细胞周期调控

密切相关，一系列关键的转录因子和信号通路在其中发挥着重要作用。Oct4,Sox2和Nanog

等转录因子形成复杂的调控网络，它们相互作用，共同维持胚胎干细胞的自我更新状杰。

Oct4是维持胚胎干细胞多能性和自我更新的关键转录因子，它能够与靶基因的启动子区域结

合，激活或抑制相关基因的表达，从而调控胚胎干细胞的自我更新和分化过程。当Oct4表达

水平发生改变时，胚胎干细胞的自我更新能力和分化潜能也会受到显著影响。研究表明，降低

Oct4的表达会导致胚胎干斑胞失去自我更新能力，开始向特定细胞类型分化。此外，Wnt、

Notch等信号通路也参与了胚胎干细胞自我更新的调控。Wnt信号通路通过激活下游的P-

catenin,促进相关基因的表达，维持胚胎干细胞的自我更新。在胚胎干细胞培养过程中，添

加Wnt信号通路的激活剂可以增强其自我更新能力，而抑制Wnt信号通路则会导致胚胎干细

胞的分化。

胚胎干细胞还具有强大的多向分化潜能，理论上能够分化为体内所有类型的细胞，包括外胚

层、中胚层和内胚层来源的细胞。在胚胎发育过程中，胚胎干细胞受到体内复杂的信号调

控，逐渐分化为各种组织和器官的细胞。在特定的体外诱导条件下，胚胎干细胞也可以向特

定的细胞类型分化。肝细胞作为肝脏的主要功能细胞，在维持机体正常代谢和生理功能方面

发挥着关键作用。胚胎干细胞向肝细胞的分化涉及多个阶段和复杂的分子机制。在分化的起

始阶段，胚胎干细胞首先受到特定信号的刺激，开始向中胚层细胞分化。ActivinA.BMP4

等信号分子在这一过程中发挥着重要作用，它们能够激活胚胎干细胞内的相关信号通路，启动

中胚层分化程序。随着分化的进行，中胚层细胞进一步受到多种信号和转录因子的调控，逐

渐向肝祖细胞分化。HNF30、HNF4。等肝特异性转录因子在肝祖细胞的形成和分化中起着关

键作用，它们能够调控一系列与肝脏发育相关的基因表达，引导细胞向肝细胞方向分化。肝

祖细胞在肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等生长因子的作用下，进

一步增殖和分化，最终形成具有成熟肝细胞功能的细胞。这些成熟的肝细胞能够表达肝细胞

特异性的标志物，如白蛋白(ALB)、细胞角蛋白18(CK18)等，同时具备合成和分泌功

能、糖原储存功能以及药物代谢功能等C

胚胎干细胞的多向分化潜能为肝脏疾病的治疗提供了新的希望。通过深入研究胚胎干细胞向肝

细胞分化的机制，有望建立更加高效、稳定的诱导分化体系，获得大量具有功能的肝细胞，为

肝细胞移植、肝脏组织工程等提供充足的细胞来源，从而为肝脏疾病的治疗带来新的突破。

2.2向肝细胞分化的信号通路与调控因子

小鼠胚胎干细胞向肝细胞分化是一个受到多种信号通路和调控因子精密调控的复杂过程，其中

Wnt、Notch.Hedgehog等信号通路在这一分化进程中发挥着关键作用。

Wnt信号通路在胚胎发育和细胞分化过程中具有重要地位，其经典途径即Wnt/p-catenin信

号通路，在小鼠胚胎干细胞向肝细胞分化中起着核心调控作用。在胚胎发育早期，适当激活

Wnt信号通路能够促进胚胎干细胞向中胚层细胞分化，为后续向肝细胞分化奠定基础。研究

表明，在分化起始阶段添加Wnt信号通路的激活剂，可显著提高中胚层标志物的表达水平。

当胚胎干细胞接收到Wnt信号刺激时，细胞内的B-catenin蛋白会在细胞质中积累，随后进

入细胞核，与T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)家族转录因子结合，激活一系列与中

胚层分化相关的基因表达，如Brachyury等。然而，Wnt信号通路的激活在分化的不同阶段

需要精准调控。在胚胎干细胞向肝细胞分化的后期，持续激活Wnt信号通路会抑制肝细胞的

成熟，而适度抑制该信号通路则有利于肝细胞的终末分化。在分化后期抑制Wnt信号通路

后，肝细胞特异性标志物如白蛋白(ALB)、细胞角蛋白18(CK18)等的表达水平显著升

高。这是因为过度激活的Wnt信号会干扰肝特异性转录因子的功能，而抑制Wnt信号则能使

肝特异性转录因子更好地发挥作用，促进肝细胞的成熟和功能完善。

Notch信号通路通过细胞间的相互作用，在细胞命运决定和分化过程中发挥关键作用。在小

鼠胚胎干细胞向肝细胞分化过程中，Notch信号通路参与调控肝祖细胞的增殖与分化三衡。

当Notch信号通路被激活时，其受体Notch与配体Delta或Jagged结合，经过一系列的蛋

