CN107267454B 一种脐血nk细胞的体外扩增方法及其试剂盒与应用 （内蒙古原生元生物科技有限公司）

济技术开发区科尔沁南路69号留学人A,2015.09.23A,2015.11.25A,2012.07.18A,2012.02.15OliverNussbaumeretal.cell-dependentactivaregulatedbyγδTlymphocytes.一种脐血NK细胞的体外扩增方法及其试剂盒与应用本发明公开了一种脐血NK细胞的体外扩增细胞的体外扩增方法包括从分离的脐血单个核的纯度达90％以上，细胞总数可达1010-11个/份21)活化培养脐血NK细胞：用淋巴细胞培养基调整脐血单个核细胞密度为40℃、5％CO2饱和湿度环境中培养1～5天，收集MediumCTSTM或GMPS&XFMTM-CD细胞培养基调整细胞密度为1～3×106个/mL，再添加1～5μg/mL唑来膦酸和500～1500IU/mL重组4.根据权利要求3所述的脐血NK细胞的体外扩增方法，其特征在于：活化培养为：用A.用GMPS&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为1～3×10mL唑来膦酸和500～1500IU/mL重组人白介素-2，在36℃~38℃、5％CO2饱和湿度环境中培A1.用GMPS&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为2×106个/mL，再添加2μg/mL唑B.用GMPS&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为1～3mL唑来膦酸和500～1500IU/mL重组人白介素-2，1～100ng/mL重组人白介素-15和1~B1.用GMPS&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为2×106个/mL，再添加2μg/mL唑来膦酸和1000IU/mL重组人白介素-2、10ng/mL重组人白介素-15和10ng/mL重组人白介素-2饱和湿度环境中培养3天；3C.用GMPS&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为1mL唑来膦酸和500～1500IU/mL重组人白介素-2，1～100ng/mL重组人白介素-15和1~C1.用GMPS&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为2×106个/mL，再添加2μg/mL唑来膦酸和1000IU/mL重组人白介素-2、10ng/mL重组人白介素-15和10ng/mL重组人白介素-2饱和湿度环境中培养1天。用GMPS&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整,细胞密度为0.5～2×106个/mL，再添加500~7.根据权利要求1-5中任一项所述的脐血NK细胞的体外扩增方法，其中步骤1)使用的添加1～10μg/mL唑来膦酸和200～2000IU/mL重组人白介素-2的MediumCTSTM添加1～10μg/mL唑来膦酸和200～2000IU/mL重组人白介素-2的GMPS&XFMTM-CD淋巴细添加1～10μg/m唑来膦酸和200～2000IU/mL重组人素-15和1～100ng/mL重组人白介素-18的GMPS&XFMT9.根据权利要求1-5中任一项所述的脐血NK细胞的体外扩增方法，其中步骤2)使用的专用增殖培养基为添加200～2000IU/mL重组人白介素-2的GMPS&XFMTM-CD淋巴细胞培养10.根据权利要求9所述的脐血NK细胞的体外扩增方法，其中在所述专用增殖培养基4试剂盒与其在制备肿瘤免疫治疗药物及肿瘤免疫治疗中的应淋巴器官和外周组织中，在正常外周血中约占淋巴细胞总数的5％-10脾中占1％-2%,5衡调控，杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)组成与主要组织相容性I类(MHC-I)结合的受体家族，对调节人NK细胞的活化阈值起重要作用。最近越来越多的研究表明利用KIR受体/的新策略(LimO,JungMY,HwangYK,ShinEC:PresentandFutureofAllogeneic已经成为异源NK细胞极具前景的来源(ShaimH,YvonE:Cordblood:apromisingsourceofallogeneicnaturalkillercellsforimmunotherapy.Cytotherapy2015,17(1):(KlingemannH:Challengesofcancertherapywithnaturalkiller[0004]目前分离及扩增脐血NK细胞的方法主要有或者磁珠分选仪分选富集NK细胞，然后通过体外扩增增加NK细胞的数量和杀伤肿瘤的能力。