2025版药典重组人生长激素质量标准

2025版药典重组人生长激素质量标准本品系由编码人生长激素（hGH，GenBank登录号NM_000515.5）的基因重组工程菌（大肠杆菌BL21/DE3系列或CHO-K1系列）经种子复苏、发酵培养、诱导表达、分离纯化、超滤换液、除菌过滤后制得的原液，或加入适宜稳定剂制成的注射液、注射用无菌粉末，不含防腐剂和未经批准的辅料，生产过程不得添加青霉素类、头孢菌素类等β-内酰胺类抗生素。1生产与质控通用要求1.1细胞库管理应符合中国药典2025年版四部通则3401生物制品生产用细胞质量控制要求，建立三级细胞库系统：主种子库、工作种子库、生产用细胞/菌株。主种子库需检定以下项目：（1）基因序列检定：插入的hGH编码序列及上下游调控序列经Sanger测序或高分辨全长测序验证，与理论序列100%一致，无碱基突变、插入、缺失，未整合外源病毒、转座子等风险序列；（2）宿主细胞检定：大肠杆菌宿主需检定致病性、噬菌体污染、质粒稳定性，传代100代后质粒保留率≥95%；CHO宿主需检定支原体、外源性因子、复制型逆转录病毒、成瘤性，确认无致癌性相关基因突变；（3）表达产物验证：种子库表达的hGH经肽图、N端序列、比活性验证，与理论属性一致，无异常翻译后修饰。1.2生产工艺验证生产工艺需经过连续3批中试及以上规模的工艺验证，确认纯化工艺对工艺相关杂质、产品相关杂质的去除能力符合要求：宿主蛋白去除能力≥6Log、宿主DNA去除能力≥10Log、ProteinA残留去除能力≥8Log；CHO细胞表达的产品需额外进行病毒灭活/去除工艺验证，至少采用2种不同机制的病毒去除/灭活步骤，总灭活能力≥6Log。生产过程中所有接触产品的耗材、设备需经过无内毒素、无外源蛋白验证，避免交叉污染。1.3质量属性关联验证需提交产品关键质量属性与有效性、安全性的关联研究数据，明确脱酰胺hGH、氧化hGH、N端缺失变体、电荷变异体等杂质的生物学活性，确认杂质在限度范围内时，产品活性保留率≥95%，无免疫原性升高风险。2原液质量标准2.1性状本品为无色澄明液体，无可见异物、浑浊、沉淀；照中国药典2025年版四部通则0901溶液颜色检查法测定，颜色不超过黄色1号标准比色液；照通则0902澄清度检查法测定，澄清度不超过2号浊度标准液。2.2鉴别2.2.1肽图检查照通则3405肽图检查法测定，取供试品1mg，用测序级胰蛋白酶（酶与底物比1:50）在37℃酶切16h，采用C18反相色谱柱分离，流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1%三氟乙酸乙腈溶液，梯度洗脱，检测波长214nm。供试品肽图与rhGH对照品肽图的特征峰匹配度≥98%，特征肽段序列覆盖率≥95%，经高分辨质谱验证无突变特征肽段，若检出R183H、E56D等已知失活突变肽段，其含量不得超过0.1%。2.2.2等电点检查照通则0541第五法毛细管等电聚焦电泳法测定，采用pH3~10的两性电解质，供试品主区带等电点应为4.9~5.1，与对照品主区带位置偏差≤0.05pI。2.2.3N端氨基酸序列测定照通则3407蛋白质N端氨基酸序列测定法，连续测定15个氨基酸，序列应为Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leu，与理论序列完全一致。2.2.4免疫印迹法照通则3402免疫印迹法测定，采用鼠抗人hGH单克隆抗体作为一抗，供试品在22kDa处显单一阳性条带，无额外杂带。2.3纯度检查2.3.1分子排阻色谱（SEC-HPLC）照通则0512高效液相色谱法测定，采用硅胶基质分子量分离色谱柱（排阻极限100kDa），流动相为0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）含0.15mol/L氯化钠，流速0.5mL/min，检测波长280nm，进样量20μL（蛋白浓度1mg/mL）。按面积归一化法计算，单体纯度≥99.0%，二聚体及多聚体总量≤0.8%，分子量大于二聚体的寡聚体含量≤0.2%。2.3.2反相色谱（RP-HPLC）照通则0512高效液相色谱法测定，采用C18色谱柱，流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1%三氟乙酸乙腈溶液，梯度洗脱，柱温40℃，检测波长220nm。按面积归一化法计算，主峰纯度≥99.2%，产品相关杂质总量≤0.8%：其中脱酰胺hGH≤0.3%，Met14氧化hGH≤0.2%，N端缺失1~2个氨基酸变体≤0.2%，单个未知杂质≤0.1%。2.3.3毛细管电泳-十二烷基硫酸钠法（CE-SDS）照通则0541第七法CE-SDS法测定，非还原型条件下进样，主峰纯度≥99.5%，杂质峰总含量≤0.5%。2.4异质性与杂质残留检查2.4.1电荷异质性照通则0541第五法毛细管等电聚焦电泳法测定，按面积归一化法计算，主峰占比≥92.0%，酸性变异体总含量≤6.0%，碱性变异体总含量≤2.0%，其中N端甲酰化hGH≤0.5%。2.4.2宿主细胞蛋白（HCP）残留照通则3411宿主细胞蛋白残留测定法，采用经工艺特异性验证的ELISA试剂盒或高分辨质谱法测定，大肠杆菌来源制品HCP残留≤10ng/mgrhGH，CHO来源制品HCP残留≤15ng/mgrhGH。