铜绿假单胞菌噬菌体的筛选及其性质鉴定

中文摘要随着全球抗生素耐药问题越来越严重，噬菌体治疗开始被当作传统抗生素的补充或替代方案，并受到学术界的重点关注。铜绿假单胞菌这种细菌特别厉害，是医院里常见的感染源，能引起各种疾病。更麻烦的是，它的耐药机制很复杂，能通过多种方式对抗药物。所以，这篇论文重点研究怎么用生物方法防控铜绿假单胞菌。本次实验从医院废水样本里分离并鉴定出一株噬菌体Pa，详细分析了它的一些生物学特性。本研究用医院废水做样本，通过梯度纯化法成功分离出直径2-3mm的噬菌斑，这些噬菌斑边缘清楚，中间还有明显的透光区。接着做感染复数梯度实验，最后确定0.01是最合适的MOI参数；进行一步生长实验，得到噬菌体的生长曲线，确定此噬菌体具有潜伏期短、爆发期长且爆发量大的特点；通过双层平板法分别测定的pH和温度稳定性，二者稳定性均良好；进行CCK-8毒性实验，得出噬菌体Pa对细菌有着显著杀伤性的结果。本实验系统表征了Pa噬菌体的关键生物学特性，并通过体外抑菌效果测定实验验证其潜在应用价值，为后续开展噬菌体-抗生素联合治疗研究奠定理论基础。关键词：噬菌体；铜绿假单胞菌；生物学特性；噬菌体疗法

AbstractAmidtheintensifyingglobalantimicrobialresistancecrisis,phage-basedtherapiesareemergingasviablealternativesorsupplementaryapproachestoconventionalantibiotictreatments.ThisinvestigationcentersonthebiologicalcontrolofPseudomonasaeruginosa,utilizingsystematicscreeningmethodologiestoisolateandcharacterizeahighlyspecificbacteriophage,designatedPa,frommedicalwastewaterspecimens.Amulti-stagegradientpurificationprotocolwasemployed,involvingiterativeplaquepurificationcyclestoestablishgeneticallystablephageisolates.Following3-6successivepurificationiterations,distinctlyticplaquesmeasuring3-4mmindiameter,featuringsharplydefinedmarginsandcharacteristictranslucentzones,werevisualizedondouble-layeragarsubstrates.Throughamultiplicityofinfection(MOI)gradientanalysisacrosssixordersofmagnitude(100to0.001),theoptimalMOIforefficienthost-phageinteractionwasdeterminedtobe0.01.Subsequentone-stepgrowthkineticexperimentsconductedunderoptimizedinfectionparameterselucidatedthephage'sreplicationdynamics.Theaverageburstsize,definedastheratioofphageparticlesreleasedatlysiscompletiontotheinitialbacterialdensity,reached80plaque-formingunitsperinfectedcell.ThisstudyprovidescomprehensivebiologicalcharacterizationofphagePaanddemonstratesitsantimicrobialpotencythroughinvitroexperimentalvalidations,establishingfoundationalinsightsforfutureinvestigationsintophage-antibioticsynergistictherapies.Keywords:Bacteriophage;PseudomonasAeruginosa;BiologicalCharacteristics;PhageTherapy