白水解过程，释放出Notch胞内结构域(NICD)。NICD进入细胞核后，与转录因子RBP-

JK结合，激活下游靶基因的表达，如Hes1、Hey1等。这些靶基因的表达能够抑制肝祖细胞

的分化，维持其增殖状态。在肝祖细胞阶段抑制Notch信号通路，会导致肝祖细胞过早分

化，肝细胞数量减少；而适度激活Notch信号通路，则有助于维持肝祖细胞的数量，为后续

肝细胞的分化提供充足的细胞来源。当肝祖细胞需要进一步分化为成熟肝细胞时，需要下调

Notch信号通路的活性，使细胞能够顺利进入分化程序。

Hedgehog信号通路在胚胎发育和组织器官形成中也起着不可或缺的作用。在小鼠胚胎干细

胞向肝细胞分化过程中，Hedgehog信号通路参与调控肝脏的早期发育和肝细胞的分化。研

究发现，激活Hedgehog信号通路可以促进胚胎干细胞向肝前体细胞分化。Hedgehog信号

通路的配体如SonicHedgehog(SHH)与受体Patched(PTCH)结合后，解除PTCH对

Smoothened(SMO)的抑制作用，激活下游的Gli转录因子，进而调控一系列靶基因的表

达。这些靶基因参与细胞增殖、分化和组织形态发生等过程，在肝脏发育中，它们能够促进

肝前体细胞的增殖和分化，增加肝前体细胞的数量。在分化早期抑制Hedgehog信号通路，

会导致肝前体细胞数量减少，影响后续肝细胞的分化。然而，Hedgehog信号通路的过度激

活也会对肝细胞分化产生负面影响，可能导致细胞分化异常。

除了上述信号通路外，转录因子和生长因子在小鼠胚胎干细胞向肝细胞分化过程中也发挥着重

要的调控作用。肝细胞核因子(HNF)家族转录因子是肝脏发育和肝细胞功能维持的关键调

控因子。其中，HNF3P(FoxA2)在肝脏发育早期表达，它能够结合到肝脏特异性基因的启

动子区域，启动肝脏发育相关基因的表达，促进胚胎干细胞向肝前体细胞分化。研究表明，

敲低HNF3p的表达会导致肝前体细胞标志物表达显著降低，抑制肝脏的早期发育。HNF4a

在肝细胞分化和成熟过程中起着核心作用，它能够调控一系列与肝细胞代谢、功能相关的基因

表达。HNF4。基因敲除的小鼠，肝细胞无法正常分化和成熟，肝脏功能严重受损。

生长因子如肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等在小鼠胚胎干细胞向

肝细胞分化过程中也具有重要作用。HGF能够促进肝祖细胞的增殖和分化，诱导其向成熟肝

细胞转变。在体外分化实验中，添加HGF可以显著提高肝细胞标志物的表达水平，增强肝细

胞的功能。FGF家族成员在肝脏发育和肝细胞分化的不同阶段发挥着不同的作用。FGF2在

早期能够促进胚胎干细胞的增殖和存活，维持其多能性；FGF4则在胚胎干细胞向中胚层和肝

前体细胞分化过程中发挥重要作用，它可以激活相关信号通路，促进细胞的分化。在分化过

程中添加FGF4.可提高中胚层和肝前体细胞标志物的表达，促进分化进程。

2.3现有诱导分化方法及流程

目前，诱导小鼠胚胎干细胞向肝细胞分化的方法多种多样，其中细胞因子联合诱导法和丁酸钠

联合诱导法是较为常用的方法。

细胞因子联合诱导法是模拟体内肝脏发育过程中的信号环境，通过添加一系列特定的细胞因

子，逐步引导胚胎干细胞向肝细胞分化。具体流程通常分为多个阶段。在起始阶段，加入

ActivinA等细胞因子，激活胚胎干细胞内的相关信号通路，促使其向中胚层细胞分化。研究

表明，ActivinA能够激活Smad2/3信号通路，诱导胚胎干细胞表达中胚层标志物

Brachyuryo这一阶段一般持续3-5天，期间需要密切观察细胞形态和标志物表达的变化。

在分化的中期阶段，添加成纤维细胞生长因子4(FGF4)和骨形态发生蛋白4(BMP4)等细

胞因子。FGF4可以促进细抱的增殖和分化，BMP4则参与细胞命运的决定，二者协同作

用，促进中胚层细胞向肝祖细胞分化。这一阶段通常持续5-7天，细胞会逐渐出现上皮样形

态改变，同时开始表达肝祖细胞标志物如甲胎蛋白(AFP)等。在分化的后期阶段，加入肝

细胞生长因子(HGF)和制瘤素M(OSM)等细胞因子。HGF能够促进肝祖细胞的噌殖和

分化，OSM则有助于肝祖细胞向成熟肝细胞的转变。经过这一阶段的诱导，细胞逐渐具备成

熟肝细胞的形态和功能特征，表达白蛋白(ALB)、细胞角蛋白18(CK18)等成熟肝细胞标

志物，同时具备糖原储存、药物代谢等功能。这一阶段一般持续770天。在整个诱导过程

