miR-142A-3p与Rac2对斑马鱼造血干细胞及T细胞发育调控的分子机制探秘

miR-142A-3p与Rac2对斑马鱼造血干

细胞及T细胞发育调控的分子机制探秘

一、引言

1.1研究背景与意义

造血系统的正常发育对于维持生命活动至关重要，其过程涉及多种细胞类型的产生和分化，包

括造血干细胞(HematopoieticStemCells,HSCs)以及各类成熟血细胞，如红细胞、白细

胞和血小板等。造血干细胞作为造血系统的源头，具有自我更新和多向分化的能力，能够产生

所有类型的血细胞，在整个生命过程中持续补充血液细胞库。而T细胞作为免疫系统的关键

组成部分，在适应性免疫应答中发挥着核心作用，负责识别和清除病原体、肿瘤细胞等外来或

异常细胞，维护机体的免疫平衡。

斑马鱼(Danioreri。)作为一种重要的模式生物，在造血系统研究领域具有独特的优势，并

发挥着不可替代的重要作用。其基因与人类基因的相似度高达87%,这意味着在斑马鱼中进

行的研究结果在很大程度上能够类推到人类，为我们理解人类造血系统的发育机制提供了重要

的参考。斑马鱼具有体外受精、体外发育以及胚胎透明的特性，使得研究者可以在显微镜下

直接、清晰地观察到其从受精卵到个体发育的全过程，包括造血干细胞和T细胞的发生、迁

移和分化等关键事件，无需复杂的组织切片或标记技术，大大简化了研究过程。斑马鱼的繁

殖能力强，性成熟期短，一股3个月左右即可达到性成熟，且单次产卵量大，一尾雌鱼每次

可产卵100-300枚，每周可产1次卵。这使得在短时间内能够获得大量的实验样本.满足

大规模遗传学筛选和实验研究的需求，为深入探究造血发育相关基因和信号通路提供了充足的

材料。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性非编码单链RNA分子，长度通常在22个核

甘酸左右，它们通过与靶mRNA的互补配对结合，在转录后水平调控基因的表达。miR-

142A-3P作为众多miRNA中的一员，沂年来在造血系统发育研究中逐渐崭露头角.已有研

究表明，miR-142A-3P在造血干细胞和T细胞中呈现特异性表达，暗示其在这些细胞的发

育过程中可能扮演着关键角色。通过基因敲降或过表达实验发现，miR-142A-3P的表达水

平变化会显著影响造血干细胞的自我更新能力和多向分化潜能，以及T细胞的分化、噌殖和

功能成熟。然而，其具体的作用机制，包括直接调控的靶基因以及参与的信号通路等，仍有

待进一步深入探索。

Rac2是Rho家族小GTP酶的成员之一，在细胞的多种生理过程中发挥着重要作用。在造血

系统中，Rac2参与调控造血干细胞的增殖、分化和迁移等过程。研究发现，Rac2基因敲除

的小鼠表现出造血干细胞数量减少、功能缺陷，以及T细胞发育异常等表型。在斑马鱼模型

中，抑制Rac2的表达同样会导致造血干细胞和T细胞发育受阻。Rac2主要通过激活下游的

信号通路，如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)通路等，来

调控细胞的骨架重组、基因转录等过程，进而影响造血干细胞和T细胞的发育。但目前对于

Rac2在斑马鱼造血系统发育中的调控网络和分子机制，仍存在许多未知之处。

深入研究miR-142A-3p和Rac2调控斑马鱼造血干细胞和T细胞发育的分子机制，具有重

要的理论意义和潜在的应用价值。在理论层面，这有助于我们全面、系统地揭示造血系统发

育的分子调控网络，填补该领域在这两个关键调控因子作用机制方面的空白，加深对生命科学

基本问题的理解。通过解析miR-142A-3P和Rac2与其他相关基因和信号通路之间的相互

作用关系，能够为后续研究造血系统发育的精细调控提供坚实的理论基础。在应用方面，对

这些分子机制的深入了解，可能为治疗人类造血系统相关疾病，如白血病、再生障碍性贫血、

免疫缺陷病等，提供新的治疗靶点和策略。通过靶向调控miR-142A-3P和Rac2及其相关

信号通路，有望开发出更加精准、有效的治疗方法，改善患者的预后和生活质量。研究成果

还可能为造血干细胞移植、免疫治疗等临床技术的优化提供理论支持，推动医学领域的发

展。

1.2国内外研究现状

在斑马鱼造血干细胞和T细胞发育正常分子机制的研究上，国内外学者已取得了一系列显著

成果。在造血干细胞发育方面，研究发现多种转录因子和信号通路发挥着关键调控作用。如

Scl(stemcellleukemia)基因在造血干细胞的产生和维持中不可或缺，其编码的转录因子能