目录TOC\o"1-3"\h\u中文摘要 1Abstract 2第1章引言 61.1铜绿假单胞菌的感染及治疗 61.2噬菌体概述 61.3噬菌体的结构及特点 61.4噬菌体疗法 71.5噬菌体疗法的临床应用 81.5.1噬菌体疗法治疗结直肠癌 81.5.2噬菌体疗法用于关节假体感染防治 81.5.3噬菌体疗法在酒精性肝病的应用 91.6噬菌体疗法防控水产养殖领域细菌感染 91.7噬菌体治疗牙周炎的研究进展 91.8本研究的目的和意义 101.9技术路线图 11第2章材料与方法 122.1材料 122.1.1宿主菌 122.1.2主要试剂 122.1.3实验仪器与设备 122.2样本的收集与处理 132.3噬菌体的富集 132.4噬菌体的筛选 142.5噬菌体的洗脱 142.5.1噬菌体的点板 152.5.2噬菌体的纯化 152.6噬菌体的扩增 152.7最佳感染复数的测定 162.8一步生长曲线的绘制 162.9噬菌体Pa温度稳定性的测定 172.10噬菌体Ph稳定性的测定 172.11噬菌体Pa抑菌谱测定 172.12噬菌体Pa的体外抑菌效果测定.. 182.13细胞毒性测定.. 18第3章结果与讨论 193.1噬菌体的筛选 193.2最佳感染复数的测定 193.3一步生长曲线的绘制 203.4噬菌体温度稳定性的测定 213.5噬菌体pH稳定性的测定 213.6噬菌体Pa抑菌谱测定 223.7噬菌体的体外抑菌效果测定 233.8细胞毒性的测定 233.9讨论 24第4章结论 26致谢 27参考文献 28

中英文全称及缩写对照表英文缩写英文全称中文全称ddH2Odeionized-distilledwater去离子蒸馏水DNaseIdeoxyribonucleaseI脱氧核糖核酸酶ILBLuria-BertaniLB培养基MOImultiplicityofinfection感染复数ODopticaldensity光密度Rpmrevolutionsperminute每分钟转数PFUplaque-formingunits噬斑形成单位CFUcolonyformingunits菌落形成单位

第1章引言1.1铜绿假单胞菌的感染及治疗铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa，PA）作为革兰氏阴性菌的典型代表，具有专性需氧特性且无法形成芽孢。该菌在特定环境条件下可引发多部位感染，涵盖呼吸系统、泌尿系统、皮肤软组织及全身性败血症等[1]。值得关注的是该菌能定殖于健康个体的黏膜表面和创口，这种强黏附性使其成为医院内感染的重要病原体[2]。在治疗层面，PA的耐药机制极为复杂，可通过多种途径对抗菌药物产生耐药性，若只是依赖药敏试验结果制定治疗方案，可能导致用药选择不当以至于治疗失败[3]。当前临床常用的抗PA药物包括头孢菌素类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类和碳青霉烯类等，但不同药物对应的耐药机制不同[4-6]。更为棘手的是，多种耐药机制常协同存在，显著增加了治疗难度。噬菌体疗法或许能够成为治疗铜绿假单胞菌感染的有效方法。1.2噬菌体概述噬菌体（Bacteriophage）作为特异性感染原核微生物（涵盖细菌、放线菌及特定真菌）的病毒群体，广泛存在于多种生态环境中并保持活跃的增殖能力[7]。它由遗传物质（DNA或RNA）与蛋白质外壳构成，它的复制周期必须借助宿主细胞的代谢机制完成，并且需要通过表面受体特异性识别机制启动感染程序来实现自身的增殖[8]。在生物医学研究领域，噬菌体因具有精确的靶向识别能力而被看作极具潜力的生物治疗工具，尤其在应对耐药性病原菌感染的临床治疗中展现出独特的应用价值[9]。1.3噬菌体的结构及特点噬菌体在自然环境中广泛分布，是具有核酸和蛋白质包裹的细菌病毒。根据噬菌体对宿主细菌作用机制的差异，可将其划分为两种基本类型：裂解性噬菌体与溶原性噬菌。前者的作用机制为，遗传物质首先在宿主细胞中完成复制，组装成完整的子代病毒颗粒，最终通过破坏宿主的细胞膜实现子代噬菌体颗粒的释放。溶原性噬菌体具有更复杂的双相生命周期特征，也就是说，既可以通过裂解途径进行增殖，也能以溶原途径建立长期的寄生关系。