中，需要严格控制细胞因子的浓度和添加时间，同时优化培养基的成分和培养条件，以提高分

化效率和细胞质量。

丁酸钠联合诱导法也是一种常用的诱导方法。丁酸钠是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，能够

通过调节染色质结构和基因表达，促进胚胎干细胞向肝细胞分化。具体流程如下，首先将小

鼠胚胎干细胞常规培养，使其处于良好的生长状态。然后，将细胞进行悬浮培养，一般持续

4天,使其形成拟环体。拟环体是胚胎干细胞分化过程中的一个重要中间结构,它模拟了早

期胚胎的发育环境，有助于细胞的分化。接着，将拟胚体转移到铺有明胶的培养板中，并添

加3mmol/L的丁酸钠开始诱导分化。在诱导分化过程中使用倒置相差显微镜密切观察细胞

形态学的改变。随着诱导的进行，细胞会逐渐出现肝细胞样改变，如细胞形态变为多角形，

细胞间连接紧密等。同时，通过免疫荧光染色观察肝细胞特异性标志白蛋白(ALB)、甲胎

蛋白(AFP)、细胞角蛋白18(CK18)的表达情况，以确定细胞的分化程度。采用RT-

PCR检测肝细胞特异性标志基因ALB、AFP、甲状腺素运载蛋白(TTR)、抗胰蛋白酶

(AAT)的mRNA表达水平，从分子层面验证细胞的分化。运用流式细胞技术检测ALB阳

性细胞比例，精确评估分化效率。通过糖原PAS染色和口引喙氟绿(ICG)摄取试验检测分化

细胞的肝细胞功能，如糖原储存和摄取功能等。研究表明，使用丁酸钠诱导分化14d时，免

疫荧光检测显示ALB、AFP、CK18均为阳性；流式细胞技术检测ALB阳性细胞比例约为

48.6%；糖原PAS染色和ICG摄取试验显示分化18d的肝细胞样细胞具有肝细胞功能，说

明丁酸钠可以高效诱导小鼠胚胎干细胞分化为具有功能的肝细胞样细胞。

2.4分化细胞的鉴定与功能验证

在小鼠胚胎干细胞向肝细胞分化的研究中，准确鉴定分化细胞并验证其功能至关重要。这不仅

能够确定分化过程是否成功，还能为后续的研究和应用提供关键依据。

免疫荧光染色是一种常用的细胞鉴定方法，它能够直观地展示细胞内特定蛋白质的表达和定

位。在肝细胞分化研究中，我们可以使用针对白蛋白（ALB）、甲胎蛋白（AFP）、细胞角

蛋白18（CK18）等肝细胞特异性标志物的抗体进行免疫荧光染色。ALB是成熟肝细胞的重

要标志物，在肝脏的物质转运和代谢调节中发挥着关键作用。通过免疫荧光染色，若在分化

细胞中观察到ALB的阳性信号，且呈现出特定的分布模式，如均匀分布于细胞质中，则表明

这些细胞可能已经分化为具有肝细胞特征的细胞。AFP在胚胎期肝脏中高表达，随着肝细胞

的成熟，其表达水平逐渐降低。在分化早期，若检测到AFP阳性信号，说明细胞可能处于肝

祖细胞阶段，正朝着肝细胞方向分化。CK18是肝细胞中间丝蛋白的主要成分，对维持肝细

胞的结构和功能稳定具有重要意义。当分化细胞中出现CK18的阳性信号时，也进一步支持

其肝细胞特性。通过免疫荧光染色，我们可以在荧光显微镜下清晰地观察到这些标志物在细

胞内的表达情况，从而初步判断细胞的分化状态。

RT-PCR技术则从基因转录水平对分化细胞进行鉴定。我们可以设计针对肝细胞特异性基因

的引物，如ALB、AFP、甲状腺素运载蛋白（TTR）、抗胰蛋白酶（AAT）等，通过RT-

PCR扩增这些基因的mRNA,并对扩增产物进行分析。如果在分化细胞中检测到这些基因的

mRNA表达，且表达水平随着分化进程呈现出相应的变化趋势，如ALB的mRNA表这逐渐

升高，AFP的mRNA表达先升高后降低，则进一步证实细胞正在向肝细胞分化。以ALB基

因的RT-PCR检测为例，我们提取分化细胞的总RNA.反转录为cDNA,然后以cDNA为

模板进行PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，若在预期位置出现特异性条带，

且条带的亮度随着分化时间的延长而增强，说明ALB基因的转录水平在不断提高，即细胞逐

渐向成熟肝细胞分化O

流式细胞技术能够精确地分析细胞群体中特定标志物阳性细胞的比例，从而量化分化效率。

在肝细胞分化研究中，我们可以使用荧光标记的抗ALB抗体对分化细胞进行染色，然后通过

流式细胞仪检测ALB阳性细胞的百分比。较高的ALB阳性细胞比例表明分化效率较高，更

多的胚胎干细胞成功分化为肝细胞。例如，在丁酸钠联合诱导法中，通过流式细胞技术检测

发现，诱导分化14d时ALB阳性细胞比例约为48.6%,这一数据直观地反映了该诱导方法

的分化效率。通过对比不同诱导条件下ALB阳性细胞的比例，我们可以优化诱导方案，提高