CelgeneCellularTherapeutics公司将冻存复苏的脐带血用淋巴细胞分离液分离单纯度可达71细胞数为1.5×107/份脐血，然后通过起始培养基(包括：IMDM，10％FBS，素-2)添加滋养层细胞(丝裂霉素C处理的外周血单个核细胞和K562细胞)，37℃5％CO2200IU/mL白介素-2)培养至21天后，每一份脐血可获得CD56+CD3-NK细胞纯度>80平均细胞总数为1.2×109/份脐血(KangL,Voskinarian-BerseV,LawE,ReddinT,BhatiaM,HaririA,NingY,DongD,MaguireT,YarmushMetal:CharacterizationandexvivoExpansionofHumanPlacenta-DerivedNaturalKillerCellsforCancerCliniMACSCD34磁珠分选试剂盒分选富集CD34+造血干细胞纯度为67细胞数为3.8×6样)分化培养至35天，获得纯度>90平均数量2×109/份脐血的NK细胞(SpanholtzJ,PreijersF,TordoirM,TrilsbeekC,PaardekooperJ,deWitteT,SchaapN,DolstraH:Clinical-gradegenerationofactiveNKcellsfromcordbloodhematopoieticprogenitorcellsforimmunotherapyusingaclosed-systemcultureprocess.PloS36℃~38℃、5％CO2饱和湿度环境中培养，每隔2-3天补充新鲜培养基并调整细胞密度为[0021]所述步骤1)中的淋巴细胞培养基可为AIMVBMediumCTSTM(购自美国Life4天；活化培养更优为：用AIMMediumCTSTM淋巴细胞培养基调整细胞密度为2×106个/75μg/mL唑来膦酸和500～1500IU/mL重组人白介素-2，在36℃~38℃、5％CO2饱和湿度环境5μg/mL唑来膦酸和500～1500IU/mL重组人白介素-2，1～100ng/mL(较好1～20ng/mL)重组5μg/mL唑来膦酸和500～1500IU/mL重组人白介素-2，1～100ng/mL(较好1～20ng/mL)重组TM-CD淋巴细胞培养基调整,细胞密度为0.5(更优选1×106个/mL)，再添加500～1500IU[0028]以上所述脐血NK细胞的体外扩增方法步骤1)中使用的专用活化培养基也属于发[0032]以上所述脐血NK细胞的体外扩增方法步骤2)中使用的专用增殖培养基也属于本发明内容。该专用增殖培养基为添加200～2000IU/mL(优选1000IU/mL)重组人白介素-2的[0033]以上所述体外扩增方法收获的脐血NK细胞也属于本发明内容。该细胞纯度超过8[0034]本发明方法得到的脐血NK细胞在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用或在肿瘤免疫基或GMPS&XFMTM-CD培养基(专利申请号：201310082166.8；医疗器械备案号：京海械备[0039]3)脐血NK细胞增殖培养基：GMPS&XFMTM-CD细胞培养基(专利申请号：[0045]本发明脐血NK细胞的体外扩增方法和试剂盒将在制备肿瘤免疫治疗药物及肿瘤[0050]图5为新鲜脐血和冻存复苏脐血NK细胞体外扩增前后纯度的流式细胞仪检测结9[0055]步骤1)中的淋巴细胞培养基可为AIM最优选1000IU/mL)重组人白介素-2的AIMMediumCTSTM淋巴细胞培养添加1～10μg/mL(优选1～5μg/mL，最优选2μg/m1500IU/mL，最优选1000IU/mL)重组人白介素-2，在36℃~38℃优选1000IU/mL)重组人白介素-2的GMPS&XFMTM-CD淋巴细胞培养10μg/mL(优选1～5μg/mL，最优选2μg/mL)唑来膦酸和200～2000IU/mL(优选500～1500IU/白介素-15和1～100ng/mL(优选1～20ng/mL，最优选10ng/mL)重组人白介素-18的GMPS&~10μg/mL(优选1～5μg/mL，最优选2μg/mL)唑来膦酸和200～2000IU/mL(优选500~1500IU/mL，最优选1000IU/mL)重组人白介素-2、1～100ng/mL(优选1～20ng/mL，最优选10ng/mL)重组人白介素-15和1～100ng/mL(优选1～20ng/mL，最优选10ng/mL)重组人白介个/mL，优选1×106个/mL)，将细胞悬[0064]步骤2)中增殖培养中专用增殖培养基组成为：添加200～2000IU/mL(较优500~106个/mL，将细胞悬液接种细胞培养瓶中，再向细胞培养瓶中添加1000IU/mL重组人白介[0074]3)脐血NK细胞增殖培养基：GMPS&XFMTM-CD细胞培养基(专利申请号：[0077]实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达[0083]1.1分别取100mL的新鲜抗凝脐[0088]用AIMVSMediumCTSTM淋巴细胞培养基(购自美国LifeTechnology公司)调整单[0095]3)取20μl混合液加入Countstar(IC1000)细胞计数仪(购自上海睿钰生物科技有可根据情况在14～35天培养期内收获脐血影响不大)重组人白介素-18(购自Peprotech公司)，在37℃(36℃[0144]用实施例1中二描述的方法对从10ml冻存复苏脐带血(样本3)体外扩增的脐血NK[0148]0天脐血单个核细胞是本发明活化和扩增前的细胞(包括少量NK细胞和其它细[0160]实验以0天脐血单个核细胞(活化和扩增前的细胞)为阴性对照，以CIK细胞(一种杀伤肿瘤的免疫细胞)为阳性对照。CIK细胞的培养参照文献(Adoptiveimmunotherapywithcytokine-inducedkillercellsgeneratedwithanewgoodmanufacturingpractice-gradeprotocol.Cytotherapy,2012；EarlyOnline:1