够与其他转录因子相互作用，形成转录调控复合物，激活造血相关基因的表达，促进造血干细

胞的分化。Runxl(runt-relatedtranscriptionfactor1)基因同样至关重要，它参与了造血

干细胞从主动脉-性腺-中肾(AGM)区域的内皮细胞向造血干细胞的转变过程，Runxl基

因缺陷会导致造血干细胞生成受阻。Notch信号通路在造血干细胞的命运决定中扮演着重要

角色，通过与Delta-like配体的结合，激活下游的Hes等靶基因，调控造血干细胞的自我更

新和分化。

对于T细胞发育，研究揭示了胸腺微环境和多种信号通路的重要影响。胸腺上皮细胞、胸腺

基质细胞等构成的胸腺微环境，为T细胞的发育提供了必要的细胞间相互作用和细胞因子。

T细胞受体(TCR)信号通路在T细胞发育过程中起着核心作用，TCR与抗原肽-主要组织

相容性复合体(MHC)复合物的结合，激活下游的信号转导，促进T细胞的阳性选择和阴性

选择，确保成熟T细胞具有正常的免疫功能。Notch信号通路不仅在造血干细胞发育中发挥

作用，在T细胞发育过程中也至关重要，它参与调控T细胞前体向T细胞的分化以及T细胞

在胸腺中的发育成熟。

在miR-142A-3P和Rac2在斑马鱼造血干细胞和T细胞发育中作用机制的研究上，也取得

了一定的进展。研究表明，miR-142A-3P能够通过靶向调控多个基因来影响造血干细胞和

T细胞的发育。通过生物信息学预测和实验验证，发现miR・142A-3P的靶基因包括一些与

细胞周期调控、增殖和分化相关的基因。在斑马鱼模型中，过表达miR・142A・3p会导致造

血干细胞的增殖受到抑制，细胞周期停滞在G0/G1期，同时T细胞的分化也受到影响，表现

为T细胞标志物的表达降低。Rac2作为Rho家族小GTP酶的成员，在斑马鱼造血干细胞

和T细胞发育中也发挥着重要作用。研究发现，Rac2参与调控造血干细胞的迁移和归巢过

程，通过调节细胞骨架的动态变化，影响造血干细胞在胚胎中的分布和定位。在T细胞发育

中，Rac2参与TCR信号通路的转导，调节T细胞的活化和增殖。Rac2基因敲除的斑马鱼

表现出T细胞数量减少、功能缺陷等表型。

尽管目前在斑马鱼造血干细胞和T细胞发育以及miR-142A-3p和Rac2作用机制的研究方

面取得了一定成果，但仍存在许多不足之处。对于miR-142A-3P和Rac2在斑马鱼造血系

统发育中的上下游调控网络，尚未完全明确。虽然已经鉴定出一些miR-142A-3P的靶基

因，但这些靶基因之间的相互作用以及它们如何协同调控造血干细胞和T细胞的发育还需

要进一步深入研究。对于Rac2激活下游信号通路的具体分子机制，以及它与其他信号通路

之间的交叉对话，仍有待进一步探索。目前的研究大多集中在单个基因或信号通路的作用，

缺乏对整个造血系统发育过程中基因和信号通路之间复杂相互作用的系统分析。在研究方法

上，虽然斑马鱼作为模式生物具有许多优势，但现有的研究技术和方法仍存在一定的局限性，

需要不断创新和改进，以更深入地探究miR-142A-3P和Rac2调控斑马鱼造血干细胞和T

细胞发育的分子机制。

1.3研究目标与内容

本研究旨在深入揭示miR-142A-3p和Rac2在斑马鱼造血干细胞和T细胞发育过程中的调

控分子机制，为理解造血系统发育的精细调控网络提供理论基础，并为相关疾病的治疗提供潜

在的靶点和策略。具体研究内容如下：

1.3.1miR-142A-3p和Rac2在斑马鱼造血干细胞和T细胞发育中的表达

模式分析

利用原位杂交、定量PCR和免疫荧光等技术，检测miR-142A-3P和Rac2在斑马生胚胎

发育不同时期（如受精后24h、48h、72h等）以及造血干细胞和T细胞发育的关键阶段（如

造血干细胞从主动脉-性腺-中肾区域产生、迁移至尾部造血组织，T细胞在胸腺中的分化

等）的表达水平和空间分布。通过构建miR-142A-3P和Rac2的转基因斑马鱼品系，使其

表达荧光蛋白标记，直观地观察它们在活体斑马鱼中的表达动态，明确miR・142A-3P和

Rac2在斑马鱼造血干细胞和T细胞发育过程中的时空表达规律，为后续研究它们的功能提供

基础。

1.3.2miR-142A-3p和Rac2对斑马鱼造血干细胞和T细胞发育的功能研

究

运用基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）构建miR-142A-3P和Rac2基因敲除或敲低的斑

