《人肺癌恶性胸腔积液类器官培养技术规程（征求意见稿）》

ICS11.100CCSC0532TechnicalspecificationfororganoidcultureofhumanmalignantpleuraleffusionDB32/TXXXX—XXXXI前言 2规范性引用文件 3术语和定义 4原理 5要求 6试剂与设备 7实验步骤 8结果评价 9培养记录与报告 附录A（资料性）类器官培养质量体系管理要求 参考文献 DB32/TXXXX—XXXX本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省卫生健康委员会提出并组织实施。本文件由江苏省卫生健康标准化技术委员会归口。本文件起草单位：江苏省肿瘤医院本文件主要起草人：尹荣、王洁、左祥林、游静、孙梦婷、杜玉昕、施蕴函、王航、刘世怡、陈仁清、项进、戴立玲、屈芫、刘美静、薛冰洁。DB32/TXXXX—XXXX1人肺癌恶性胸腔积液类器官培养技术规程本文件确立了人肺癌恶性胸腔积液类器官的制备、培养、传代、冻存、复苏和鉴定等技术规范，并给出了相应的操作方法和质量控制要求。本文件适用于科研院所、医疗机构、制药企业等开展人肺癌恶性胸腔积液类器官的培养、研究及应2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB39707医疗废物处理处置污染控制标准GB/T38736人类生物样本保藏伦理要求GB/T37864生物样本库质量和能力通用要求GB/T43459洁净室及受控环境中细胞培养操作技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。人肺癌恶性胸腔积液HumanMalignantPleuralEffusion由人肺癌转移至胸膜引起的胸腔积液，其特征是胸膜腔内液体异常积聚，并在胸液样本或胸膜活检组织中发现肿瘤细胞。3.2人肺癌恶性胸腔积液类器官HumanMalignantPleuralEffusion-derivedOrganoids源自人肺癌恶性胸腔积液的肿瘤细胞在体外三维培养条件下形成的在细胞特性、病理学特征、分子特征等方面与肺癌组织或细胞相近的类器官。注：本文件所指类器官均为人肺癌恶性胸腔积液类器官。3.3三维培养基底水凝胶3DCultureBasementMembraneMatrix组成成分包括但不限于层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，添加物包括但不限于生长因子、小分子化合物和/或微量元素、激素。在37℃培养条件下能够聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜结构和功能，能够为人肺癌恶性胸腔积液中的肿瘤细胞生长提供支架。3.4传代PassageDB32/TXXXX—XXXX2通过酶消化或机械吹打等方式，将处于对数生长期的类器官解离为细胞簇悬液，并重新接种于培养体系中以形成新一代类器官的过程。3.5冻存Cryopreservation将类器官与冻存液混合，通过程序性降温或其它方法在超低温环境下（如液氮）长期保存，并保持其细胞活性的技术。3.6复苏Recovery使类器官细胞从低温环境的休眠状态恢复生长活力的过程。3.7类器官活性OrganoidViability类器官保持存活状态的能力，包括细胞代谢活跃和正常增殖等指标。4原理利用人肺癌恶性胸腔积液来源的肿瘤细胞，在体外三维培养条件下，通过添加特定生长因子和信号通路调节剂，诱导细胞自我组装形成具有原发肿瘤组织学结构、细胞组成和关键生物学功能的三维微组织（类器官），用于部分模拟体内肿瘤微环境，开展相关科学研究和临床转化。