CN107287143B 高产丁醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用 （中国科学院微生物研究所）

CGMCCNo.121912016.03.09高产丁醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建本发明公开了高产丁醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用。本发明提供的重组因组上pykA基因表达和/或活性，且提高所述出的菌A；2)在氮源不丰富的M9培养基中驯化目的且提高所述目的菌B中ter基因和crt基因的表达产物基因并加强丁醇途径基因的表达可以大幅21)抑制生产丁醇的出发菌EB216CGMCCNo.11590基因组上pykA基因表达和/或活性，所述抑制生产丁醇的出发菌基因组上pykA基因的表达和/或活性为敲除所述出发菌基所述提高所述出发菌基因组上fdh基因的表达和/或活性为增加所述出发菌基因组中所述抑制目的菌B基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表达和所述提高目的菌B中ter基因和crt基因的表达和/或活性为增加目的菌B中ter基因和所述增加出发菌基因组中fdh基因的拷贝数为将fdh基因及其启动子整合到所述出发所述提高目的菌B中ter基因和crt基因的拷贝数为将ter基因及其RBS和crt基因及其所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导所述敲除出发菌基因组上pykA基因为采用λ-red同源重组系统将所述出发菌基因组上所述将fdh基因及其启动子整合到目的菌A基因组为采用整合质粒将所述出发菌基因组上maeB基因替换为含有fdh及其启动子的片段1，且将所述出发菌基因组上位于mdh基因所述含有fdh及其启动子的片段1的核苷酸序列具体为序列23第941-2535所述含有fdh及其启动子的片段2的核苷酸序列具体为序列24第931-252所述敲除出发菌基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因部分片段为采用CRISPR所述将ter基因及其RBS整合到所述目的菌B基因组为采用CRISPR/Cas系统将含有ter3基因及其RBS的片段替换所述目的菌B基因组上y所述含有ter基因及其RBS的片段的核苷酸序列为所述采用CRISPR/Cas系统敲除yciA基因的靶基因为yci所述采用CRISPR/Cas系统敲除yciA基因的sgRNA的核苷酸序列为序列所述将crt基因及其RBS整合到目的菌B基因组为将所述含有crt基因及其RBS的片段采所述含有crt基因及其RBS的片段的核苷酸序列为所述采用CRISPR/Cas系统敲除poxB基因的靶基因为pox所述采用CRISPR/Cas系统敲除poxB基因的sgRNA的核苷酸序列为序2)-2，将2)-1得到的所述丁醇产量大于6g/L的菌株在2)-3，将2)-2得到的丁醇产量不变菌株在所述葡萄糖为7.权利要求1-4中任一所述方法或权利要求5或6所述重组菌在生产丁醇或提高丁醇产4[0002]能源与环境是当今社会关注的焦点。随着化石能源的日渐枯竭和自然环境的污在大肠杆菌中实现了丁醇的合成(AtsumiS,CannAF,ConnorMR,etal.MetabolicengineeringofEscherichiacolifor1-butanolproduction.Metabolic为还原力，催化可逆反应巴豆酰辅酶A生成丁酰辅酶A的丁酰辅酶A脱氢酶复合物(Bcd-EtfABcomplex)替换为来自齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)的催化不可逆反应的反5[0008]1)抑制生产丁醇的出发菌基因组上pykA基因表达和/或活性，且提高所述出发菌[0011]上述方法中，所述抑制生产丁醇的出发菌基因组上pykA基因的表达和/或活性为[0012]所述提高所述出发菌基因组上fdh基因的表达和/或活性为增加所述出发菌基因[0014]所述提高目的菌B中ter基因和crt基因的表达和/或活性为增加目的菌B中ter基[0016]所述提高目的菌B中ter基因和crt基因的拷贝数为将ter基因及其RBS和crt基因[0019]所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒[0020]上述方法中，所述敲除出发菌基因组上pykA基因为采用λ-red同源重组系统将所[0022]所述将fdh基因及其启动子整合到目的菌A基因组为采用整合质粒将所述出发菌基因组上maeB基因替换为含有fdh及其启动子的片段1，且将所述出发菌基因组上位于mdh基因位点的FRT替换为含有fdh及其启动[0024]所述含有fdh及其启动子的片段1的核苷酸序列具体为序列23第941-2535位核苷[0025]所述含有fdh及其启动子的片段2的核苷酸序列具体为序列24第931-2525位核苷[0026]所述敲除出发菌基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因部分片段为采用CRISPR/6[0029]所述将ter基因及其RBS整合到所述目的菌B基因组为采用CRISPR/Cas系统将含有[0033]所述将crt基因及其RBS整合到目的菌B基因组为将所述含有crt基因及其RBS的片段采用CRISPR/Cas系统替换目的菌B基因组上pox的大肠杆菌尤其具体为EB216CGMCCNo.1[0047]EB243菌已于2016年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中[0048]上述方法或上述重组菌在生产丁醇或提高丁醇产量中的应用也是本发明保护的7并加强丁醇途径基因的表达可以大幅度提高丁醇的产量。