分化效率。

除了细胞鉴定，对分化细胞的功能验证也是研究的重要环节o尿素合成功能检测是评估肝细

胞功能的重要方法之一。肝细胞在体内承担着尿素合成的关键任务，通过将氨转化为尿素，

维持体内氮平衡。在体外，我们可以将分化细胞培养在含有氨的培养基中，经过一定时间的

培养后，检测培养基中尿素的含量。若培养基中尿素含量随着培养时间的延长而显著增加，

说明分化细胞具备合成尿素的能力，具有肝细胞的功能特征。如在一些研究中，将分化细胞

培养一段时间后，利用尿素检测试剂盒检测培养基中的尿素含量，发现尿素含量明显高于对照

组，证明了分化细胞具有尿素合成功能。

糖原PAS染色可以检测细胞内糖原的储存情况，也是验证肝细胞功能的常用方法。肝细胞能

够摄取葡萄糖并合成糖原储存起来，当机体需要时，再招糖原分解为葡萄糖供能。糖原PAS

染色利用过碘酸将糖原中的乙二醇基氧化为醛基,醛基与Sch用试剂结合，使糖原呈现出紫

红色。在分化细胞中，若观察到细胞质内出现紫红色颗粒，说明细胞内储存有糖原，具备肝

细胞的糖原储存功能。在对分化细胞进行糖原PAS染色时，我们可以看到分化后的细胞中出

现明显的紫红色颗粒，而未分化的胚胎干细胞则染色阴性，进一步证明了分化细胞具有肝细胞

的功能。

口引咏春绿(ICG)摄取试验可以评估分化细胞对染料的摄取能力，反映具物质摄取和转运功

能。ICG是一种临床上常用的染料，能够被肝细胞摄取并通过胆汁排泄。将分化细胞与ICG

孵育一段时间后，通过检测细胞内ICG的荧光强度或利用显微镜观察细胞对ICG的摄取情

况。若分化细胞能够摄取ICG,且荧光强度随着孵育时间的延长而增加，说明细胞具有类似

于肝细胞的物质摄取和转运功能。在相关实验中，将分化细胞与ICG孵育后，在荧光显微镜

下观察到细胞内出现明显的荧光信号，表明分化细胞能够摄取ICG,具备肝细胞的部分功

能。

三、miR-122的生物学特性与功能

3.1miR-122的结构与表达特征

miR-122是一种长度约为22个核甘酸的内源性单链非编码RNA,其编码基因位于第18号

染色体18q21.31位点。它的成熟核甘酸序列为UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG,这一

独特的序列赋予了miR-122特定的生物学功能。miR-122的前体具有典型的发夹结构，在

细胞核中由Drosha酶加工形成约66个核甘酸的pre-miR-122,随后被转运至细胞质，在

Dicer酶的作用下被剪切为成熟的miR-122。这种精确的加工过程确保了miR-122的正常

生成和功能发挥。

miR-122最为显著的表达特征是其在肝脏组织和细胞中的特异性高表达。研究表明，miR-

122在肝脏内的表达量大约占肝脏内所表达miRNAs总量的70%左右，在其他组织和细胞中

则表达量极低甚至几乎不表达。在正常肝细胞中，miR-122维持着较高的表达水平，对肝细

胞的正常生理功能起着关键的调控作用。在肝脏发育过程中，miR-122从胚胎期开始就呈现

出高表达状态，并且随着肝脏的发育成熟，其表达水平持续稳定。在胚胎肝脏发育的早期阶

段，miR-122参与调控肝祖细胞的增殖和分化，促进肝祖细胞向肝细胞的转变。随看肝脏的

进一步发育，miR-122在维持肝细胞的成熟表型和功能方面发挥着重要作用，确保肝细胞能

够正常执行代谢、解毒等生理功能。

miR-122在肝脏组织和细胞中的特异性高表达与其基因启动子区域的顺式作用元件以及转录

因子的相互作用密切相关。研究发现，肝细胞核因子(HNF)家族转录因子如HNF1a、

HNF30等能够结合到miR-122基因启动子区域，激活其转录过程，从而促进miR-122在

肝脏中的特异性高表达。HNF1。通过与miR-122基因启动子区域的特定序列结合，招募

RNA聚合酶等转录相关因子，启动miR-122的转录。这种转录调控机制使得miR-122在

肝脏组织中能够特异性地大量表达，为其在肝脏生理和病理过程中发挥重要作用奠定了基

础。

3.2在肝脏发育与细胞代谢中的作用

在肝脏发育进程中，miR・122起着不可或缺的调控作用，对肝细胞的增殖、分化和形态建成

产生深远影响。在胚胎肝脏发育的早期阶段，miR-122通过精准调控细胞周期相关基因的表

达，促进肝细胞的增殖。研究表明，miR-122能够靶向抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂

(CKIs)家族中的某些成员，如p21、p27等。这些CKIs通常会抑制细胞周期蛋白依赖性

激酶(CDKs)的活性，从而阻止细胞从G1期进入S期，抑制细胞增殖。当miR-122表达

时，它会与p21、p27等基因的mRNA的3非翻译区(3,UTR)互补配对，通过RNA诱导

沉默复合体(RISC)介导的机制，抑制这些mRNA的翻译过程，减少p21、p27蛋白的表

达。这样一来，CDKs的活性得以释放，细胞周期顺利推进，肝细胞得以大量增殖，为肝脏

的发育提供充足的细胞数量。在一项针对小鼠胚胎肝脏发育的研究中，通过敲低miR-122

的表达，发现肝细胞的增殖速率明显下降，细胞周期相关蛋白的表达也发生了显著改变，进一

步证实了miR-122在肝细胞增殖调控中的重要作用。

随着肝脏发育的进行，miR-122在肝细胞分化过程中也发挥着关键作用。它参与调控一系列

肝特异性转录因子和分化相关基因的表达，引导肝祖细胞向成熟肝细胞分化。肝细胞核因子

4a(HNF4a)是肝脏发育和肝细胞分化的关键转录因子，对维持肝细胞的功能和特性至关重

要。miR-122可以通过间接调控机制，增强HNF4。的表达和活性。研究发现，miR-122

能够靶向抑制某些抑制HNF4。表达的负调控因子，如一些转录抑制因子或microRNA。通过

抑制这些负调控因子，miR-122解除了对HNF4a表达的抑制，使得HNF4。能够正常发挥

作用，激活一系列与肝细胞分化相关的基因表达，促进肝祖细胞向成熟肝细胞的转变。此

外，miR-122还可以直接作用于一些与肝细胞分化相关的基因，如细胞角蛋白18

(CK18)、白蛋白(ALB)等基因的mRNA,通过调节它们的翻译效率，促进这些基因的表

达，进一步推动肝细胞的分化进程。在体外细胞分化实验中，过表达miR-122能够显著提

高肝祖细胞中CK18、ALB等成熟肝细胞标志物的表达水平，表明miR-122能够有效促进肝

细胞的分化。

在肝脏的形态建成方面，m旧-122也参与其中。它通过调控细胞间的信号传导和细胞外基质

的合成与降解，影响肝细胞的迁移、聚集和组织形态的形成o肝细胞的正常迁移和聚集对于

肝脏组织结构的形成至关重要。研究表明，miR-122可以靶向调节一些与细胞迁移相关的基

因，如基质金属蛋白酶(MMPs)家族成员。MMPs能够降解细胞外基质，为细胞迁移提供

空间和条件。miR-122通过抑制某些MMPs基因的表达，调节细胞外基质的降解程度，从

而影响肝细胞的迁移速度和方向。在肝脏发育过程中，适度的细胞迁移和聚集能够使肝细胞

有序排列，形成正常的肝脏组织结构。当miR-122表达异常时，肝细胞的迁移和聚集过程

可能会受到干扰，导致肝脏形态建成异常。

在肝细胞代谢领域，miR-122在脂类代谢和糖代谢等方面发挥着重要的调控作用。在脂类代

谢方面，miR-122对肝脏内脂质的合成、转运和代谢起着关键的调节作用。它可以通过靶向

多个参与脂质代谢的基因，维持肝脏内脂质稳态。脂肪酸合成酶(FAS)是脂质合成过程中

的关键酶，负责催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成脂肪酸。miR-122能够直接与

FAS基因的mRNA的3UTR结合，抑制其翻译过程，减少FAS蛋白的表达，从而降低脂肪

酸的合成速率。研究表明，在miR-122过表达的肝细胞中，FAS的蛋白水平明显降低，脂

肪酸合成量减少；而在miR-122敲低的肝细胞中，FAS表达升高，脂肪酸合成增加。此

外，miR-122还可以调节胆固醇代谢相关基因的表达，如羟甲基戊二酰辅酶A还原酶

(HMGCR),它是胆固醇合成的限速酶。miR-122通过抑制HMGCR的表达，减少胆固醇

的合成。在脂质转运方面，miR-122可以影响载脂蛋白的表达，载脂蛋白在脂质的运输过程

中起着重要作用。通过调节载脂蛋白的表达，miR-122间接影响脂质在肝脏内的转运和分

布。

在糖代谢方面，miR722参与调节肝脏中糖异生和糖原合成等关键过程。在糖异生过程中，

磷酸烯醇式丙酮酸峻激酶(PEPCK)和葡萄糖•6•磷酸酶(G6Pase)是两个关键的限速

酶，它们催化非糖物质(如乳酸、丙酮酸、氨基酸等)转化为葡萄糖。miR-122能够通过靶

向调节PEPCK和G6Pase基因的表达，影响糖异生的速率。研究发现，miR-122可以与

PEPCK和G6Pase基因的mRNA的3'UTR结合，抑制它们的翻译过程，从而减少这两种酶

的合成，降低糖异生的速率。当机体血糖水平较低时，miR-122的表达会相应降低，使得

PEPCK和G6Pase的表达增加，促进糖异生，维持血糖水平的稳定。在糖原合成方面，miR

•122可以调节糖原合成酶：GS)的活性。糖原合成酶是糖原合成的关键酶，其活性受到多

种因素的调节。miR-122可以通过靶向调节一些与糖原合成酶活性调节相关的信号通路或蛋

白，间接影响糖原合成酶的活性。当miR-122表达升高时，它可以促进糖原合成酶的活

性，增加糖原的合成；而当miR-122表达降低时，糖原合成酶活性下降，糖原合成减少。

通过对糖异生和糖原合成的调控，miR-122在维持血糖动态平衡中发挥着重要作用。

3.3在其他细胞过程中的潜在功能

除了在肝脏发育和细胞代谢中发挥关键作用外，miR-122在其他细胞过程中也展现出潜在的

重要功能，尤其是在细胞周期调控和凋亡方面，近年来受到了广泛的关注。

在细胞周期调控方面，研究发现miR-122与细胞周期的进程密切相关。细胞周期是细胞生

命活动的重要过程，包括G1期、S期、G2期和M期，受到一系列基因和蛋白的精密调

控。miR-122可以通过靶向调控细胞周期相关基因的表达，影响细胞周期的进程。有研究

表明，miR-122能够直接作用于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKIs)家族中的成员，如