5要求5.1环境与人员要求5.1.1所有操作应在符合GB19489要求的相应生物安全等级实验室中进行。5.1.2操作区域应保持洁净，避免污染。细胞培养相关操作的环境控制与洁净要求宜参照GB/T43459执行。5.1.3操作人员应具备细胞生物学、医学或相关专业背景，并接受过无菌操作、生物安全及类器官培养技术的专门培训。有持续的培训及详细的培训记录。5.2样本要求5.2.1样本应为通过胸腔穿刺术从确诊肺癌伴恶性胸腔积液的患者体内获取的新鲜积液。5.2.2样本的采集和使用应符合伦理要求，并获得捐赠者的知情同意（附录A执行应符合GB/T38736和GB/T37864的规定。样本采集前宜筛查捐赠者既往病史、家族史、传染病报告等信息，以预防传染性疾病传播。5.2.3样本离体后应尽快完成预处理，或置于无菌容器中，在0~4℃条件下保存和运输，且应避免冻结。样本自离体至完成预处理总时长不宜超过8h（如果超过8h，不建议继续培养类器官）。5.3质量体系管理要求类器官培养全过程管理应符合附录A的规定。6试剂与设备DB32/TXXXX—XXXX3类器官完全培养基（见表1）、DPBS（Dulbecco’sPhosphateBufferedSaline）、重组胰蛋白酶样酶（TrypLE）、基质胶（如Matrigel基质胶）、无血清细胞冻存液、淋巴细胞分离液Ficoll、红细胞裂解液、0.4%台盼蓝染液等。表1.恶性胸腔积液类器官完全培养基推荐组成成分--N2NogginA83-01Y-27632N-AcetylcysteineNicotinamide注1：培养基具体配方和添加因子浓度可根据类器官生长特性进行优化，所有试剂应无菌、无支原体污6.2耗材24孔或其它规格细胞培养板、15mL和50mL无菌离心管、无菌巴氏吸管、无菌吸头（各种规格）、细胞冻存管、100μm细胞筛等。6.3设备生物安全柜、二氧化碳细胞培养箱、倒置相差显微镜、常温及低温离心机、37℃恒温水浴锅、组织脱水机、石蜡包埋机、石蜡切片机、-80℃低温冰箱、液氮储存罐、微量移液器、血细胞计数板或自动细胞计数仪等。7实验步骤所有操作应在生物安全柜内严格遵守无菌操作规程进行。DB32/TXXXX—XXXX47.2样本预处理7.2.1采集50~200mL的恶性胸腔积液，由于样本可能含有纤维蛋白凝块或组织碎片，建议在初步离心前使用100μm细胞筛过滤样本，以去除大颗粒杂质，获得细胞悬液，从而提高后续类器官的培养成功率。若样本中免疫细胞成分较多，可使用淋巴细胞分离液Ficoll梯度离心后，取最下层肿瘤细胞进行培养。7.2.2将过滤后的恶性胸腔积液样本分装至50mL无菌离心管中，于4℃、300g离心力条件下离心5min，实现细胞沉淀与积液上清的分离。7.2.3收集离心后的上清液，转移至新的无菌50mL离心管，再通过0.22μm滤膜过滤，完成除菌及微小细胞碎片的清除；过滤后的上清液可置于-80℃冰箱保存备用（用于后续共培养实验使用前需再次1400rpm/min离心5min。7.2.4向7.2.2中的细胞沉淀加入10~20mL预冷的DPBS，轻柔重悬细胞沉淀。在相同条件下（4℃、300g，5min）再次离心，弃上清。若细胞沉淀因红细胞过多而呈明显红色，可重复此洗涤步骤2-3次，或根据红细胞裂解液的产品说明书进行操作，之后需用DPBS充分洗涤以彻底去除裂解液。7.3类器官接种与培养7.3.1弃去上清，加入适量于冰上或4℃预冷的基质胶（推荐1×10⁵个细胞与50μL基质胶混合），用预冷的枪头轻柔吹打混匀，避免产生气泡。7.3.2使用预冷的枪头，吸取30~50μL基质胶-细胞混合物，滴加至预热的24孔培养板孔中央，使其形成穹顶状液滴。