经Tn5转座子筛选且敲除或抑制筛选到的基因和驯化所得到的产丁醇菌株丁醇产量进一步提高。将其中关键酶基因进行[0071]下述葡萄糖为碳源的M9培养基的配方为：17.1g/lNa2HPO4·12H2O、3.0g/lKH2PO446H12O624[0072]葡萄糖酸为碳源的改良M9培养基为将葡萄糖为碳源的M9培养基中的葡萄糖替换H12O62O和水。因替换为FRT得到的菌，EB216已于2015年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.11590，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia8[0077]下面的实施例用的是sacB基因介导筛选的同源重组系统进行基因在染色体上的strongpromoterenablesefficientproductionofheterologousproteinsinal.EngineeringClostridiumstraintoacceptunmethylatedDNA.PLoSOne5.2[0089]以大肠杆菌BW25113基因组为模板，TGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGACGGCACC)/235-(yqhD::atoB)(GCTCGTATAATGTGTGGAATTGACGGCACCCCTACAAACAGAAGGAATATAAAATGAAA)/236-(yqhD::atoB)-4(ATCGTCTAGATTAATTCAACCGTTCAATCACCATCGCAAT)扩增出丁醇合成途径基因ato[0090]以丙酮丁醇梭菌DSM1731(购自LeibnizInstituteDSMZ-GermanCollectionof[0091](ATCGCATATGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGAATTTAGGGAGGTCTGTTTAATGAAAAAGG)/918-miniPtac-hbd-2(ATCGTCTAGATTATTTTGAATAATCGTAGAAACCTTTTC)、[0092](ATCGCATATGTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGATTTTAG)/941-[0093](GCTCGTATAATGTGTGGAATTGATTTTAGGAGGATTAGTCATGGAACTAAACAATGTC)/942-(ackA-pta)::crt-4(ATCGTCTAGACTATCTATTTTTGAAGCCTTCAATTTTTCTTTTCTC)、225-[0094](ATCGTCTAGATGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTTATAAAG)/226-[0095](CTCGTATAATGTGTGGAATTGTTATAAAGGAGTGTATATAAATGAAAGTTACAAATCA)/227-(frdBC::adhE2)-4(ATCGGTCGACTTAAAATGATTTTATATAGATATCCTTAAG)分别扩增出丁醇合成9[0096]以含有ter基因的质粒pSM2-PcpcCATATGTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGGAGGTA)/217-(adhE::ter)3b(TCGTATAATGTGTGGAATTGTGGAGGTATGATATGATTGTGAAACCCATGGTGCGCAAC)/2(ATCGTCTAGATTAAATGCGATCAAAGCGTTCCACTTCGGCTTC)扩增出丁醇合成[0097]以含有fdh基因的质粒pITF为模版，ATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTAAGAAGG)和976-fdh-2(ATGTGTGGAATTGTAAGAAGGAGATATACCATGAAGATCGTTTTAGTCTTATATGGTGC)扩增出丁醇合成途径基因GCTCGAGGGCCTTCATGCCGTCATGGATGATCATCATC)/233-(yqhD::atoB)-2(ATCGGGATCCCAGCGATTGCGCCTTTACCAAACAGAATGCG)和237