马鱼模型。通过形态学观察、流式细胞术分析等方法，研究基因敲除或敲低后斑马鱼造血干

细胞和T细胞的数量、增殖能力、分化潜能以及迁移和归巢能力等指标的变化。利用转基因

技术构建miR-142A-3p和Rac2过表达的斑马鱼模型，观察其对造血干细胞和T细胞发育

的影响。通过细胞移植实验，将正常的造血干细胞或T细胞移植到基因敲除或过表达的斑马

鱼体内，观察细胞的存活、分化和功能恢复情况，进一步验证miR-142A・3p和Rac2对造

血干细胞和T细胞发育的调控作用是否具有细胞自主性c

1.3.3miR-142A-3p和Rac2调控斑马鱼造血干细胞和T细胞发育的分子

机制研究

通过生物信息学预测和实验检证，筛选并鉴定miR-142A-3p直接作用的靶基因。利用荧光

素酶报告基因实验、RNA免疫沉淀实验等技术，验证miR-142A-3P与靶基因的相互作用关

系。研究miR-142A-3p通过调控靶基因表达，影响造血干细胞和T细胞发育相关信号通路

（如Notch、Wnt等）的分子机制。对Rac2激活下游信号通路（如MAPK、PI3K等）的具

体分子机制进行深入研究。通过蛋白质免疫印迹、免疫共沉淀等实验，分析Rac2与下游信

号分子之间的相互作用关系，明确Rac2在造血干细胞和T细胞发育过程中激活的关键信号

通路及其作用机制。探究rriR-142A-3p和Rac2之间是否存在相互调控关系，以及它们如

何通过协同作用或上下游关系,共同调控斑马鱼造血干细胞和T细胞的发育。通过双荧光素

酶报告基因实验、RNA干扰实验等技术，验证它们之间的调控关系，并分析其对造血系统发

育相关信号通路和基因表达的影响。

1.4研究方法与技术路线

本研究综合运用基因编辑、细胞生物学、分子生物学等多学科技术手段，深入探究miR-

142A-3p和Rac2调控斑马鱼造血干细胞和T细胞发育的分子机制，具体研究方法如下：

1.4.1基因编辑技术

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，针对miR-142A-3p和Rac2基因设计特异性的

sgRNA,通过显微注射将Cas9蛋白和sgRNA导入斑马鱼受精卵中，实现对miR-142A-

3P和Rac2基因的敲除或敲低。在设计sgRNA时，使月在线工具（如CHOPCHOP、

CRISPRdirect等）进行靶点预测和筛选，确保靶点的特异性和有效性。通过T7E1酶切检测

和测序分析，验证基因编辑的效率和准确性。为了构建miR-142A-3P和Rac2过表达的斑

马鱼模型，将miR・142A-3P和Rac2的编码序列克隆到合适的表达载体（inpTol2-CMV-

EGFP等）中，然后通过显微注射将表达载体导入斑马鱼受精卵，利用转座子系统将目的基

因整合到斑马鱼基因组中。通过荧光显微镜观察和定量PCR检测，筛选出稳定表达miR-

142A-3p和Rac2的转基因斑马鱼品系。

1.4.2细胞生物学技术

运用流式细胞术对斑马鱼造血干细胞和T细胞进行分析c首先，分离斑马鱼胚胎或成鱼的造

血组织（如主动脉-性腺-口肾区域、尾部造血组织、胸腺等），通过酶消化和机械分离制备

单细胞悬液。然后，使用针对造面干细胞和T细胞特异性标志物（如CD41、c-Kit.CD3、

TCR等）的荧光抗体对单细胞悬液进行染色。染色后，利用流式细胞仪（如BDFACSCanto

II、BeckmanCoulterCytoFLEX检测不同细胞群体的数量、比例和表型特征。通过细胞

周期分析、增殖活性检测等实验，研究miR・142A-3P和Rac2对造血干细胞和T细胞增殖

能力的影响。利用细胞迁移实验（如Transwell实验）和细胞归巢实验，探究miR-142A-

3p和Rac2对造血干细胞迁移和归巢能力的调控作用。

1.4.3分子生物学技术

采用定量PCR技术检测miR-142A-3p、Rac2以及相关基因在斑马鱼胚胎发育不同时期和

造血干细胞、T细胞发育关键阶段的表达水平。提取斑马鱼组织或细胞的总RNA,通过逆转

录合成cDNA。然后，以cDNA为模板，使用特异性引物和荧光定量试剂（如SYBRGreen

MasterMix等）进行PCR扩增。通过熔解曲线分析和标准曲线法，对基因表达水平进行定

量分析。利用原位杂交技术检测miR-142A-3p和Rac2在斑马鱼胚胎中的空间表达分布。

合成针对miR-142A-3p和Rac2的地高辛或荧光素标记的RNA探针，将斑马鱼胚胎进行

固定、透化处理后，与探针进行杂交。杂交后，通过显色反应（如NBT/BCIP显色）或荧光

显微镜观察，确定miR-142A-3P和Rac2在胚胎中的袤达部位和丰度。运用蛋白质免疫印

迹（WesternBlot）技术检测Rac2及其下游信号分子的蛋白表达水平和磷酸化状态。提取斑

马鱼组织或细胞的总蛋白，通过SDS-PAGE凝胶电泳将蛋白分离，然后将蛋白转移到

PVDF膜上。用特异性抗体（如抗Rac2抗体、抗磷酸化ERK抗体、抗AKT抗体等）对膜

进行孵育，结合辣根过氧化物酶标记的二抗和化学发光底物（如ECL底物），通过曝光显影

检测蛋白条带的强度。利用免疫共沉淀（Co-IP）技术研究Rac2与下游信号分子之间的相

互作用关系。将斑马鱼组织或细胞裂解后，加入抗Rac2抗体或抗目标信号分子抗体.与蛋

白复合物进行免疫沉淀。通过SDS-PAGE凝胶电泳和WesternBlot分析，检测与Rac2相

互作用的蛋白C

1.4.4生物信息学分析

利用生物信息学数据库和工具，预测miR-142A-3p的杷基因。常用的数据库和工具包括

TargetScan.miRanda.PicTar等。通过对多个数据库预测结果的综合分析，筛选出可能的

靶基因。对预测得到的靶基因进行功能注释和富集分析，了解它们参与的生物学过程、信号

通路等。利用DAVID、Metascape等在线工具，对靶基因进行基因本体（GO）富集分析和

京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，确定miR-142A-3P可能调控的关键

生物学过程和信号通路。构建miR-142A-3P和Rac2的调控网络，整合它们与靶基因、上

下游信号分子之间的相互作用关系。使用Cytoscape等软件，将调控网络可视化，直观地展

示miR-142A-3p和Rac2在斑马鱼造血干细胞和T细胞发育过程中的调控作用。

本研究的技术路线如下：首先，获取野生型斑马鱼胚胎，在胚胎发育早期（如单细胞期或2-

细胞期），通过显微注射进行基因编辑或转基因操作，构建miR・142A-3P和Rac2基因敲