7.3.3随后将培养板倒置于37℃培养箱中静置15~30min，使基质胶完全聚合。7.3.4待基质胶聚合后，沿孔壁缓慢加入500μL预热的类器官完全培养基。轻轻将培养板放回37℃、5%CO₂的细胞培养箱中开始培养。7.3.5根据类器官的生长速度与培养基颜色变化（如酚红指示剂变黄，pH低于6.8~7.0），定期更换培养液。通常建议每2~3d更换一次新鲜培养基。更换时，小心吸弃旧培养基，避免破坏基质胶穹顶，然后加入等量预温的新鲜类器官完全培养基。7.4类器官传代7.4.1当类器官平均直径生长至100~300μm、密度过高、培养基迅速变黄或培养超过7d时，应进行传代。7.4.2吸弃旧培养基，每孔加入500μLDPBS轻柔吹打，收集4~6个孔的类器官悬液至一个15mL离心管中。7.4.3将离心管于4℃静置8~10min，使类器官自然沉降。随后在4℃、300g条件下离心5min，弃上清。7.4.4加入3倍体积的重组胰蛋白酶样酶（TrypLE）工作液，置于37℃水浴中消化2~5min，期间可轻柔晃动，直至肉眼可见的类器官团块基本消失。7.4.5加入3倍体积的AdvancedDMEM/F12终止消化，在室温、300g条件下离心5min，弃上清。7.4.6用1mLAdvancedDMEM/F12重悬细胞沉淀并再次离心，共洗涤1~2次，以彻底去除消化酶。7.4.7弃上清，用适量预冷基质胶重悬最终的细胞沉淀，按7.3.2步骤重新接种于新的预热的培养板中。建议每10~14天传代一次，传代比例约为1:2~1:4。注：基质胶重悬过程中，避免出现气泡。24孔板可提前于37℃培养箱预热15~20min。接种孔板时，优先接种于中间孔位置，边缘孔加入500μL的PBS，可减少类器官培养液的蒸发。7.5类器官冻存DB32/TXXXX—XXXX57.5.1选择处于对数生长期、形态良好的类器官，按7.4.2~7.4.6步骤消化收集细胞沉淀。7.5.2用预冷的适用于类器官的无血清细胞冻存液重悬细胞沉淀，并调整密度至5~10×105/mL（或500-1000个类器官/管）。7.5.3将细胞悬液分装至冻存管中，每管1.0~1.5mL。7.5.4将冻存管放入程序性降温盒中，置于-80℃冰箱。24h后，转移至液氮气相中长期保存。7.6类器官复苏7.6.1准备一个15mL离心管，内含10mL预温（37℃)的类器官基础培养基或完全培养基。7.6.2从液氮中取出目标冻存管，迅速转移至37℃水浴中，轻柔晃动，使其在1~2min内完全解冻。7.6.3用无菌吸管将解冻的细胞悬液缓慢滴加至含预温培养基的15mL离心管中，轻轻混匀。7.6.4在室温、300g条件下离心5min，弃上清。7.6.5用1mL预温的基础培养基重悬细胞沉淀，再次离心洗涤一次。7.6.6弃上清，按7.3.2步骤用基质胶重悬细胞沉淀并进行接种培养。7.7类器官培养过程中的分析与质控在进行类器官的传代培养时，建议每培养5代对其进行系统性鉴定，至少包括形态学、细胞活性和组织学特征分析。8结果评价8.1形态学评价类器官形成后，可使用倒置光学显微镜进行定期形态学观察。生长状态良好的类器官在20倍物镜视野下，应呈现轮廓清晰与周围基质胶背景对比明显、结构致密的三维球形或类球形结构、无大量透亮的空泡区域，折光性强。培养初期（3~5天）直径多在50~100μm，随培养时间延长可增长至100~300μm。在进行批量培养时，宜关注类器官的大小、形态和数量参数，作为质量控制参考。8.2细胞活性评价8.2.1采用台盼蓝染色或AI/PO染色/流式细胞术等方法检测活细胞比率。注：评估时，需单独制备充分消化的单细胞悬液作为检测样品。用于活性检测的样品消化程度，可能高于实际用于接种培养的类器官细胞团块悬液。