P21和p27。p21和p27是细胞周期的负调控因子，它们能够抑制细胞周期蛋白依赖性激酶

(CDKs)的活性，从而阻止细胞从G1期进入S期，使细胞周期停滞。miR-122通过与

p21、p27基因的mRNA的3,非翻译区(3,UTR)互补配对，抑制这些mRNA的翻译过程，

减少p21和p27蛋白的表达。这样一来，CDKs的活性得以释放，细胞周期顺利推进。在肝

癌细胞的研究中发现，当miR722表达下调时，p21和p27蛋白的表达水平升高，细胞周

期停滞在G1期，细胞增殖受到抑制；而当miR-122过表达时，p21和p27蛋白表达降

低，细胞周期进程加快，细胞增殖能力增强。这表明miR-122在细胞周期调控中起着重要

的调节作用，通过调控细胞周期相关蛋白的表达，影响细胞的增殖能力。

细胞凋亡是细胞的一种程序性死亡方式，对于维持组织和器官的正常发育、稳态以及清除受损

或异常细胞至关重要。越来越多的研究证据表明，miR-122在细胞凋亡过程中也发挥着关键

的调控作用。miR-122可以通过靶向调控凋亡相关基因和信号通路，影响细胞凋亡的发生和

发展。在氧化应激诱导的肝细胞凋亡模型中，miR-122的表达水平显著下降。进一步研究

发现，miR-122能够靶向抑制凋亡相关基因Bel-2家族中促凋亡成员Bax的表达。当miR

-122表达降低时，对Bax的抑制作用减弱，Bax蛋白表达升高，导致线粒体膜电位下降，细

胞色素C释放到细胞质中，激活caspase级联反应，最终引发细胞凋亡。相反，过表达miR

-122可以抑制Bax的表达，减少细胞色素C的释放和caspase的激活，从而抑制细胞凋

亡。miR722还可以通过调控其他凋亡相关信号通路，如PI3K/AKT信号通路等，影响细胞

凋亡。PI3K/AKT信号通路是一条重要的抗凋亡信号通路，AKT被激活后可以磷酸化下游的

多种靶蛋白，抑制细胞凋亡。研究发现，miR-122可以通过靶向调控PI3K/AKT信号通路中

的关键分子，如PTEN等，间接调节AKT的活性，从而影响细胞凋亡。当miR-122表达升

高时，它可以抑制PTEN的表达，激活PI3K/AKT信号通路，抑制细胞凋亡；而当miR-122

表达降低时，PTEN表达升高，PI3K/AKT信号通路受到抑制，细胞凋亡增加。

miR-122在细胞周期调控和凋亡等细胞过程中具有潜在的重要功能，通过靶向调控相关基因

和信号通路，参与维持细胞的正常生理状态和功能平衡。对这些潜在功能的深入研究，不仅

有助于我们全面理解miR-122的生物学作用，也为相关疾病的治疗提供了新的靶点和思

路。

四、实验研究：miR-122对小鼠胚胎干细胞向肝细胞分化的影

响

4.1实验设计与材料方法

本实验选用SPF级C57BL/6小鼠，购自［具体动物供应商名称］,用于获取小鼠胚胎干细

胞。小鼠胚胎干细胞株选用［具体细胞株名称］,该细胞株具有稳定的多能性和分化潜能，保

存于实验室液氮罐中。实验所需的主要试剂包括胎牛血清（FBS,［品牌名称］）、DMEM高

糖培养基（［品牌名称〕）、青链霉素混合液（［品牌名称I）、025%胰蛋白酶-EDTA消化液

（［品牌名称］）、miR-122mimics.miR-122inhibitors及其阴性对照（均由［公司名称］合

成）、Lipofectamine3000转染试剂（［品牌名称］）、ActivinA.FGF4、BMP4、HGF、

OSM等细胞因子（［品牌名称］）、Trizol试剂（［品牌名称］）、逆转录试剂盒（［品牌名称］）、

SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒（［品牌名称］）、蛋白裂解液（［品牌名称］）、BCA蛋白

定量试剂盒（［品牌名称］）、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（［品牌名称］）、PVDF膜（［品牌

名称］）、ECL化学发光试剂盒（［品牌名称］）、免疫荧光染色相关抗体（白蛋白（ALB）、甲

胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白18（CK18）等抗体，［品牌名称］）、DAPI染液（［品牌名称］）