在溶原途径下，病毒基因组会通过位点特异性整合的方式去嵌入到宿主菌染色体DNA中，形成前噬菌体结构，并伴着宿主细胞的分裂过程实现稳定遗传。这种遗传物质整合机制的独特性让溶原性噬菌体在宿主群体中能够更稳定地传递遗传物质，和裂解性噬菌体相比，它在宿主菌群体中的传播效率和增殖稳定性上更有优势[10]。噬菌体的结构特征与功能高度适配，其头部由核酸分子构成，尾部由蛋白质组成。它们可以通过尾部结构特异性识别受体，实现与宿主细胞表面的精准吸附。吸附完成后，尾部的鞘管会发生构象变化，将核酸注入到宿主细胞内。注入的遗传物质会瓦解宿主菌的防御体系，启动病毒基因组的复制、表达程序。最终，新合成的病毒颗粒通过裂解宿主细胞完成一整个释放过程[11]。噬菌体基因组编码的功能蛋白可以直接参与宿主菌的重要生命活动，既能干扰细菌的正常分裂过程，阻止其生长；又能破坏细菌的繁殖机制，降低其繁殖能力，噬菌体自身则趁机大量复制自己的遗传物质并组装新的病毒颗粒。例如，噬菌体编码的穿孔素蛋白可在宿主菌细胞质膜上形成跨膜通道，破坏细胞膜的完整性，最终导致宿主菌裂解[12]。但是，大多数噬菌体的感染过程是依赖于宿主菌的代谢活性的，只有代谢活跃状态的细菌才可以被裂解，极少数噬菌体可以感染休眠的细菌。另外，部分噬菌体还能通过释放裂解酶降解细菌的生物膜从而穿透生物膜，去侵染细胞内部的细菌[13]。1.4噬菌体疗法噬菌体除了能够单独用于治疗细菌感染之外，还可以与抗生素协同应用，疗效更好。但抗生素的过度使用使许多细菌产生了抗药性，产生了“超级细菌”，比如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA）和耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（Carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）[14]。这些产生了耐药性的菌对传统抗生素治疗反应明显降低，为临床治疗制造了重大难题。针对传统抗生素治疗无效的感染，例如MRSA、CRE感染，噬菌体可特异性地杀灭此类菌[15]。此外，把噬菌体和抗生素一起用，杀菌效果会更好。噬菌体能精准攻击细菌，抗生素则削弱细菌抵抗力，两者配合比单独用任何一种都更有效。在生物膜感染中，噬菌体可破坏生物膜结构，让细胞内部的细菌更容易受抗生素攻击。联合治疗能降低抗生素使用剂量，减少抗生素副作用的同时还能减缓抗生素耐药性的发展。并且因为噬菌体与抗生素作用于细菌的机制并不相同，细菌很难同时对二者产生耐药性[16]。1.5噬菌体疗法的临床应用1.5.1噬菌体疗法治疗结直肠癌研究发现，结肠菌群失衡是患上结直肠癌（Carcinomaofcolonandrectum，CRC）的关键因素之一。像具核梭杆菌（Fusobacterium，Fn）、脆弱拟杆菌以及粘附侵袭性大肠杆菌（Adherent-InvasiveEscherichiacoli，AIEC）这些微生物，都和CRC的发展存在关系[17]。因为肠道菌群与CRC之间关系密切，通过调控微生物组来辅助CRC防治的策略正受到研究界的高度关注。武汉大学团队创新性地开发出了两种用噬菌体介导的纳米药物，核心价值在于利用噬菌体来送药，而不是直接依赖它的杀菌活性，这样能够拓展药的应用谱系[18]。还有研究团队采用AIEC特异性噬菌体对AIEC定殖的CRC小鼠模型进行干预。结果发现小鼠体内AIEC少了，肿瘤体积也小了，生存期也延长了。进一步分析发现，在接受噬菌体治疗的小鼠肠道内，与肿瘤生长、转移和胃肠道癌侵袭相关的基因表达受到显著抑制[19]。这些研究成果表明，噬菌体疗法是有效的，为直肠癌的治疗开辟了全新的途径。1.5.2噬菌体疗法用于关节假体感染防治人工关节置换后假体周围关节感染（Periprostheticjointinfection，PJI）已演变为全球范围内亟待攻克的医疗卫生难题[20]。该病症的主要治疗困境源于致病微生物在人工关节表面形成的致密聚集结构——生物膜。这种结构不仅强化了病原菌的附着能力，还导致了感染程度加重、复发率升高及药物敏感性下降[21]。最新研究进展表明，噬菌体疗法为破解这一难题提供了创新思路。系列临床研究证实，针对铜绿假单胞菌、粪肠球菌及肺炎克雷伯菌等耐药菌株引发的复杂感染，通过局部噬菌体联合系统抗生素治疗，可有效控制感染并加速炎症的消退[22]。