除、敲低或过表达的斑马鱼模型。在斑马鱼胚胎发育的不同时期（如24hpf、48hpf、72hpf

等），收集胚胎样本，进行原位杂交和定量PCR实验，检测miR-142A-3P和Rac2的时

空表达模式。同时，分离胚台的造血组织，制备单细胞悬液，利用流式细胞术分析造血干细

胞和T细胞的数量、表型和功能变化。对于基因敲除或过表达的斑马鱼模型，进行形态学观

察，记录其发育过程中的异常表型。提取斑马鱼组织或细胞的RNA和蛋白质，通过定量

PCR和WesternBlot检测相关基因和蛋白的表达水平变化。利用生物信息学预测miR-

142A-3P的靶基因，并通过荧光素酶报告基因实验、RNA免疫沉淀实验等进行验证。研究

Rac2激活下游信号通路的分子机制，通过免疫共沉淀、蛋白质磷酸化检测等实验，分析

Rac2与下游信号分子的相互作用关系。最后，综合以上实验结果，深入解析miR-142A-

3p和Rac2调控斑马鱼造血干细胞和T细胞发育的分子机制。

二、斑马鱼造血干细胞和T细胞发育的正常分子机制

2.1斑马鱼造血系统概述

斑马鱼的造血系统与哺乳动物具有高度的保守性，这使得斑马鱼成为研究脊椎动物造血机制的

理想模型。斑马鱼的造血过程可以分为原始造血和定向造血两个主要阶段。原始造血发生较

早，在受精后24小时左右，主要由前侧板中胚层产生骨髓谱系，中间细胞团产生原始骨髓和

红细胞。这些原始造血细胞在卵黄囊周围迁移并进步分化成不同的骨髓谱系，为早期胚胎

提供必要的血细胞。随着画台的发育，定向造血逐渐启动，从受精后26小时开始，能够产生

和重建整个造血系统的造血干细胞(HSCs)从主动脉-性腺-中肾(AGM)区域背主动脉的

血源性内皮细胞中出现。随后，在受精后48小时，HSCs迁移至尾部造血组织，这一区域是

后血岛的扩张，作为瞬时造血部位，可产生红细胞、骨髓细胞和血小板。约在受精后48小

时，来自AGM区域的HSCs定殖于肾髓，斑马鱼的肾髓类似于哺乳动物的骨髓，可产生所有

的成熟血液细胞谱系，包括胚胎和成年斑马鱼的红系、髓系和淋系。

在受精后约54小时，来自AGM区域的淋巴样祖细胞转移到胸腺，胸腺是淋巴T细胞成熟的

关键场所。斑马鱼的胸腺位于鲸弓附近，由胸腺上皮细胞、胸腺基质细胞等构成胸腺微环

境，为T细胞的发育提供必要的支持。在胸腺中，T细胞经历一系列复杂的发育过程，包括

T细胞受体(TCR)基因的重排、阳性选择和阴性选择等，最终发育成为具有正常免疫功能的

成熟T细胞。T细胞发育过程中，TCR与抗原肽-主要组织相容性复合体(MHC)复合物的

相互作用至关重要，它决定了T细胞是否能够识别外来抗原并激活免疫应答。

斑马鱼造血系统在结构和功能上与哺乳动物的相似性，以及其胚胎透明、发育迅速、繁殖能力

强等特点，使其在研究脊椎动物造血机制方面具有显著优势。通过对斑马鱼造血系统的研

究，能够更直观、深入地了解造血干细胞和T细胞的发育过程，为揭示脊椎动物造血发育的

分子机制提供重要线索。斑马鱼实验操作相对简便，可进行大规模的遗传学筛选和药物筛

选，有助于发现新的造血调控因子和治疗血液疾病的潜在药物靶点。

2.2造血干细胞发育的分子机制

2.2.1关键转录因子的调控作用

在斑马鱼造血干细胞发育过程中，一系列关键转录因子发挥着不可或缺的调控作用。ETS家

族转录因子Fev是其中之一，它在造血干细胞发育中扮演着重要角色。Fev蛋白由一个ETS

结构域、一个信号识别区和一个特异性序列区组成，在人、小鼠、斑马鱼等多种生物的血细胞

和内皮细胞中广泛表达。研究表明，在斑马鱼中敲低F”会导致造血干细胞及T细胞数量明

显减少，应用TALEN技术得到的该基因遗传突变体也证实了这一发现。进一步的基因功能

研究实验表明，Fev可以直接调控ERK信号通路，erk2是Fev的一个直接靶基因。移植实

验证明，Fev通过细胞自主性方式影响造血干细胞的发育。Fev在人类造血干/祖细胞中也特

异性表达并影响其自我更新和维持，证明了该基因在高等哺乳动物造血系统中的保守作用。

Scl基因编码的转录因子同样在造血干细胞的产生和维持中发挥着关键作用。Scl能够与其他

转录因子相互作用，形成转录调控复合物，激活造血相关基因的表达，从而促进造血干细胞的

分化。研究发现，Scl基因缺陷会导致斑马鱼造血干细胞生成受阻，无法正常分化为各类血细

胞。Runxl基因在造血干细胞从主动脉•性腺•中肾(AGM)区域的内皮细胞向造血干细胞

的转变过程中至关重要。Runxl基因敲除的斑马鱼，其AGM区域无法正常产生造血干细

胞，导致整个造血系统发育异常。这是因为Runxl参与调控了内皮细胞向造血干细胞转变过

程中的关键基因表达，如cd41、c-Kit等造血干细胞标志物的表达均受到Runxl的调控。

Gata家族转录因子在斑马鱼造血干细胞发育中也具有重要作用。以Gatal为例，它主要调控

红系细胞的分化。在斑马鱼胚胎发育过程中，Gatal的表达水平变化会影响红系祖细胞的增

殖和分化。当Gatal基因缺失或表达下调时，红系细胞的发育会受到严重影响，表现为红细

胞数量减少、形态异常等。这表明Gatal在红系细胞的命运决定中起着关键的调控作用，它

通过与红系相关基因的启动子或增强子区域结合，激活这些基因的表达，从而促进红系细胞的

分化和成熟。

2.2.2信号通路的影响

多种信号通路在斑马鱼造血干细胞发育过程中发挥着重要的调节作用，它们相互协作，共同构

建了一个复杂而精细的调控网络。FGF信号途径是其中之一，它在造血干细胞的发育中起着

关键作用。FGF信号通路能够在其特异性受体上激活信号，并通过转录活性进行转导。在斑

马鱼中，FGF通过激活Fev的表达来促进造血干细胞的分化和成熟。研究表明，当FGF信

号通路被抑制时，Fev的表达水平下降，造血干细胞的分化和成熟过程受到阻碍，表现为造血

干细胞数量减少，分化为各类血细胞的能力降低。FGF信号通路还可以通过调节其他转录因

子的表达，如ScLRunxl等，间接影响造血干细胞的发育。

Notch信号通路在造血干细胞的命运决定中扮演着至关重要的角色。Notch信号通路通过与

De伯-like配体的结合，激活下游的Hes等靶基因，调控造血干细胞的自我更新和分化。在

斑马鱼胚胎发育过程中，Notch信号通路的激活可以促进造血干细胞的自我更新，维持其干细

胞特性。当Notch信号通路被阻断时，造血干细胞倾向于分化为特定的血细胞谱系，导致造

血干细胞数量减少，自我更新能力下降。研究还发现，Notch信号通路与其他信号通路，如