2.4.3宿主细胞DNA残留照通则3408荧光定量PCR法测定，采用宿主特异性引物探针，标准曲线相关系数≥0.99，回收率80%~120%。大肠杆菌来源制品DNA残留≤10pg/mgrhGH，CHO来源制品DNA残留≤1pg/mgrhGH，单次给药剂量≥10mg的制品，总DNA残留≤10ng/剂。2.4.4工艺相关杂质残留采用ProteinA亲和层析纯化的制品，ProteinA残留≤2ng/mgrhGH；采用IPTG诱导的制品，IPTG残留≤1μg/mgrhGH；生产过程使用的抗生素不得检出；纯化用有机溶剂残留符合通则0861残留溶剂测定法要求。2.4.5内毒素照通则1143细菌内毒素检查法测定，内毒素含量≤0.5EU/mgrhGH。2.4.6外源性因子检查大肠杆菌来源制品照通则3404噬菌体检查法测定，无噬菌体污染；CHO来源制品照通则3302外源病毒因子检查法测定，无复制型病毒、逆转录病毒污染；所有制品照通则3301支原体检查法测定，支原体阴性。2.5含量与效价测定2.5.1蛋白含量照通则0731蛋白质含量测定法第二法紫外分光光度法测定，以0.05mol/L磷酸盐缓冲液为空白，检测波长280nm，按吸收系数（E1%1cm）为0.82计算，蛋白含量（按干燥品计）≥95.0%。2.5.2效价测定第一法报告基因法，采用转染hGH受体-荧光素酶报告元件的HEK293细胞株，梯度稀释供试品与对照品后与细胞共孵育4h，检测荧光素酶活性，采用量反应平行线法计算效价，可信限率≤15%，效价应为标示量的90%~110%，比活性≥3.0IU/mg蛋白。第二法大鼠Nb2细胞增殖法，为仲裁法，照通则1219生物活性测定法执行，可信限率≤20%。3成品质量标准3.1剂型分类成品分为rhGH注射液（含预充针剂型、笔芯剂型）、注射用rhGH无菌粉末两类。3.2性状3.2.1注射液：无色澄明液体，无可见异物、浑浊、沉淀，照通则0901、0902检查，颜色不超过黄色1号标准比色液，澄清度不超过2号浊度标准液。3.2.2注射用无菌粉末：白色疏松块状物或粉末，无吸潮、融化现象，加入标示量的灭菌注射用水后1min内完全复溶，复溶后溶液澄清度不超过3号浊度标准液，颜色不超过黄色2号标准比色液，无可见异物。3.3鉴别采用RP-HPLC保留时间鉴别，供试品主峰保留时间与对照品主峰保留时间相对偏差≤2.0%；或采用免疫胶体金法检测，显阳性反应。3.4检查3.4.1pH值照通则0631pH值测定法，注射液pH值应为6.5~7.5，注射用无菌粉末复溶后pH值应为6.0~8.0。3.4.2渗透压摩尔浓度照通则0632渗透压摩尔浓度测定法，注射液应为280~330mOsmol/kg，注射用无菌粉末复溶后应为260~350mOsmol/kg。3.4.3不溶性微粒照通则0903不溶性微粒检查法，注射液每1mL含≥10μm微粒≤25粒、≥25μm微粒≤3粒；注射用无菌粉末复溶后每瓶含≥10μm微粒≤6000粒、≥25μm微粒≤600粒。3.4.4装量/装量差异照通则0102注射剂项下要求，注射液装量符合规定，预充针剂型装量误差≤±2%；注射用无菌粉末装量差异限度为±5%，含量均匀度符合通则0941要求。3.4.5水分注射用无菌粉末照通则0832水分测定法第一法，水分≤3.0%。3.4.6纯度检查SEC-HPLC法执行同原液2.3.1项，单体纯度≥98.5%，二聚体及多聚体总量≤1.2%，寡聚体≤0.3%；RP-HPLC法执行同原液2.3.2项，主峰纯度≥98.8%，总杂质≤1.2%：脱酰胺hGH≤0.5%、氧化hGH≤0.3%、N端缺失变体≤0.3%、单个未知杂质≤0.2%。3.4.7电荷异质性执行同原液2.4.1项，主峰占比≥90.0%，酸性变异体≤8.0%，碱性变异体≤2.5%。3.4.8残留杂质检查内毒素：注射液≤0.5EU/mgrhGH，注射用无菌粉末≤1.0EU/mgrhGH；宿主蛋白残留≤20ng/mgrhGH；大肠杆菌来源宿主DNA残留≤10pg/mgrhGH，CHO来源宿主DNA残留≤2pg/mgrhGH；预充针剂型照通则3111硅油油残留测定法，硅油残留≤0.1mg/支；辅料含量：甘露醇、组氨酸等稳定剂含量应为标示量的90%~110%，吐温80含量应为标示量的80%~120%。3.4.9安全检查照通则1101无菌检查法，采用薄膜过滤法，无菌生长；照通则1142热原检查法，符合规定（内毒素符合要求可豁免）；照通则1141异常毒性检查法，小鼠腹腔注射10倍临床给药剂量，7天内全部存活、体重增加≥10%，无异常反应。3.5含量与效价测定3.5.1蛋白含量执行同原液2.5.1项，应为标示量的95%~105%。3.5.2效价测定执行同原液2.5.2项，效价应为标示量的90%~110%，比活性≥2.8IU/mg蛋白。4稳定性与储运要求4.1稳定性考察符合通则9001生物制品稳定性试验指导原则要求，考察项目覆盖性状、pH、澄清度、单体纯度、相关杂质、电荷异质性、效价、无菌、内毒素。加速稳定性试验为25℃±2℃、相对湿度60%±5%条件下放置6个月，所有考察项目符合质量标准；长期稳定性试验为规定储存条件下放置至有效期后12个月，关键质量属性无显著变化。强制降解试验需覆盖高温、反复