据国际临床数据库统计，自本世纪初以来已收录23例噬菌体成功干预关节假体感染的病例，这意味着噬菌体疗法正在为克服与关节假体感染相关的耐药菌感染开辟新的治疗路径[23]。1.5.3噬菌体疗法在酒精性肝病的应用酒精性肝病（Alcoholicliverdisease，ALD）作为威胁全球公共健康的世界性慢性疾病，其核心诱因是长期摄入过量的酒精。该疾病的病理演变为渐进性发展，初期为可逆的脂肪肝，逐步恶化至酒精性肝炎，继而发展为不可逆的肝纤维化，最终演变为终末期肝硬化[24]。近期研究成果表面，肠道菌群稳态失衡对于酒精介导的肝损伤机制的调控中起关键作用[25]，维持肠道微生态平衡已成为防止ALD恶化的重要策略。基于这一发现，研究团队成功筛选并纯化出4株具有特异性活性的噬菌体，将其配制成多靶点噬菌体鸡尾酒制剂。动物模型实验表明，口服该制剂可使肠道菌群毒性下降67%，肝脏细胞毒素量下降42%，并可以有效改善肝窦内皮损伤及炎症等特征性病理改变[26]。这项研究不仅为解析肠道菌群和肝脏之间的相互作用提供了新视角，更为酒精性肝病的防治探索出了具有转化价值的创新解决方案。1.6噬菌体疗法防控水产养殖领域细菌感染随着水产养殖行业发展的越来越兴盛，细菌感染疾病的爆发也更加频繁[27]。这时候噬菌体疗法展现出了重要的应用价值，它的靶向特异性可以精准打击细菌，在高效杀菌的同时又不污染环境，在水产养殖的病害防控里特别管用[28]。传统抗生素的杀菌方式不分敌我，在抑制病原微生物的同时可能破坏肠道微生态平衡，导致有益菌群减少，还容易养出耐药菌这种“超级细菌”[29]。现代水产养殖业大多信赖绿色养殖技术，噬菌体疗法也就备受关注。它主要靠两招发挥作用：（1）特异性清除目标致病菌，阻断感染传播；（2）调节微生物群落结构，促进益生菌定殖。采用噬菌体疗法就能少用药甚至不用药，养出来的鱼虾也更安全[30]。1.7噬菌体治疗牙周炎的研究进展病原微生物向牙周组织的渗透是引发牙周病变的关键致病环节[31]。研究发现，在得牙周病的时候，噬菌体对于维持口腔内细菌平衡有着显著调控作用[32]。当前噬菌体治疗制剂的研发重点聚焦在三类技术路径上，分为天然噬菌体制剂、裂解酶制剂以及基因编辑噬菌体制剂。这三类技术通过不同的作用方式形成互补的治疗策略：天然噬菌体能够持续作用于细菌实现长效抑制，裂解酶制剂可以快速破坏细菌结构，而基因编辑噬菌体能够精准调控细菌活动。这种多机制协同作用的模式，为牙周病治疗提供了更全面的解决方案[33]。随着微生物组学研究和基因技术的发展，噬菌体疗法在牙周疾病防治中的应用前景很被看好。1.8本研究的目的和意义面对棘手的耐药菌，噬菌体有望成为新的“抗菌武器”，不但可以实现精准治疗，还能与抗生素联合对抗细菌感染。当噬菌体和抗生素一起使用时，两者能产生协同效果，更有效地杀灭细菌，由于噬菌体和抗生素杀灭细菌的机制不一样，细菌要同时对这两种物质产生抗药性极其困难，这为解决细菌耐药问题提供了新思路。所以，面对感染性强、耐药机制复杂、治疗难度高的铜绿假单胞菌，采用噬菌体疗法去治疗该细菌的感染无疑是一个很好的选择。本实验采用双层平板培养技术，从医疗废水样本中成功分离出1株具有铜绿假单胞菌特异性裂解活性的噬菌体。通过分析它的种种生物学特性，可以为铜绿假单胞菌感染的治疗提供噬菌体疗法新型生物制剂研发的理论依据。

1.9技术路线图图1-1技术路线图Fig.1-1TechnologyRoadmap

第2章材料与方法2.1材料2.1.1宿主菌实验室中保存的铜绿假单胞菌、大肠杆菌Nissle1917、沙门氏菌S503、S504、E.coliDH5a、K12、K88、志贺氏菌A703、乳双歧杆菌BL4，L929。2.1.2主要试剂（1）LB液体培养基：精确称取NaCl10g、胰蛋白胨10g、酵母提取物5g，溶解于适量蒸馏水中，经玻璃棒搅拌完全溶解，转移至容量瓶，用蒸馏水定容至1000ml，0.22μm滤膜过滤，分装至锥形瓶，在121℃±1℃条件下进行15min高压灭菌。；（2）固体营养琼脂培养基：称取营养琼脂粉15g，加入1000mLHշO，边加边搅拌至完全溶解，在121℃条件下，高压灭菌15min；（3）半固体培养基：量取液体LB培养基1000mL，称取琼脂粉5g，混合，121℃高压灭菌15min，最终获得均匀半凝固状态的培养基质。