-(yqhD::atoB)-5(ATCGTCTAGAGAGCACGGCATGACCCAACTGGGCGAAAATC)/238-(yqhD::atoB)-6(ATCGCTGCAGACCGGGAGAATTTGCATGTTAGCCGCCGAAC)分别扩增出基因yqhD的上游片段和下游片段；分别用引物910-ldhA-1(ATCTTACGGTCAATTGTTGACGAG)/916-ldhA-2(ATCGCATATGGTGATGTTGAATCACATTTAAGCTAC)和919-ldhA-3(ATCGTCTAGACTGGAAAAAGGCGAAACCTGCCCGAACG)/915-ldhA-4(ATCGCTGCAGTTTAGCAAATGGCTTTCTTCTGCATTTTCG)分别扩增出基因ldhA的上游片段和下游片段；分别用引物pta)::crt-2(ATCGCATATGCAGTGAAGAACTACCGCAGTTCAGAACC)和943-(ackA-ptaTCGTCTAGACCCGTGGCGCACTGGTTGACGATATCGTC)/944-(ackA-pta)::crt-6(ATCGCTGCAGAATCAGAGTGGCGATAACCCACACCACGATGC)分别扩增出基因ackA-pta的上游片段和下游片段；分别用引物223-(frdBC::adhE2)-1(ATCGGGATCCCCGAAAAACAAATATATGGAACTGGGTC)/224-(frdBC::adhE2)-2(ATCGTCTAGAGGTATCGACTTCCGGGTTATAGCGCACCAC)和228-(frdBC::adhE2)-5(ATCGGTCGACCCAGAGCCAATTATCAAAAGTCTCTGGGCGG)/229-(frdBC::adhE2)-6(ATCGAAGCTTAAACCGATACTGGAGTTGGCATACAGACGTTG)分别扩增出基因frdBC的上游片段和下游片段；分别用引物214-(adhE::ter)-1(ATCGCTCGAGCAACAACATAAAGCGAACAATGCAATAGCCAC)/5(ATCGTCTAGAGATTATGTAGAAGGTGAAACTGCAGCGAAGA)/220-(adhE::ter)-6(ATCGGTCGACGAT957-eutE::fdh-1(ATCGGAATTCCCGGAAATATTGGTTACAAAATCGCACAAC)/958-eutE::fdh-2(ATCGGGTACCGATGTTCTGCCTTATTTGTGGAAAATTACC)和977-eutE-arm2-1(ATCGGAGCTCCTGTGTATTAGTCGATGCGTTTCGCATTG)/978-eutE-arm2-2(ATCGTCTAGACCGTTGCAGATTCAGGGTATCGAACGCCTG)分别扩增出基因eutE的上游片段和ATGCACAAAGCATCTTCTGTTG)和891-Ts-2(ATCGGGATCCCATATGGAATTCCTCGAGCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGC)PCR扩增出约1.7kb的片段。使用SacI和BamHI酶切质粒pK18mobsacB[0100]上述扩增的atoB基因以BamHI和XbaI酶切位点连接在yqhD基因的上下游片段之体整合质粒；上述扩增的hbd和crt基因均以NdeI和XbaI酶切位点分别连接在ldhA和ackA-在frdBC基因的上下游片段之间，形成的新片段随后以BamHI和HindIII酶切位点连接到位点连接在eutE基因的上下游片段之间，形成的新片段随后以EcoRI和XbaI酶切位点连接pta)::miniPtac-crt3：ΔadhE::miniPtac-ter4：ΔfrdBC::miniPtac-adhE25：ΔAGGGGAATAAATGATTTCTGAAAAGTCCGG)、933-ldhA-F(CGTCCGCTGACCAGAGCGTTCTCAAGCCCTG)/934-ldhA-R(CAACCGCGCCATTACCGTCAATAGTAATCATATG)、945-ackA-pta-F(AATCCGTAACCACGCTCAATAATTGTTTGCAGG)/946-ackA-pta-R(AATCAGAGTGGCGATAACCCACACCACGATGC)、230-[0114]大肠杆菌EB205菌已于2016年1月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普[0117]pKD4记载在如下文献中inactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences97.12(2000):6640-[0118]pKD46记载在如下文献中：Datsenko,KirillA.,andBarryLinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences97.12(2000):6640-[0119]pCP20记载在如下文献中：Datsenko,KirillA.,andBarryLinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences97.12(2000):6640-[0120]下面的实施例用的是整合质粒pGFPduv8介导的同源重组系统进行基因在染色体10mmol/l的阿拉伯糖进行诱导，诱导至对数生长中期的菌体按照上述制备EB205的方法制除EB205菌株中的fdhF和hyc-[0131]以pKD4为模板，以敲除引物1074-fdhF-KoF(GTCGATAACGGCAAAATCGTCCGGGCGGAGGCAGCGCAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC)和1075-fdhF-KoR(GTCAATCACGTACTGCTCGGCGGCGCGCTGAfdhF基因下游同源臂为序列9第153[0134]将1μl上述1)制备的fdhF同源重组片段与上述一制备的EB205(pKD46)感受态细胞[0135]将中间菌作为模板，用验证引物1076-fTTG)和1077-fdhF-2(TTACGCCAGTGCCGCTTCGCGCAGGCGAG)进行PCR扩增。以EB205(pKD46)为[0136]将上述PCR产物电泳检测，得到约1.5kb片[0137]将上述fdhF替换为卡那霉素抗性基因的中间菌EB205△fdhFkan接至含50μg/ml[0140]将EB210用上述验证引物和进行菌落PCR验证，电泳验证得到300bp以下的片段即[0143]敲除hyc-hyp基因的重组菌制备方法与上述敲除fdhF基因的过程基本相同，不同[0144]重组菌EB211为将EB205基因组上的hyc-hyp基因替换为FRT(序列10第59-106位)[0147]1070-Hyd-KoF：TTGATAAACGGTTTCTACCGCATCTTTAATCGGCTGGGTCTGTAGGCTGGAGCTG[0148]1071-Hyd-KoR：ACAGCAGGGTCGTGCGTTTCAGCCCCAGACGTTGCGCAGCTGGGAATTAGCCATG[0154]按照上述制备感受态细胞的方法制备EB211和EB211(pKD46)感受态细胞，电转上[0157]以含有fdh基因的质粒pUC57-fTAACTGGAGCGAGACCGATGAAGATTGTGCTGGTGCTGTACGACGC)和1108-fdhcb-2(GTATTACGCCAGTGCCGCTTCGCGCAGGCGATTACTTCTTGTCATGCTTGCCGTAGGCC)扩增出丁醇合成[0159]以大肠杆菌BW25113基因CGGTCGATAAACAAATTGTTGCCG)/1104-fdhF-2(GCGTCGTACAGCACCAGCACAATCTTCATCGGTCTCGCTCCAGTTAATCAAATCACGC)和1105-fdhF-3(GGCCTACGGCAAGCATGACAAGAAGTAATCGCCTGCGCGAAGCGGCACTGGCGTAATAC)/1106-fdhF-4(ATCGCTGCAGGCCTGATGCGACGCTTAACGCGTCTTATC)分别[0160]以合成的DNA序列36(序列GGTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTG)和1082-GFPduv-2(ATCGGAGCTCCAGATAAAACGAAA(ATCGCTCGAGTTCTGGCGGTCGATAAACAAATTGTTGCCG)和1106-fdhF-4(ATCGCTGCAGGCCTGATGCGACGCTTAACGCGTCTTATC)进行融合PCR扩增出新的片段，该片段以XhoI和PstI酶切位点连接到整合质粒pGFPduv8中，形成染色体整合质粒。该质粒按照实施例1的电转方法电转至[0166]HPLC分析甲酸标准品的保留时间为16.8min左右，甲酸浓度的计算公式：y=[0172]分析相关代谢途径的基因，发现mdh基因编码的苹果酸脱氢酶负责催化草酰乙酸[0174]敲除mdh的重组菌制备方法与上述二中敲除fdhF基因的过程基本相同，不同的仅[0175]重组菌EB216为将EB215基因组上的mdh基因替换为FRT(序列13第59-106位)得到[0178]1032-mdh-KoF：AAAACCCAACTGCCTTCAGGTTCAGAACTCTCTCTGTATGTGTAGGCTGGAGCTG[0179]1033-mdh-KoR：CGTTTTTACCCAGCAGCAGCGGTTGAGAGAAGAAACGGGCTGGGAATTAGCCATG序列13第1453-1498位和mdh基因下游同源臂为序列13第[0194]敲除pykA基因的重组菌制备方法与实施例1的二中敲除fdhF基因的过程基本相[0195]重组菌EB222为将EB216基因组上的pykA基因替换为FRT(序列14第59-106位)得到FRT为序列14第1453-1498位和pykA基因下游同源臂为序列14第153[0206]上述构建的菌株EB222连同EB216在M9培养基中按照实施例1中一的方法发酵72小[0211]下面的实施例用的是整合质粒pGFPduv9介导的同源重组系统进行基因在染色体[0214]以实施