8.2.2用于后续研究（如传代、冻存、药敏试验）的类器官，其活细胞比率应不低于85%。8.2.3冻存6个月内类器官，复苏后活率不低于70%；冻存大于6个月的类器官，可适当放宽标准至30-70%。注：复苏后活率指类器官解冻后、接种培养前所检测的细胞活性。8.3组织学与病理分型评价8.3.1可通过苏木素-伊红（H&E）染色初步评估类器官与患者肺癌组织或细胞是否存在相似的结构特DB32/TXXXX—XXXX6征，如细胞排列方式、极性、异型性等。8.3.2通过免疫组织化学法（IHC）检测关键病理标志物，将类器官的IHC结果与患者的病理诊断报告进行比对，评估其病理分型的一致性。注：在免疫组化层面，肺腺癌表现为TTF-1（核阳性）、NapsinA（胞质阳性）、CK7（阳性）；肺鳞癌表现为p40（核阳性）、p63（核阳性）、CK5/6（胞质阳性且TTF-1一般为阴性；小细胞肺癌则通常表现为CD56（膜阳性）、Synaptophysin（Syn，胞质颗粒状阳性）和ChromograninA（CgA，胞质颗粒状阳性）。8.3.3采用外显子测序分析，验证类器官是否保留肺癌组织或细胞关键驱动基因突变谱。9培养记录与报告9.1培养记录类器官培养全过程中应建立并保存完整的记录，内容至少包括：a)样本信息：唯一标识、供体编号、样本离体时间、临床诊断、知情同意文件编号、年龄、种族、职业、既往疾病诊疗史和药物使用情况、家族史、现有疾病治疗情况及药物反应，肿瘤分化程度、肿瘤分期、是否接受过抗肿瘤治疗等；b)操作信息：操作者、操作日期、关键步骤描述（处理、接种、传代、冻存、复苏）；c)试剂信息：培养基、基质胶、消化酶、冻存液等的名称、厂家、批号、效期；d)培养信息：培养条件（温度、CO2浓度）、换液记录、类器官生长状态（形态、大小、密度）的图像或描述、培养成功率；e)鉴定信息：各次鉴定的日期、方法、结果（图像、数据、报告）；f)储存信息：冻存位置、数量、时间、复苏记录。注：数据管理的具体要求宜参考附录A.5。9.2培养报告根据研究或应用目的，可基于培养记录形成总结性报告。报告内容至少应包括：a)类器官培养单位名称和地址；b)项目或研究名称；c)样本及供体基本信息（脱敏后）；d)类器官培养的关键流程概述和培养失败案例描述；e)类器官的质量鉴定结果与结论；f)报告编制人、审核人签字及日期。DB32/TXXXX—XXXX7（资料性）类器官培养质量体系管理要求A.1质量管理系统框架开展人肺癌恶性胸腔积液类器官培养的机构应建立并维护一个文件化的质量管理系统，以确保培养过程及其结果的一致性、可靠性和可追溯性。该系统应至少涵盖本附录所述的要求。A.2方案制定与伦理审查A.2.1方案制定在启动类器官培养项目前，应制定详细的工作方案。该方案内容应包括但不限于：a)目标与范围：明确研究或应用目的；b)操作流程：概述从样本接收到类器官鉴定的关键步骤；c)资源保障：明确人员、环境、设备与试剂的要求；d)风险评估与生物安全：识别潜在风险（如生物、化学、物理危害）并制定相应控制措施和应急预案，应符合GB19489的要求；e)质量控制计划：规定关键过程监控点、类器官验收标准及鉴定频率；f)数据管理计划：规定数据记录、存储、备份及隐私保护措施；g)废弃物处理流程：规定各类废弃物的分类、灭活与处置方法。A.2.2伦理审查与知情同意A.2.2.1所有涉及人类样本的研究必须事先获得获得所在机构伦理审查委员会的批准。A.2.2.2样本采集必须在捐赠者或其法定代理人充分知情并自愿的前提下进行，并签署书面的知情同意书。知情同意书的内容应符合GB/T38736的要求，并应明确样本及衍生数据的使用范围（包括未来相关研究），以及捐赠者有权随时、无条件退出研究的权利。A.2.2.3应对捐赠者的个人信息和样本信息进行严格保密，采取匿名化或编码等保护措施。