（4）1MCaCl2：1000mL去离子水，加入147gCaCl2，混合，121℃高压灭菌15min；（5）脱色液：不加考马斯亮蓝R-250的染色液；2.1.3实验仪器与设备表2-1主要实验仪器与设备Tab.2-1MainExperimentalInstrumentsandEquipment仪器名称型号品牌多功能酶标仪SYNERGY-H1美国伯腾仪器有限公司全温培养摇床EppendorfNewBrunswickInnova42Eppendorf中国有限公司紫外可⻅分光光度计UV-1800上海美谱达仪器有限公司冷冻⾼速离⼼机D-78532HettichZentrifugen生化培养箱BSP-250上海博迅医疗生物仪器股份有限公司立式压力蒸汽灭菌器LDZX-50KBS上海申安医疗器械厂双人单面净化工作台SW-CJ-2FD苏州净化设备有限公司干燥箱DHG-9141A上海一恒科学仪器有限公司台式高速离心机C-15R德国NACHT电子天平JA2003N上海佑科仪器仪表有限公司2.2样本的收集和处理（1）样本的处理：本实验采用海口市人民医院污水处理站的污水作为实验材料，用1MCaCl2与污水按比例混合，通过梯度稀释得到终浓度为5mMCaCl2，随后将混合液置于高速离心机中，设置为8000rpm/min，离心时长15min。（2）噬菌体的分离：离心处理后的上清液经0.22μm孔径的微孔滤膜进行过滤，滤液收集到50mL的离心管中。将过滤液再次进行离心操作，离心条件与预处理阶段一致，为8000rpm/min，时间15min。最终收集二次离心后的上清液作为后续实验材料。2.3噬菌体的富集（1）菌种活化与培养：在无菌环境里，从培养皿上挑个Pa菌的单菌落，用接种环接到装有5mLLB培养液的三角瓶里。接完种把瓶子放到37℃的摇床里，，以200r/min转速振荡培养2-3h，待细菌的OD值到0.2-1之间终止培养，此时细菌处于对数生长阶段。（2）混合培养体系构建：按照体积比1：2的比例，将3×浓缩LB培养基与预先配制的过滤除菌上清液充分混合。随后加入已培养至对数期的菌液，使最终混合体系中LB培养基的浓度为1×标准浓度。（3）噬菌体增殖培养：将混合培养体系放于37℃恒温摇床，维持130r/min的振荡频率进行过夜培养，培养时长控制在18-24h。（4）宿主菌灭活处理：向培养物中添加体积分数1%的氯仿溶液，轻轻摇匀后室温静置10min，确保宿主细菌完全失活，同时保留噬菌体。（5）噬菌体粗提：将处理后的混合液把样品转到离心管里，在4℃环境下用冷冻离心机离心，转速调到4000rpm/min，离心10min。离心完后用移液枪慢慢吸上面的清液，这部分就是含噬菌体的粗提液。可用于后续实验。2.4噬菌体的筛选（1）在1.5mL离心管中依次加入500μL噬菌体上清液，采用SMbuffer进行10倍梯度稀释，构建3个连续稀释梯度，每个梯度制备2个平行样本，通过涡旋振荡混合均匀。（2）先取不同浓度的稀释液各10μL，分别和400μL处于生长期的宿主菌液混匀。把混合液转到5mL的离心管里，静置15min让菌吸附。往离心管里加55℃左右的融化好的半固体培养基，快速晃匀后倒到准备好的固体琼脂平板上。等培养基凝固后，把平板倒置放进37℃的培养箱里，培养18-24h。（3）培养周期完成后，需要对双层琼脂平板噬菌斑的形成情况进行观察与记录。针对出现明显噬菌斑的样本，需进行二次纯化操作以确保噬菌体纯度。具体方法为挑取单噬菌斑进行扩大培养，重复上述梯度稀释和感染培养流程，直至获得稳定遗传的纯噬菌体群体。2.5噬菌体的洗脱（1）首先采用酒精灯火焰灭菌后的接种针，在培养皿中选定单个噬菌斑，在周围勾勒边长约3mm的等边三角形区域。随后沿标记线完整切取包含目标菌斑的上层琼脂块，将其转移至装有50-100μL的SMbuffer的1.5mL离心管中。使用无菌研磨棒对琼脂块进行充分破碎处理，然后将离心管置于恒温摇床中振荡培养（转速180rpm,温度25℃）。（2）把培养过的物质放到冷冻离心机里，设置转速为10000rpm/min，离心5min。离心完成后用移液枪轻轻吸上面的清液，为所需要的上清液。2.5.1噬菌体的点板取400μLPa的菌液加入4mL离心管中，与等体积半固体培养基充分混匀后，均匀涂布于固体营养琼脂培养基表面。待平板凝固后，使用记号笔在平板背面画9个等距小方格区域，将第一个方格作为阳性对照区域，后续8个方格依次接种1μL梯度稀释的噬菌体上清液。把平板放到培养箱里孵育4-5h。时间到了拿出来看平板上噬菌斑的数量和分布，大概估计一下浓度。2.5.2噬菌体的纯化（1）重复进行噬菌体洗脱与铺板操作，每次挑取单个噬菌斑进行3-5次连续传代培养，可得到纯度较高的噬菌体。