例1的二中含有fdh基因的质粒pUC57-fdhcb为模版，用引物1399-ydfZ-fdh-1(GAAAGGATCCATTGCCATTGAGCGCAAGCAACTGGATG)/1400-ydfZ-fdh-2(GCGTCGTACAGCACCAGCACAATCTTCATAGGTGTTTTCTCCTTTCTGATTTACAGTCG)和1401-ydfZ-fdh-3(CGACTGTAAATCAGAAAGGAGAAAACACCTATGAAGATTGTGCTGGTGCTGTACGACGC)/1335-fdhcb-2(AGAATCTAGATTAC物1399-ydfZ-fdh-1(GAAAGGATCCATTGCCATTGAGCGCAAGCAACTGGATG)和1335-fdhcb-2(AGAATCTAGATTACTTCTTGTCATGCTTGCCGTAGGCCTTTG)融合PCR扩增含有启动子PydfZ的fdh基因片段1；用引物1427-ydfZ-fdh-1(ATCGGAATTCATTGCCATTGAGCGCAAGCAACTGGAfdh-2(GCGTCGTACAGCACCAGCACAATCTTCATAGGTGTTTTCTCCTTTCTGATTTACAGTCG)和1401-ydfZ-fdh-3(CGACTGTAAATCAGAAAGGAGAAAACACCTATGAAGATTGTGCTGGTGCTGTACGACGC)/1389-fdhcb-2(ATCGGGATCCTTACTTCTTGTCATGCTTGCCGTAGGCCTTTG)分别PCR扩增出DNA片段后，再以这两个片段为模板，用引物1427-ydfZ-fdh-1(ATCGGAATTCATTGCCATTGATG)/1389-fdhcb-2(ATCGGGATCCTTACTTCTTGTCATGCTTGCCGTAGGCCTTTG)融合PCR扩增含有maeB-1(AGGGCTCGAGCTTCCACCACATACGGGTCCATCGGCTTGCGTG)/1333-maeB-2(AACAGGATCCTTTCCCTGGAACTGGAAATTCATGGAAATCAAG)和1336-maeB-3(GTAATCTAGATTCTGGTGATGCCGAACATGGAAGCTGCCC)/1337-maeB-4(ATGCCTGCAGGTTAAAATATTCACCCGGCGTATCAATATCG)分别扩增出基因maeB的上游片段和下游片段；分别用引物1370-mdh-1(ATCGCTCGAGCATTAGAAACGACGGGGC)/1371-mdh-2(ATCGGAATTCTTATTATATTGATAAACTAAGATATGTTGC)和1372-mdh-3(ATCGGGATCCGTATGCTGGATACGCTGAAGAAAGATATCG)/1373-mdh-4(ATCGTCTAGAATCATGGATCAACGCGGTTATATCATCACC)分别扩增出基因mdh的上游片段和下游[0215]以pR6Kan(购自Biomedal公司)ATCGATGAATTGCTTCGTTAATACAG)和1223-R6K-2(ATCGCTCGAGATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGAC)PCR扩增出R6Kori片段，该片段与质粒pGFPduv8共同使用SacI和XhoI酶[0216]上述扩增的的fdh基因片段1以BamHI和XbaI酶切位点连接在maeB基因的上下游片[0217]经过测序，染色体整合质粒1为将序列23所示的片段插入pGFPduv9整合质粒的[0218]序列23所示的片段包括maeB基因上游同源臂(序列23第1-940位核苷酸)、含有启动子PydfZ的fdh基因片段1(序列23第941-2535位核苷酸)和maeB基因下游同源臂(序列23[0219]上述扩增的fdh基因片段2以EcoRI和BamHI酶切位点连接在mdh基因的上下游片段[0220]经过测序，染色体整合质粒2为将序列24所示的片段插入pGFPduv9整合质粒的子PydfZ的fdh基因片段2(序列24第931-2525位核苷酸)和mdh基因下游同源臂(序列24第[0222]上述染色体整合质粒1电击转化到大肠杆菌EB222中，电击转化参数为：电压生长出的菌落进行PCR验证筛选双交换突变体，鉴定引物为1332-maeB-1(AGGGCTCGAGCTTCCACCACATACGGGTCCATCGGCTTGCGTG)/1337-maeB-4(ATGCCTGCAGGTTAAAATATTCACCCGGCGTAT[0223]经过测序，大肠杆菌EB223为将含有启动子PydfZ的fdh基因片段1(序列23第941-2535位核苷酸)替换大肠杆菌EB222基因组中的maeB基因(核苷酸序列为序列30)得到的重[0225]经过测序，大肠杆菌EB225为将含有启动子PydfZ的fdh基因片段2(序列24第931-2525位核苷酸)替换大肠杆菌EB222基因组中的位于mdh[0227]经过测序，大肠杆菌EB228为将含有启动子PydfZ的fdh基因片段2(序列24第931-2525位核苷酸)替换大肠杆菌EB223基因组中的mdh基因(核苷酸序列为序列11)得到的重组[0236]还原力利用的增强则有可能会促进丁醇合成能力的增强期望获得还原力利用能力增强的突变体菌株，EB232菌株又相继在葡萄糖酸为碳源的改良M9培养基和葡萄糖为碳源的M9培养基中转接驯化。