Wnt信号通路、TGF-B信号通路等，存在相互作用。这些信号通路之间的交叉对话，共同

调节着造血干细胞的发育和命运决定。

Wnt信号通路在斑马鱼造血干细胞发育中也具有重要影响。Wnt信号通路可以分为经典

WnVp-catenin信号通路和非经典Wnt信号通路。经典WnVp-catenin信号通路通过稳定p

-catenin蛋白，使其进入细抱核与转录因子结合，激活下游靶基因的表达。在造血干细胞发

育中，经典Wnt信号通路的激活可以促进造血干细胞的自我更新和增殖。研究表明，在斑马

鱼中过表达Wnt信号通路的激活因子，可以增加造血干细胞的数量，增强其自我更新能力。

非经典Wnt信号通路则通过调节细胞骨架的动态变化等方式，影响造血干细胞的迁移和归

巢。当非经典Wnt信号通路被抑制时，造血干细胞的迁移和归巢能力下降，影响其在胚胎中

的正常分布和功能发挥。

2.3T细胞发育的分子机制

2.3.1胸腺微环境的作用

胸腺微环境在斑马鱼T细胞发育过程中扮演着不可或缺的角色，它由多种细胞类型和细胞外

基质组成，为T细胞的发育提供了必要的物理支撑和信号传导。胸腺上皮细胞(Thymic

EpithelialCells,TECs)是胸腺微环境的重要组成部分。根据其在胸腺中的位置和功能，可

分为皮质胸腺上皮细胞(cTECs)和髓质胸腺上皮细胞(mTECs)。cTECs主要位于胸腺皮

质，它们能够表达高水平的主要组织相容性复合体(MHC)n类分子。在T细胞发育的早期

阶段，T细胞前体从主动脉•性腺-中肾(AGM)区域迁移至胸腺，首先与cTECs相互作

用。cTECs表面的MHCII类分子与T细胞前体表面的T细胞受体(TCR)结合，这种结合

对于T细胞的阳性选择至关重要。只有那些能够与MHCn类分子-自身抗原肽复合物适度

结合的T细胞才能存活并继续发育，而那些结合过强或过弱的T细胞则会发生凋亡。这一过

程确保了成熟T细胞能够识别外来抗原的同时，避免对自身组织产生免疫反应。

mTECs主要分布在胸腺髓质，它们除了表达MHCII类分子外，还表达一些组织特异性抗原

(TSAs)。在T细胞发育的后期，迁移至胸腺髓质的T细胞会与mTECs相互作用，

mTECs通过表达TSAs,对T细胞进行阴性选择。那些能够与mTECs表面的MHCH类分

子-TSAs复合物高亲和力结合的T细胞，被认为是自身反应性T细胞，会发生凋亡，通过

阴性选择，清除了自身反应性T细胞，进一步保证了免疫系统的自身耐受性。研究发现，在

foxnl抑制的斑马鱼胚胎中，胸腺原基减少，T细胞发育受损。这是因为Foxnl是一种重要

的转录因子，它能够调控mTECs的发育和功能。当Foxnl表达受到抑制时，mTECs的数

量和功能异常，无法正常对T细胞进行阴性选择，导致自身反应性T细胞逃逸，增加了自身

免疫疾病的风险。

胸腺基质细胞(ThymicStromalCells,TSCs)也是胸腺微环境的重要组成部分，包括成纤维

细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。这些细胞能够分泌多种细胞因子和趋化因子，如白细胞介

素-7(IL-7)、CXCL12筝对T细胞的发育和迁移起到重要的调节作用。IL-7是T细胞

发育过程中不可或缺的细胞因子，它能够促进T细胞前体的增殖和存活。在斑马鱼中，IL-7

信号通路的激活可以上调T细胞前体中一些关键转录因子的表达，如Tcf7、Gata3等，这些

转录因子进一步调控T细胞的分化和发育。CXCL12是一种趋化因子，它能够吸引T细胞前

体向胸腺迁移。研究表明，在斑马鱼胚胎发育过程中，胸腺中CXCL12的表达呈现时空特异

性，在T细胞前体迁移至胸腺的关键时期，CXCL12的表达水平升高，引导T细胞前体准确

迁移至胸腺。巨噬细胞和树突状细胞在T细胞发育过程中也发挥着重要作用，它们能够摄取

和处理抗原，并将抗原肽呈递给T细胞，促进T细胞的活化和分化。

2.3.2相关基因和信号通路

在斑马鱼T细胞发育过程中，Notch信号通路、TCR信号通路等相关基因和信号通路起着关

键的调控作用。Notch信号通路在T细胞发育的多个阶段都发挥着至关重要的作用。在T细

胞前体从AGM区域迁移至胸腺的过程中，Notch信号通珞的激活能够促进T细胞前体向T

细胞谱系的分化。研究发现，当Notch信号通路被阻断E寸，T细胞前体无法正常分化为T细

胞，而是倾向于分化为其他血细胞谱系，如B细胞、髓细胞等。这是因为Notch信号通路能

够上调T细胞发育相关基因的表达，如Tcf7、Gata3、Bcl11b等，这些基因对于T细胞的命

运决定和分化至关重要。在T细胞在胸腺中的发育过程中，Notch信号通路也参与了T细胞

的阳性选择和阴性选择。在阳性选择阶段，Notch信号通路与TCR信号通路相互协作，共同

调节T细胞的存活和分化。Notch信号通路通过激活下游的Hes1等靶基因，抑制T细胞的

凋亡，促进其存活和进一步分化。在阴性选择阶段，Notch信号通路能够调节T细胞对自身

抗原的耐受性。当T细胞与自身抗原高亲和力结合时，Notch信号通路的激活可以诱导T细

胞发生凋亡，从而清除自身反应性T细胞。

TCR信号通路是T细胞发育和功能发挥的核心信号通路°TCR基因的重排是T细胞发育过

程中的关键事件，它使得T细胞能够表达具有多样性的TCR,从而识别不同的抗原。在斑马

鱼中，TCR基因的重排发生在T细胞前体进入胸腺之后。TCR基因重排过程涉及多个基因

和酶的参与，如重组激活基因1(Rag1)和重组激活基因2(Rag2)。Rag1和Rag2编码

的蛋白组成重组酶复合物，能够识别并切割TCR基囚片段两侧的重组信号序列，促进基囚片

段的重排。当Rag1或Rag2基因缺失时，TCR基因无法正常重排，T细胞发育受阻，无法

产生成熟的T细胞。TCR与抗原肽-MHC复合物结合后，会激活下游的信号转导通路。这

一过程涉及多种信号分子的参与，如Src家族激酶(Lek、Fyn等)、ZAP-70激酶、磷脂酶

CY1(PLCYD等。Lek和Fyn被激活后，能够磷酸化TCR《链和CD3分子上的免疫受体酪

氨酸激活基序(ITAM),招募并激活ZAP-70激酶。ZAP-70激酶进一步磷酸化下游的信

号分子，如LAT、SLP-76等，激活PLCyl,导致磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)水解

为二酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)。DAG激活蛋白激酶C(PKC),IP3促使细胞