（2）将噬菌体原液均匀涂布于平板表面，培养4h后形成高密度噬菌斑，用PBS缓冲液进行整板洗脱。（3）往洗脱液里加5%的氯仿，晃匀后放室温静置min。然后放到冷冻离心机里，12000rpm/min，离心10min。（4）离心完后用注射器吸取上层清液，过0.22μm的滤膜，过滤后的液体就是纯化好的噬菌体样本。2.6噬菌体的扩增（1）取两根无菌离心管，分别标号为A和B。在10mLLB液体培养基中按体积比1：100取200μL菌液接种到离心管里，然后放到37℃的摇床上，设置转速200rpm/min，摇1h。期间注意观察菌液的浓度，等OD值到0.3的时候可以停止培养。（2）在A管中加入100μL噬菌体悬液，调整摇床转速至220rpm，继续在37℃条件下振荡培养至菌液完全澄清。同时将B管作为阴性对照，保持静置，培养时间控制在1h左右。（3）A管菌液澄清后，向其中加入1mLB管培养的菌液。另在10mL新鲜LB培养基里接种B管菌液1mL，作为第二阶段培养的阳性对照样本。将上述两只离心管置于37℃、220rpm条件下振荡培养摇菌到澄清。（4）待菌液澄清后，向其中加入5%氯仿溶液，混匀充分，之后用离心机离心，设置转速为12000rpm/min，离心10min。（5）收集离心后的上清液，通过孔径为0.22μm的无菌滤膜进行过滤。2.7最佳感染复数的测定（1）用无菌接种环挑取出Pa单菌落，接种于10mL液体培养基中，置于37℃恒温摇床进行振荡培养，直至菌液OD值达到0.6-0.8的对数生长期阶段。（2）根据预先设定的感染复数梯度（0.001、0.01、0.1、1、10、100），分别取不同量的噬菌体液，再把这些不同量的噬菌体液和正在生长的宿主菌液混到一起。通过添加LB培养基调整各实验组总体积至相同水平，确保各组体系终体积一致。将混合体系置于37℃摇床进行12-15h的恒温培养。（3）将培养完成的混合液转移至离心管，在离心机离心，程序为12000rpm/min，10min。小心收集上清液，使用0.22μm的滤膜进行过滤处理，有效去除残留其中的铜绿假单胞菌即可。（4）采用10倍梯度稀释法用梯度稀释法把滤液稀释成不同浓度，取10μl各浓度的噬菌体液，和正在生长的Pa菌液在离心管里混匀，然后倒在凝固的琼脂平板上。等培养基凝固后，倒过来放培养箱里培养。培养好后用双层平板法测各浓度的噬菌斑形成单位（PFU），画出效价曲线，找到最合适的感染复数（MOI）。2.8一步生长曲线的绘制（1）把活化好的菌种接种到装有LB培养基的锥形瓶里，然后放到37℃的摇床上振荡培养，直到菌种长到对数期。（以下操作设置三个重复组）（2）根据最佳感染复数，分别向3个锥形瓶中接种9×107CFUPa和相应滴度的噬菌体，用LB培养基补齐至20mL反应体系，于37℃温育静置吸附10min。（3）把温育好的溶液倒进离心管，12000rpm/min离心30s。收集沉淀，倒掉上面的清液，加新鲜LB培养基把菌体吹打均匀。这步洗菌要重复三次。（4）在最后一次收集的菌体里加37℃的LB培养基，马上放摇床上培养。在感染后的0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120min分别取样，用双层平板法测各时间点的噬菌体数量。（5）用测得的Pa效价的对数值（lgPFU/mL）为纵坐标，感染时间当横坐标，画一步生长曲线。通过分析曲线确定噬菌体的潜伏期、爆发期和爆发量。2.9噬菌体Pa温度稳定性的测定（1）将100μL噬菌体原液分别置于25、30、40、50及60℃的恒温水浴锅中进行4h的热稳定性孵育处理。每个温度梯度设置三个样本。（2）孵育结束后，把各个温度组的噬菌体液拿出来，用梯度稀释法稀释。取10μL稀释液和400μL处于对数生长期的宿主菌液混匀，然后用双层平板法测效价并作温度-效价关系曲线。2.10噬菌体Ph稳定性的测定（1）按标准方法配好PBS溶液，高温灭菌后用盐酸和氢氧化钠调整pH值，调制pH从2到11的10种溶液，分别装到无菌离心管里备用。。（2）取100μL噬菌体原液，和等量的不同pH的PBS缓冲液混匀，所有样本在37℃温育4h。每个pH值做3个重复，同时设个空白对照（只有PBS缓冲液）（3）温育结束后，把Pa菌液稀释10倍，取10μL稀释液和400μL正在生长的菌液混匀，用双层平板法测效价，根据结果画图。。