具体为EB232菌株在在葡萄糖酸作为碳源的改良M9培养基(将实施例1中的M9培养基的配方中的碳源由葡萄糖换为葡萄糖酸)中进[0237]EB233又在葡萄糖为碳源的M9培养基中驯化14次后，得到丁醇产量不变菌株命名性)的大肠杆菌S17-1λpir(购自Biomedal公司，产品目录号：KT-3229)，受体为含有pACYC184质粒(氯霉素抗性)的EB[0242]pACYC184记载在如下文献中：Li,Jin-Kun,andJennTu.SspRFI,anovelclass-IIrestrictionendonucleasefromSynechococcusRF-1recognizing5'TT/CGAA-3'.Nucleicacidsresearch19.17(1991):4[0243]下面的实施例用的是CRISPR/Cas系统介导筛选的λ-red同源重组系统进行基因敲[0244]pCas记载在如下文献中：Jiang,Yu,etal.MultigeneeditingintheEscherichiacoligenomeviatheCRISPR-Cas9system.Appliedandenvironmentalmicrobiology81.7(2015):2506-25[0245]pTargetF记载在如下文献中：Jiang,Yu,etal.MultigeneeditingintheEscherichiacoligenomeviatheCRISPR-Cas9system.Appliedandenvironmentalmicrobiology81.7(2015):2506-25[0253]随机挑取4400个上述突变体菌落分别接种进10mlM9培养基中按照实施例1的方[0266]以质粒pTargetF为模板，用引物1961-yieP-target(TCCTAGGTATAATACTAGTTTCATAGATATGCTCATGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)和1876-pTargetF-F2(ACTAGTATTATACCTAGGACTyieP-3(CGCGTCGCCATCGCTTTGGATAATCGCATCGCCAGCTTCTCAGCCAGAACATACGAAAG)/1969-模板，用引物1966-yieP-1(GACTCACGGCAAGGGTAAAAATGCGACGCG)和1969-yieP-4(TCTGCCGGAGTTCTCAGGAGAACCCCGCTG)融合PCR扩增出[0269]将1μl上述2)制备的pTargetF-yieP和1μl上述2)制备的yieP同源片段与上述1)制适量中间菌，用引物1966-yieP-1(GACTCACGGCAAGGGTAAAAATGCGACGCG)和1969-yieP-4[0271]挑取上述3)中yieP敲除成功的中间菌接至含50μg/ml卡那霉素和0.5mMIPTG的LB中30℃过夜活化。用灭菌的牙签蘸取活化后的菌液在含50μg/ml卡那霉素的LB平板上进行霉素平板上长的菌落即为pTargetF-yieP质粒已去除的中间菌。此时中间菌中仍含有pCas[0275]EB235为将EB234基因组上的yieP基因中间的片段(序列17的第70-619位核苷酸)粒所用的上游引物(下游引物均为上述引物1876-pTargetF-F2)以及构建各自的同源片段[0278]构建pTargetF-stpA(N20序列为TGTACGGCCCTGACCGGTCC，即为sgRNA如序列34所示)所用的上游引物为1962-stpA-target(TCCTAGGTATAATACTAGTTGTACGGCCCTGACCGGTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)，构建stpA同源片段所用的引物为1970-stpA-1(GGATTGATGGCTGGAAAAAAGCAGGATTGC)/1971-stpA-2(GTGCGATGGCTCGCGAATTCTCCATTGACGAAGGTAAATCTCTCGACGATTTCCTGATC)和1972-stpA-3(GATCAGGAAATCGTCGAGAGATTTACCTTCGTCAATGGAGAATTCGCGAGCCATCGCAC)/1973-stpA-4(CAGGCTTGCGGAATTAG(GGATTGATGGCTGGAAAAAAGCAGGATTGC)/1973-stpA-4(CAGGCTTGCGGAATTAGCGAGCAGAGAGCG))[0281]EB236为将EB235基因组上的stpA基因中间的片段(序列18的第74-373位核苷酸)[0282]构建pTargetF-yqeG(N20序列为CTGTGGAGTTTCGCGCTCTA，即为sgRNA如序列35所示)所用的上游引物为1963-yqeG-target(TCCTAGGTATAATACTAGTCTGTGGAGTTTCGCGCTCTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)，构建yqeG同源片段所用的引物为1974-yqeG-1(CACGGCGGAATGACCCGCTAACGCACCACG)/1975-yqeG-2(AGATGATGAGATAAGCGACTTTCATAATTGAACGTATCATCTACAAATTAAACAAAATG)和1976-yqeG-3(CATTTTGTTTAATTTGTAGATGATACGTTCAATTATGAAAGTCGCTTATCTCATCATCT)/1977-yqeG-4(AGCGATACCAACATAAT(CACGGCGGAATGACCCGCTAACGCACCACG)/1977-yqeG-4(AGCGATACCAACATA[0285]EB237为将EB236基因组上的yqeG基因中间的片段(序列15的第1-695位核苷酸)敲[0286]构建pTargetF-yagM(N20序列为GTTCTGCTCTCTTGTGAGTA，即为sgRNA如序列27所示)所用的上游引物为1964-yagM-target(TCCTAGGTATAATACTAGTGTTCTGCTCTCTTGTGAGTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)，构建yagM同源片段所用的引物为1978-yagM-1(GTGTCCTGCCGGTTCATTTCATGATGAATC)/1979-yagM-2(CAGACTACTCCCATAAAAAAACACTCAGTCGAGGTAACAAAGAAGGACAAACAATTATG)和1980-yagM-3(CATAATTGTTTGTCCTTCTTTGTTACCTCGACTGAGTGTTTTTTTATGGGAGTAGTCTG)/1981-yagM-4(ACAAATCAATGGCCGCC(GTGTCCTGCCGGTTCATTTCATGATGAATC)/1981-yagM-4(ACAAATCAATGGCCGCCATTACTGGTTACG))[0289]EB238为将EB237基因组上的yagM基因中间的片段(序列16的第121-855位核苷酸)EB238染色体上再次整合表达，对于每个基因表达所用的核糖体结合位点(RBS)，通过UTR[0295]ter基因前端的非翻译区(UTR)设计为TGGAATTGTAAGRAKGAKATATAYM。以大肠杆菌(TTCGCTTTCGTAAGGTTGAGAAGATGGCCC)/2093-yciA::ter-2(TTCCACACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAACGTTATGTGTTGTAGACATG)和2096-yciA::ter-5(GAGGTTGAACGCTTCGATCGTATter基因的质粒pSM2-Pcpc560ter为模板，用引物2094-yciA::ter-3(AATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATGGAATTGTAAGRAKGAKATATAYMATG)和2095-yciA::ter-4(CATACTTAAATAATGCTTCTGTCGCTTTATAGTTAGATACGATCGAAGCGTTCAACCTC)PCR扩增出ter基因片段；以上述yciA基然后以pTargetF质粒为模板，用引物2052-pTarget-yciA(TCCTAGGTATAATACTAGTACGGTCGCGTAGTGACTGTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)和1876-pTargetF-F2(ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG)PCR扩增出线性pTargetF-yciA，自连得到含有N20序列为[0296]将上述ter基因文库和pTargetF-yciA质粒转化至EB238(pCas)中。长出的菌落使用引物2092-yciA::ter-1(TTCGCTTTCGTAAGGTTGAGAAGATGGCCC)和2097-yciA::ter-6[0300]含有ter基因及其RBS的片段包括RBS(序列25的第1-25位核苷酸)和ter基因(序列[0302]同样地，crt基因前端的UTR设计为TGGAATYSTAAGAASSAKATATACC。以大肠杆菌(TTCACGTACCGTGATGACCTGCGGCCCGGC)/2087-poxB::crt-2(TTCCACACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTGCAACCGTTTGTTTCATG)和2090-poxB::crt-5(GATCGAGGGCTTCAAAAACCGCT丁醇梭菌DSM1731基因组为模板，用引物2088-poxB::crt-3(AATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATGGAATYSTAAGAASSAKATATACCATG)和2089-poxB::crt-4(GGGT