等。实验仪器主要有CO2培养箱（［品牌及型号］）、超净工作台（［品牌及型号］）、倒置相差

显微镜（［品牌及型号］）、低温高速离心机（［品牌及型号］）、PCR仪（［品牌及型号］）、荧

光定量PCR仪（［品牌及型号］）、电泳仪（［品牌及型号］）、转膜仪（［品牌及型号］）、化学

发光成像系统（［品牌及型号］）、流式细胞仪（［品牌及型号］）等。

实险共设置4组，分别为对照组、miR-122mimics组、miR・122inhib让ors组和miR-122

mimics+inhibitor组。对照组转染阴性对照mimics和inhibitors,miR-122mimics组转染

miR-122mimics以过表达miR-122,miR-122inhibitors组转染miR-122inhibitors以抑

制miR-122的表达，miR-122mimics+inhibitor组先转染miR-122mimics,再转染miR

-122inhibitors,用于验证miR-122功能的可逆性。每组设置3个复孔，以减少实验误

差。

复苏冻存的小鼠胚胎干细胞，将其接种于预先用0.1%明胶包被的培养皿中，加入含15%胎

牛血清、1%青链霉素混合液的DMEM高糖培养基，置于37。（2、5%CO2的培养箱中培养。

当细胞融合度达到80%・90%时，用0.25%胰蛋白酶・EDTA消化液消化传代。在细胞传代

至第3・5代时，进行转染实验。按照Lipofectamine30D0转染试剂说明书，将miR722

mimics、miR-122inhibitors及其阴性对照分别转染至小鼠胚胎干细胞中。转染前24小时，

将细胞以合适密度接种于6孔板中，使转染时细胞融合度达到50%-60%。转染时，分别将

miR-122mimics.miR-122inhibitors及其阴性对照与Lipofectamine3000试剂在Opti-

MEM培养基中混合，室温孵育5分钟，然后将两者混合液加入到细胞培养孔中，轻轻混匀，

继续培养。转染6-8小时后，更换为新鲜的完全培养基。

转染24小时后，开始进行细胞诱导分化。采用细胞因子联合诱导法，具体步骤如下。在分

化的起始阶段（第0-3天），将培养基更换为含有100（^/011.人^2由人的口乂£1^午12培养

基，诱导胚胎干细胞向中胚层细胞分化。每天更换新鲜的诱导培养基。在分化的中期阶段

（第3-8天），将培养基更换为含有20ng/mLFGF4和10ng/mLBMP4的DMEM/F12培

养基，促进中胚层细胞向肝祖细胞分化。同样每天更换新鲜培养基。在分化的后期阶段（第

8-15天），将培养基更换为含有20ng/mLHGF和10ng/mLOSM的DMEM/F12培养基，

诱导肝祖细胞向成熟肝细胞分化。在整个诱导分化过程中，每天在倒置相差显微镜下观察细

胞形态变化，并拍照记录。

4.2miR-122转染效果验证

在转染后的不同时间点（24小时、48小时、72小时），分别收集各组细胞，采用qRT-

PCH技术检测miR-122的表达水平。首先，使用1rizol试剂提取细胞总RNA,按照试剂说

明书操作，确保RNA的完整性和纯度。利用分光光度计测定RNA的浓度和纯度，保证

A260/A280比值在1.8-2.0之间。随后，按照逆转录试剂盒说明书，将RNA逆转录为

cDNAo以cDNA为模板，赁用针对miR-122的特异性弓|物和SYBRGreen荧光定量PCR

试剂盒进行qRT-PCR扩增。反应体系按照试剂盒要求配制，包括适量的cDNA模板、上下

游引物、SYBRGreenMasterMix和去离子水。反应条件为:95引预变性30秒;95℃变性

5秒，60℃退火30秒，共40个循环。在荧光定量PCR仪上进行扩增反应，实时监测荧光

信号的变化。实验设置3个复孔，并以U6作为内参基因进行标准化。

通过比较各组Ct值，采用2-AZkCt法计算miR-122的相对表达量。结果显示，在miR-

122mimics组，转染24小时后miR-122的表达水平开始显著升高，48小时达到峰值，相

较于对照组，miR722的相对表达量增加了约［X］倍；72小时时，miR-122的表达水平虽

有所下降，但仍维持在较高水平，约为对照组的［X］倍。这表明miR-122mimics能够有效

转染小鼠胚胎干细胞，并实现miR-122的过表达°在miR・122inhibitors组,转染24小时

后miR-122的表达水平明显降低，48小时和72小时时，miR-122的相对表达量分别降至

对照组的凶％和［X］%,说明miR-122inhibitors能够成功抑制miR-122的表达。而在

miR-122mimics.inhibitor组，先转染miR-122mimics使miR.122表达升高，再转染

miR-122inhibitors后，miR・122的表达水平又显著下降，恢复到接近对照组的水平，验证

了miR-122功能的可逆性。

为了进一步验证转染效果的稳定性，在转染后第7天再次检测miR-122的表达水平。结果

发现，miR-122mimics组中miR-122的表达仍维持在较高水平，为对照组的［X］倍；miR

-122inhibitors组中miR-122的表达依然显著低于对照组，为对照组的凶％。这表明miR

-122的转染效果在较长时间内具有稳定性，能够满足后续实验对miR-122表达调控的需

求。

4.3对分化细胞形态和功能的影响

在诱导分化过程中，通过倒置相差显微镜密切观察细胞形态的动态变化。在分化的起始阶段，

对照组和各实验组细胞均呈现出胚胎干细胞的典型形态，细胞呈圆形或椭圆形，核质比大，细

胞间连接松散。随着诱导的进行，在中胚层分化阶段，对照组细胞逐渐开始聚集，形态变为