2.11噬菌体Pa抑菌谱测定（1）分别挑取铜绿假单胞菌、大肠杆菌Nissle1917、沙门氏菌S503、S504、E.coliDH5a、K12、K88、志贺氏菌A703、乳双歧杆菌BL4的单个菌落，接种到5mL的LB液体培养基。于37℃、200rpm条件下振荡培养2-3h，通过紫外分光光度计检测菌液在600nm处的吸光度值，OD值达到0.2-1.0时终止培养，此时菌群处于对数生长阶段。（2）量400μL对数期菌液加到5mL离心管里，再倒入预先融化并降温到50℃左右的半固体培养基，快速晃匀后马上倒在固体琼脂平板上。等上层培养基凝固了，滴5μL噬菌体液在平板上，静置10min让液体渗进去。最后把平板倒置放在37℃温箱里培养18-24h。（3）培养时间到了拿出平板，对着光看表面有没有形成透明抑菌斑。如果出现抑菌圈，说明这个噬菌体能裂解这种细菌。2.12噬菌体Pa的体外抑菌效果测定（1）用接种环挑个铜绿假单胞菌的单菌落，接种到10mLLB培养基里，放37℃的摇床上培养到对数期。（2）等菌液生长到对数期，取菌液进行梯度稀释，先8000rpm/min离心10min，收集菌体，倒掉上清，用新鲜LB培养基吹打均匀。通过两次10倍梯度稀释使菌液浓度为1×106CFU/mL。（3）采用96孔板，每孔加入100μL菌悬液（1×10⁶CFU/mL），随后加入经PBS缓冲液预处理的噬菌体溶液。设置不同感染复数（MOI）梯度：100:1、10:1、1:1、0.1:1、0.01:1、0.001:1，每个梯度加入等体积的噬菌体稀释液。阴性对照组加入等体积PBS缓冲液，空白对照组以100μLLB培养基混合等体积PBS作为空白对照。（4）将96孔板置于酶标仪中，设置37℃恒温条件，每30min自动测定OD600值，连续监测24h。通过GraphPadPrism软件对获得的动力学数据进行曲线拟合和统计学分析，绘制不同处理组的生长抑制曲线。2.13细胞毒性测定（1）取对数期的L929细胞，按每孔100μL密度接种到96孔板里。实验分不同浓度组、空白组和阴性对照组。（2）把孔板放37℃、5%二氧化碳的温箱里培养24h。细胞贴壁后，吸掉旧培养基，实验组加不同浓度的Pa药，空白组加等量PBS，对照组保持原培养基。再继续培养24h。（3）测细胞活性时，每孔加10μLCCK-8试剂，摇晃混匀后放回温箱孵4h。最后用酶标仪测450nm处的吸光度值，记录数据。

第3章结果与讨论3.1噬菌体的筛选本实验先后从校园湖中、小河中取水样，并试图从中分离出可以裂解铜绿假单胞菌的噬菌体，经过多轮噬菌斑纯化后，双层琼脂平板并没有噬菌斑的形成，于是又从医院污水站中取水样，重复操作，最终成功观察到2-3mm左右直径大小的典型噬菌斑，如图3-1所示，噬菌斑边缘清晰且呈现特征性透光区，命名为噬菌体Pa，经过洗脱、纯化、扩增后，用于进行生物学特性测定实验。图3-1噬菌斑实拍图Fig.3-1PhotographofPlaque3.2最佳感染复数的测定根据预先设定的感染复数梯度（0.001、0.01、0.1、1、10、100），分别取不同量的噬菌体液将不同剂量的噬菌体悬液与处于对数期的宿主菌液进行混合，通过双层平板法测定各稀释度的噬菌斑形成单位（PFU）。在0.01比例下，噬菌斑形成数量最多，经过计数后，根据结果绘制效价曲线，根据图3-2可以得出，Pa噬菌体的最佳感染复数为0.01。图3-2噬菌体Pa感染复数Fig.3-2TheMOIofphagePa3.3一步生长曲线的绘制分别在Pa噬菌体感染宿主菌后的不同时间点（0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120分钟）分别取样，用双层平板法测每个时间点的噬菌体数量。根据这些数据画出一步生长曲线，结果显示Pa噬菌体的潜伏期是10min，爆发期从10min持续到110min，整个爆发过程长达100min。用爆发末期噬菌体数量除以感染初期细菌浓度，算出爆发量是65PFU/cell。图3-3噬菌体Pa一步生长曲线Fig.3-3One-stepgrowthcurveofphagePa3.4噬菌体温度稳定性的测定将100μL噬菌体原液分别置于25、30、40、50及60℃的恒温水浴锅中进行4h的热稳定性孵育处理。孵育完成后，将各温度处理组的噬菌体液取出，进行10倍梯度稀释。取10μL稀释液和400μL正在生长的宿主菌液混合均匀，使用双层平板法测定效价并作温度-效价关系曲线。