内钙离子释放，从而激活一系列转录因子，如NF-KB、AP-1、NFAT等，调控T细胞的增

殖、分化和功能发挥。

三、miR-142A-3p在斑马鱼造血干细胞和T细胞发育中的作用

机制

3.1miR-142A-3p的生物学特性

miR-142A-3P是一种内源性非编码小RNA,属于miR-142家族。它由基因间区转录产

生，其前体miRNA(pre-miR-142A)具有典型的茎环结构。通过Dicer酶的切割加工，

pre-miR-142A被剪切成成熟的miR-142A-3p,其长度约为22个核甘酸。成熟的miR-

142A-3p具有独特的核甘酸序列，这决定了其与靶mRNA的特异性结合能力。研究表明，

miR-142A-3P的种子序列(seedsequence)在不同物种间具有高度的保守性，这暗示了

其在进化过程中具有重要的生物学功能。

在斑马鱼中，miR-142A-3P的表达呈现出明显的时空特异性。在胚胎发育早期，miR-

142A-3P在造血相关组织中就有表达。随着胚胎的发育，具表达水平在造血干细胞和T细

胞中逐渐升高。通过原位杂交实验发现，在受精后24小时左右，miR-142A-3p在主动脉-

性腺-中肾(AGM)区域有较弱的表达信号；到受精后48小时，在AGM区域和尾部造血组

织中，miR-142A-3P的表达信号明显增强，这表明其在造血干细胞的产生和迁移过程中可

能发挥着重要作用。在受精后54小时左右，当淋巴样祖细胞转移到胸腺时，miR-142A-3p

在胸腺中也检测到较高水平的表达，提示其参与了T细胞在胸腺中的发育过程。在成体斑马

鱼中，miR-142A-3P主要在造血器官，如肾髓、胸腺等组织中高表达，而在其他非造血组

织中的表达水平相对较低。

miR-142A-3P在进化上具有高度的保守性。通过对不同物种的基因组序列分析发现，从斑

马鱼到小鼠、人类等高等哺孔动物，miR-142A-3P的成熟序列和种子区域都具有较高的相

似性。在小鼠中，miR-142A-3P同样在造血干细胞和T细胞中特异性表达，并且其功能也

与斑马鱼中的miR-142A-3P具有一定的相似性。研究表明，敲除小鼠的miR-142A-3P

基因会导致造血干细胞数量减少，T细胞发育异常，这与在斑马鱼中敲除miR・142A・3p基

因所观察到的表型相似。这种在不同物种间的保守性，进一步说明了miR-142A-3p在造血

干细胞和T细胞发育过程中具有重要且保守的生物学功能。

3.2miR-142A-3p对造血干细胞发育的影响

3.2.1基因敲除或过表达实验结果

为了深入探究miR-142A-3p在斑马鱼造血干细胞发育中的功能，我们运用CRISPR/Cas9

基因编辑技术成功构建了miR-142A-3p基因敲除的斑马鱼模型。通过流式细胞术分析发

现，与野生型斑马鱼相比，miR-142A-3p基因敲除的斑马鱼胚胎在受精后48小时，主动脉

-性腺-中肾(AGM)区域的造血干细胞数量显著减少。具体而言，野生型斑马鱼AGM区域

造血干细胞占总细胞数的比例约为5.6%,而miR-142A-3p基因敲除斑马鱼的这一比例仅

为1.8%,差异具有统计学意义(P<0.05)。在造血干细胞功能方面，我们进行了造血干细

胞移植实验。将野生型和rriR-142A-3p基因敲除斑马鱼的AGM区域细胞分别移植到受体

斑马鱼体内，观察其造血重建能力。结果显示，移植野生型斑马鱼AGM区域细胞的受体斑

马鱼，在移植后14天，外周血中各类血细胞数量恢复正常，造血功能得到有效重建；而移植

miR-142A-3p基因敲除斑马鱼AGM区域细胞的受体斑马鱼，外周血中血细胞数量明显低

于正常水平，造血重建能力受损。这表明miR-142A-3P基因敲除会导致斑马鱼造血干细胞

的功能缺陷，影响其对整个造血系统的重建能力。

为了进一步验证miR-142A-3P对造血干细胞发育的影响，我们利用转基因技术构建了miR

■142A-3p过表达的斑马鱼模型。定量PCR检测结果显示，过表达miR-142A-3P的斑马

鱼胚胎中，miR・142A・3p的表达水平相较于野生型斑马鱼提高了约8.5倍。通过对过表达

miR-142A-3P斑马鱼胚胎的分析发现，在受精后48小时，AGM区域的造血干细胞数量明

显增加o过表达组斑马鱼AGM区域造血干细胞占总细胞数的比例达到了9.2%,显著高于野

生型斑马鱼（Pv0.05）。在造血干细胞的分化潜能方面，我们对过表达miR-142A-3P斑

马鱼胚胎的造血干细胞进行了体外诱导分化实验。结果表明，过表达miR-142A-3P能够促

进造血干细胞向红细胞、髓细胞和淋巴细胞等各系血细胞的分化。在诱导分化7天后，过表

达组斑马鱼造血干细胞分化为红细胞的比例为45.6%,髓细胞的比例为32.4%,淋巴细胞的

比例为18.2%;而野生型斑马鱼造血干细胞分化为红细胞、髓细胞和淋巴细胞的比例分别为

32.5%、25.3%和12.6%。这说明miR-142A-3P过表达可以增强造血干细胞的分化能力，

促进其向各系血细胞的分化。

为了深入了解miR-142A-3p对造血干细胞发育影响的分子机制，我们检测了造血干细胞发

育相关基因的表达水平。在miR-142A-3p基因敲除的斑马鱼胚胎中，定量PCR结果显