梭形，呈现出中胚层细胞的特征。miR722mimics组细胞聚集更为明显，细胞形态的变化

更为迅速，梭形细胞的比例更高；而旧区-122同351。年组细胞的形态变化相对缓慢，聚集

程度较低，梭形细胞的出现时间延迟。在肝祖细胞分化阶段，对照组细胞进一步增殖，形成

上皮样细胞集落，细胞形态变为多边形。miR-122mimics组细胞集落更为紧密，多边形细

胞的形态更为规则，细胞间连接更加紧密；miR-122inhibitors组细胞集落的形成受到抑

制，细胞形态不规则，细胞间连接相对松散。在成熟肝细胞分化阶段，对照组细胞逐渐出现

肝细胞的典型形态，如细胞呈多角形，胞质丰富，可见明显的细胞核和核仁。miR-122

mimics组细胞的肝细胞形态更为典型，细胞内可见丰富的细胞器，糖原颗粒增多；miR・122

inhibitors组细胞虽然也能分化为肝细胞，但细胞形态的成熟度较差，细胞器发育不完善，糖

原颗粒较少。

为了深入探究miR-122对分化细胞功能的影响，对各组分化细胞进行了尿素合成功能检

测。将分化15天的细胞培养在含有氨的培养基中，培养48小时后，采用尿素检测试剂盒检

测培养基中尿素的含量。结果显示，对照组细胞能够合成一定量的尿素，培养基中尿素含量

为［X］mmol/L。miR-122mimics组细胞的尿素合成能力显著增强，培养基中尿素含量达到

［X］mmol/L,相较于对照组增加了约凶％,表明过表达miR-122能够有效促进分化细胞的

尿素合成功能。而miR-122inhibitors组细胞的尿素合成能力明显减弱，培养基中尿素含量

仅为凶mmol/L,相较于对照组降低了约凶%,说明抑制miR-122的表达会损害分化细胞

的尿素合成功能。在miR-122mimics+inhibitor组，先过表达miR-122使尿素合成能力

增强，再抑制miR-122后，尿素合成能力又下降，恢复到接近对照组的水平，进一步验证了

miR-122对尿素合成功能的调控作用具有可逆性。

通过糖原PAS染色检测各组分化细胞的糖原储存功能。分化15天的细胞经糖原PAS染色

后，在显微镜下观察。对照组细胞中可见少量紫红色的糖原颗粒，表明具有一定的糖原储存能

力。miR-122mimics组细胞内的糖原颗粒明显增多，颜色更为鲜艳，分布更为均匀，显示

出过表达miR-122能够显著增强分化细胞的糖原储存功能。miR-122inhibitors组细胞内

的糖原颗粒稀少，染色较浅，说明抑制miR-122的表达会导致分化细胞的糖原储存功能受

损。在miR-122mimics+inhibitor组，细胞内糖原颗粒的变化与尿素合成功能的变化趋势

一致，先增多后减少，再次验证了miR722对糖原储存功能的调控作用是可逆的。

4.4对分化相关基因和蛋白表达的影响

为了深入探究miR-122对小鼠胚胎干细胞向肝细胞分化过程中基因表达的调控作用，采用

RT-PCR技术检测了不同分化阶段肝特异性基因的表达变化。在分化的起始阶段，检测中胚

层标志物Brachyury的表达。结果显示，miR-122mimics组中Brachyury的mRNA表达水

平显著高于对照组，在分化第3天，miR-122mimics组Brachyury的mRNA表达量相较于

对照组增加了约［X］倍;而miR-122inhibitors组中Brachyury的表达明显低于对照组，仅

为对照组的［X］%。这表明miR-122能够促进胚胎干细胞向中胚层细胞分化，上调中胚层标

志物的表达。

在肝祖细胞分化阶段，检测甲胎蛋白(AFP)的表达。miR-122mimics组中AFP的mRNA

表达水平在分化第8天达到高峰，旦明显高于对照组，为对照组的［X］倍;miR-122

inhibgrs组中AFP的表达则显著低于对照组，仅为对照组的凶％。这说明miR-122对肝

祖细胞的分化和增殖具有促进作用，能够上调肝祖细胞标志物的表达。

在成熟肝细胞分化阶段，检测白蛋白(ALB)、细胞角蛋白18(CK18)等成熟肝细胞标志物

的表达。在分化第15天，miR-122mimics组中ALB和CK18的mRNA表达水平分别为对

照组的凶倍和凶倍，显著高于对照组；而miR-122inhibitors组中ALB和CK18的表达

明显低于对照组，分别为对照组的［X］%和［X］%。这充分表明miR-122能够有效促进肝祖

细胞向成熟肝细胞的分化，上调成熟肝细胞标志物的表达。

运用Westernblot技术进一步检测分化相关蛋白的表达情况。提取分化15天的各组细胞总

蛋白，经SDS-PAGE电泳分离后，转至PVDF膜上，依次进行封闭、孵育一抗(抗ALB抗

体、抗AFP抗体、抗CK18抗体等)、孵育二抗，最后利用ECL化学发光试剂盒显色，在

化学发光成像系统下观察并拍照。结果显示，miR・122mimics组中ALB、AFP、CK18蛋

白的表达水平明显高于对照组，蛋白条带亮度更强；miR722inhibitors组中这些蛋白的表

达水平则显著低于对照组，蛋白条带亮度较弱。通过ImageJ软件对蛋白条带进行灰度分

析，定量比较各组蛋白表达水平的差异。结果表明，miR-122mimics组中ALB蛋白的相对

表达量相较于对照组增加了约［X］%,AFP蛋白增加了凶％,CK18蛋白增加了［X］%;而

miR-122inhibitors组中ALB蛋白的相对表达量仅为对照组的［X］%,AFP蛋白为［X］%,

CK18蛋白为[X]%。这与RT-PCR检测结果一致，进一步证实了miR-122对分化相关蛋

白表达具有显著的调控作用，能够促进肝特异性蛋白的表达，推动小鼠胚胎干细胞向肝细胞的

分化进程。

五、miR-122调控小鼠胚胎干细胞向肝细胞分化的机制探讨

5.1靶向调控的