若研究涉及收集捐赠者的后续临床信息，应在知情同意书中予以明确说明。A.3人员与培训A.3.1所有操作和管理人员应具备相应的教育背景和专业能力。A.3.2上岗前及定期应接受以下方面的培训，并保留培训记录：a)无菌操作技术；b)类器官培养与鉴定专项技术；c)生物安全知识与应急预案演练；d)质量管理体系文件与标准操作规程（SOP）；e)伦理规范与样本隐私保护要求。A.4环境、设备与试剂管理DB32/TXXXX—XXXX8A.4.1培养与操作环境应在符合GB19489要求的生物安全实验室内进行。实验室应根据操作风险进行必要的功能分区，至少区分为样本处理区、核心操作区和鉴定分析区，并制定分区管理规程。应定期对各区域进行清洁消毒，并可根据需要监测环境洁净度。生物安全柜、超净工作台、通风橱等设备应定期进行性能验证、维护并保存记录。进行类器官培养、接种、传代等核心无菌操作时，对环境洁净度的控制应参照GB/T43459的相关规定。a)样本处理区：样本的离心、洗涤等开放操作，应在能有效控制潜在生物风险的生物安全柜内进行；通常，宜采用不低于二级（BSL-2）的生物安全柜。b)核心操作区：类器官的无菌操作（如接种、传代）应在二级生物安全柜或超净工作台内进行；细胞培养箱应置于洁净、稳定、无强气流干扰的环境中。c)鉴定分析区：显微观察可在洁净台面进行；使用有毒、挥发性试剂（如固定液）的操作应在通风橱内进行；可能产生气溶胶的操作应在生物安全柜内进行。A.4.2关键设备（如培养箱、生物安全柜、液氮罐）应定期进行校准、维护并保存记录。A.4.3所有试剂、耗材和培养基应有明确的验收程序。关键试剂（如基质胶、生长因子、血清替代物）应记录供应商、批号、效期和验收状态。A.5数据与记录管理A.5.1应建立覆盖类器官培养全周期的数据管理体系，确保数据的真实性、准确性、完整性、可追溯A.5.2记录内容至少应包括正文第9.1条规定的要求。A.5.3所有纸质和电子记录应妥善保存，规定保存期限。涉及类器官溯源的关键信息（如唯一标识、供体关联信息）应永久或长期保存（至少10年）。电子数据应有安全备份。A.5.4应制定数据访问权限管理规定，保护捐赠者隐私和敏感数据。A.5.5数据访问控制：只有经过授权的人员才能接触到可识别信息的数据库，并需签署保密协议。A.6生物安全与废弃物处理A.6.1所有操作应严格遵守GB19489的规定。A.6.2操作中产生的所有废弃物（包括培养液、耗材、废弃类器官等）均应视为感染性医疗废物。A.6.3废弃物应在产生地点进行分类，并使用防渗漏、耐穿刺的专用黄色医疗废物包装袋或容器盛装。A.6.4所有感染性废物必须在实验室内经高压蒸汽灭菌等有效方式灭活后，再按照GB39707-2020的要求，交由有资质的机构进行集中处置。应有废弃物处理记录。A.7内部质量控制与持续改进A.7.1应定期对类器官培养的关键环节和输出进行内部质量控制，包括但不限于：a)环境监测记录复核；b)设备校准与维护状态检查；c)试剂耗材的库存与效期管理；d)依据正文第8章对培养的类器官进行定期鉴定与评价；e)应建立并执行常规的微生物检测程序，如细菌污染，支原体污染等。DB32/TXXXX—XXXX9A.7.2应建立偏差和不合格品控制程序。当培养失败、鉴定结果不符或发生操作偏差时，应进行记录、调查、纠正并采取预防措施。A.7.3应定期审查质量管理体系的有效性，根据内部审计、偏差分析和技术进展，对方案和操作规程进行回顾与更新，实现持续改进。DB32/TXXXX—XXXX参考文献[1]LiuY,LankadasariM,RosieneJ,etal.Modelinglungadenocarcinomametastasesusing