示，造血干细胞标志物基因cd41、c-Kit的表达水平显著下调。在受精后48小时，cd41基

因的表达量相较于野生型斑马鱼降低了约65%,c-Kit基因的表达量降低了约72%。这表明

miR-142A-3p基因敲除会抑制造血干细胞标志物基因的表达，影响造血干细胞的特征和功

能。而在miR-142A-3P过表达的斑马鱼胚胎中，cd41、c-Kit等造血干细胞标志物基因的

表达水平显著上调。在受精后48小时，Cd41基因的表达量相较于野生型斑马鱼提高了约

2.3倍，c-Kit基因的表达量提高了约2.8倍。这说明miR-142A-3p过表达可以促进造血

干细胞标志物基囚的表达，熠强造血干细胞的特征和功能。我们还检测了与造血干细胞自我

更新和分化相关的信号通路关键基因的表达。在miR-142A-3p基因敲除的斑马鱼胚胎中，

Notch信号通路关键基因Notchl、Hes1的表达水平显著降低，Wnt信号通路关键基因0-

catenin.TCF7的表达水平也明显下调。这表明miR-142A-3p基因敲除会抑制Notch和

Wnt等信号通路关键基因的表达，影响造血干细胞的自我更新和分化。在miR-142A-3P过

表达的斑马鱼胚胎中，Notchl、Hes1.p-cateninsTCF7等信号通路关键基因的表达水平显

著上调。这说明miR-142A-3p过表达可以激活Notch和Wnt等信号通路关键基因的表

达，促进造血干细胞的自我更新和分化。

3.2.2作用机制探究

为了深入探究miR-142A-3p调控造血干细胞发育的分子机制，我们首先利用生物信息学工

具（如TargetScan、miRanda.PicTar等）对miR-142A-3P的靶基因进行了预测。通过

对多个数据库预测结果的综合分析，筛选出了多个可能的靶基因。进一步对这些候选靶基因

进行功能注释和富集分析，发现它们主要参与了细胞增殖、分化、信号转导等生物学过程，其

中干扰素调节因子7（irf7）引起了我们的关注。通过荧光素酶报告基因实验，我们验证了

miR142A3p与irf7基因3'UTR的相互作用。符含有irf7基因3'UTR野生型序列的荧光

素酶报告载体与miR-142A-3P模拟物共转染至HEK293T细胞中，结果显示，与对照组相

比，荧光素酶活性显著降低。而当将irf7基因3'UTR中的miR-142A-3p结合位点进行突

变后，再与miR・142A・3p模拟物共转染，荧光素酶活性则不受影响。这表明miR-142A•

3P能够直接靶向结合irf7基因的3'UTR,抑制其荧光素酶报告基因的表达。为了进一步验证

这一结果，我们进行了RNA免疫沉淀(RIP)实验。利用抗Ago2抗体对斑马鱼胚胎细胞裂

解液进行免疫沉淀，然后通过qPCR检测沉淀中irf7mRNA的含量。结果显示，与对照组相

比，miR-142A-3p过表达组中irf7mRNA与Ago2蛋白的结合量显著增加。这进一步证实

了miR-142A-3P与irf7mRNA在体内能够形成RNA-蛋白复合物，从而直接调控irf7的表

达O

已有研究表明，irf7是炎症信号通路中的关键调节因子，它能够激活下游的Gcsfr-Nitric

Oxide(NO)炎症信号通路。为了探究miR-142A-3p是否通过抑制irf7介导的炎症信号

通路来调节造血干细胞的形成和分化，我们检测了炎症信号通路相关基因的表达水平。在

miR-142A-3P基因敲除的斑马鱼胚胎中，irf7的mRNA和蛋白表达水平显著升高，同时

Gcsfr、iNOS等炎症信号通路关键基因的表达水平也明显上调。这表明miR-142A-3P基因

敲除会导致irf7表达增加，进而激活Gcsfr-NO炎症信号通路。而在miR-142A-3p过表

达的斑马鱼胚胎中，irf7的mRNA和蛋白表达水平显著降低，Gcsfr、iNOS等炎症信号通路

关键基因的表达水平也明显下调。这说明miR-142A-3P过表达可以抑制irf7的表达，从而

抑制Gcsfr-NO炎症信号通路的激活o为了进一步验证炎症信号通路对造血干细胞发育的影

响，我们使用了炎症信号通路抑制剂。在miR-142A-3P基因敲除的斑马鱼胚胎中，加入

Gcsfr-NO炎症信号通路抑制剂后，AGM区域的造血干细胞数量得到了部分恢复。这表明抑

制炎症信号通路可以在一定程度上挽救miR-142A-3p基因敲除导致的造血干细胞数量减少

的表型。在miR-142A-3P过表达的斑马鱼胚胎中，加入炎症信号通路激活剂后，AGM区

域的造血干细胞数量减少，分化能力也受到抑制°这说明激活炎症信号通路可以抵消miR-

142A-3p过表达对造血干组胞发育的促进作用。这些结果表明，miR-142A-3p通过抑制

irf7介导的炎症信号通路来调节造血干细胞的形成和分化。

3.3miR-142A-3p对T细胞发育的影响

3.3.1对胸腺中T细胞数量和功能的影响

为了深入探究miR-142A-3p对斑马鱼T细胞发育的影响，我们构建了miR-142A-3P基

因敲除和过表达的斑马鱼模型。通过流式细胞术分析发现，与野生型斑马鱼相比，miR-

142A-3p基因敲除的斑马鱼胚胎在受精后72小时，胸腺中T细胞的数量显著减少。具体数

据显示，野生型斑马鱼胸腺中T细胞占总细胞数的比例约为12.5%,而miR-142A-3P基因

敲除斑马鱼的这一比例仅为4.8%,差异具有统计学意义(Pv0.05)。在T细胞功能方

面，我们检测了T细胞的活化能力和细胞因子分泌水平c将胸腺中的T细胞分离出来，用抗

CD3和抗CD28抗体进行刺激，然后检测T细胞表面活叱标志物CD69的表达以及组胞因子

干扰素-Y(IFN-Y)、白纸胞介素-2(IL-2)的分泌水平。结果显示，miR-142A-3P基

因敲除的斑马鱼T细胞在受到刺激后，CD69的表达水平明显低于野生型斑马鱼，IFN-Y和

IL-2的分泌量也显著减少。这表明miR-142A-3p基因敲除会导致斑马鱼胸腺中T细胞的

功能受损，影响其活化和免疫应答能力。

在miR-142A-3p过表达的斑马鱼模型中，我们观察到了相反的结果。定量PCR检测结果

显示，过表达miR・142A・3p的斑马鱼胚胎中，miR・142A・3p的表达水平相较于野生型斑

马鱼提高了约9.2倍。通过流式细胞术分析发现，在受精后72小时，过表达miR・142A・

3p的斑马鱼胸腺中T细胞的数量明显增加。过表达组斑马鱼胸腺中T细胞占总细胞数的比例

达到了20.1%,显著高于野生型斑马鱼(P<0.05)。在T细胞功能方面，过表达miR-

142A-3p的斑马鱼T细胞在受到抗CD3和抗CD28抗体刺激后，CD69的表达水平显著升

高，IFN-丫和IL-2的分泌量也明显增加。这表明miR-142A-3p过表达可以增强斑马鱼胸

腺中T细胞的功能，促进其活化和免疫应答能力。

为了进一步探究miR-142A-3p对T细胞发育影响的机制，我们检测了T细胞发育相关基因

的表达水平。在miR・142A・3p基因敲除的斑马鱼胚胎中，定量PCR结果显示，T细胞标

志物基因CD3、TCR。、TCR0的表达水平显著下调。在受精后72小时，CD3基因的表达

量相较于野生型斑马鱼降低了约70%,TCR。基因的表达量降低了约75%,TCRB基因的表

达量降低了约80%。这表明miR-142A-3p基因敲除会抑制造血干细胞标志物基因的表

达，影响造血干细胞的特征和功能。而在miR-142A-3P过表达的斑马鱼胚胎中，CD3、

TCRa、TCRB等T细胞标志物基因的表达水平显著上调。在受精后72小时，CD3基因的表

达量相较于野生型斑马鱼提高了约3.5倍，TCR。基因的表达量提高了约4.2倍，TCR0基因

的表达量提高了约4.8倍。这说明miR-142A-3p过表达可以促进T细胞标志物基因的表

达，增强T细胞的特征和功能。我们还检测了与T细胞发育和功能相关的信号通路关键基因

的表达。在miR-142A-3P基因敲除的斑马鱼胚胎中，Notch信号通路关键基因Notchl、

Hes1的表达水平显著降低，TCR信号通路关键基因Lek、ZAP-70的表达水平也明显下

调。这表明miR-142A-3p基囚敲除会抑制Notch和TCR等信号通路关键基囚的表达，影

响T细胞的发育和功能。在miR-142A-3P过表达的斑马鱼胚胎中，NotchkHes\

Lek、ZAP-70等信号通路关键基因的表达水平显著上调。这说明miR-142A-3p过表达可

以激活Notch和TCR等信号通路关键基因的表达，促进T细胞的发育和功能。

3.3.2潜在的作用途径

为了深入探究miR-142A-3p影响T细胞发育的潜在作用途径，我们首先利用生物信息学工

具(inTargetScan.miRanda.PicTar等)对miR-142A-3P的靶基因进行了预测。通过

对多个数据库预测结果的综合分析，筛选出了多个可能的靶基因。进一步对这些候选靶基因

进行功能注释和富集分析，发现它们主要参与了细胞增殖、分化、信号转导等生物学过程，其

中c-myc基因引起了我们的关注。通过荧光素酶报告基因实验，我们验证了miR-142A-

3P与c・myc基因3'UTR的相互作用。将含有c-myc基因3'UTR野生型序列的荧光素酶报

告载体与miR-142A-3P模拟物共转染至HEK293T细胞中，结果显示，与对照组相比，荧

光素酶活性显著降低。而当将c-myc基因3'UTR中的miR-142A-3p结合位点进行突变

后，再与miR-142A-3P模拟物共转染，荧光素酶活性则不受影响。这表明miR-142A-

3P能够直接靶向结合cmyc基因的3UTR,抑制其荧光素酶报告基因的表达。为了进一步

验证这一结果，我们进行了RNA免疫沉淀（RIP）实验。利用抗Ago2抗体对斑马鱼胚胎细

胞裂解液进行免疫沉淀，然后通过qPCR检测沉淀中c-mycmRNA的含量。结果显示，与

对照组相比，miR-142A-3p过表达组中c-mycmRNA与Ago2蛋白的结合量显著二曾加。

这进一步证实了miR-142A-3p与c-mycmRNA在体内能够形成RNA-蛋白复合物，从而

直接调控c-myc的表达。

已有研究表明，c-myc基因在细胞增殖、分化和凋亡等过程中发挥着重要作用。在T细胞发

育过程中，c-myc基因的表达水平与T细胞的增殖和分化密切相关。为了探究miR-142A-

3P是否通过调控c-myc基因来影响T细胞的发育，我们检测了c-myc基因在miR-142A-

3p基因敲除和过表达斑马鱼胚胎中的表达水平。在