如图3-4所示，Pa噬菌体在25-50℃具有温度稳定性，在60℃活性降低。图3-4噬菌体Pa温度稳定性Fig.3-4TempaturestabilityofphagePa3.5噬菌体pH稳定性的测定取100μL噬菌体原液，分别和不同pH值（2到11）的PBS缓冲液混合，在37℃环境里孵育4h，之后测效价。从图3-5中能看出，这个噬菌体在pH3到11之间都处于稳定状态，但在pH2这种强酸环境下活性变差。图3-5噬菌体Pa的pH稳定性Fig.3-5pHstabilityofphagePa3.6噬菌体Pa抑菌谱测定将铜绿假单胞菌、大肠杆菌Nissle1917、E.coliDH5a、K12、K88、沙门氏菌S503、S504、志贺氏菌A703、乳双歧杆菌BL4的对数期菌液与噬菌体原液混合，使用双层平板法测试其抑菌性。如表3-1所示，Pa和K88均出现抑菌圈。此结果表明，该噬菌体对以上两种细菌均有裂解性，Pa和K88可能为同株细菌。表3-1Pa的抑菌谱三线表Tab.3-1AntibacterialSpectrumThree-lineTableofPa菌属品种噬菌斑来源铜绿假单胞菌有实验室保藏沙门氏菌S503无沙门氏菌S504无大肠杆菌DH5a无大肠杆菌K12无大肠杆菌K88有大肠杆菌Nissle1917无志贺氏菌A703无乳双歧杆菌BL4无3.7噬菌体的体外抑菌效果测定采用96孔板，每孔加入100μL菌悬液（1×10⁶CFU/mL），随后加入经PBS缓冲液预处理的噬菌体溶液。设置不同感染复数（MOI）梯度：100:1、10:1、1:1、0.1:1、0.01:1、0.001:1，每个梯度加入等体积的噬菌体稀释液。阴性对照组加入等体积PBS缓冲液，空白对照组以100μLLB培养基混合等体积PBS作为空白对照。将96孔板置于酶标仪中，设置37℃恒温条件，每30min自动测定OD600值，连续监测24h。根据结果绘制抑菌曲线如图3-6，在如上6种比例下，Pa都能有效的抑制铜绿假单胞菌的增殖。图3-6噬菌体Pa体外抑菌效果Fig.3-6AntibacterialeffectinvitroofphagePa3.8细胞毒性的测定向各实验组加入梯度浓度的Pa药物溶液，空白组加等量的PBS缓冲液，对照组保持原来的培养基。继续培养24h后结束处理。每孔加10μLCCK-8试剂，轻轻摇匀后放回培养箱孵4h。最后用酶标仪测450nm处的吸光度值，记录数据。数据处理结果由图3-7所示，可看出随着药物浓度的增加，细胞活性逐渐减少，也就是说Pa噬菌体能够有效杀伤细胞。图3-7细胞毒性测定Fig.3-7Cytotoxicityassay3.9讨论铜绿假单胞菌是一种广泛存在于自然环境和人体表面的革兰氏阴性杆菌，免疫力低下人群很容易感染，一旦感染，就可导致肺炎、尿路感染、伤口感染或者败血症等疾病[34]。它的耐药性十分显著，不仅对天然性地多种抗生素不敏感，还可通过外膜屏障、主动外排泵、β-内酰胺酶及生物膜形成等机制产生多重耐药性[35]。噬菌体作为能够裂解细菌、攻击细胞内部的病毒，对于防治铜绿假单胞菌有着很好的应用前景。本实验先后从校园湖中、河里取水样试图分离出可以裂解铜绿假单胞菌的噬菌体均以失败告终，最终从医院废水站的水样中成功分离出一株。最佳感染复数（multiplicityofinfection，MOI）是噬菌体与细菌互相作用的最佳比例[36]，在此条件下，噬菌体的作用效果显著，也就提高了临床应用的可能。根据图3-2，噬菌体Pa的最佳感染复数为0.01。通过一步生长曲线能观察噬菌体在宿主细胞里的增殖过程，分潜伏期、裂解期和稳定期三个阶段，能清楚看到病毒从感染到释放的全部过程。从图3-3能看出，Pa噬菌体潜伏期是10min，爆发期从10min到110min，整个过程持续100min。用爆发末期噬菌体数量除以感染初期细菌浓度，算出爆发量是65PFU/cell。这说明Pa噬菌体潜伏期短、爆发期长且爆发量大，有不错的医学应用前景。对于温度和酸碱度稳定性的测定可以判断噬菌体是否适合一般的医疗环境、是否适合生存，通过图3-4和3-5可以得知，噬菌体Pa在20-50℃，3-11pH条件下，活性保持稳定状态，也就是说该噬菌体适应绝大部分环境，很适合作为细菌处理的材料。通过抑菌谱测定可以得出，噬菌体Pa可以裂解铜绿假单胞菌和K88。本次实验过程中，为了排除可能存在的污染菌影响，做了2次平行的抑菌谱测定实验，两次实验结果均显示噬菌体Pa对以上两种细胞均有裂解作用，裂解能力强。K88与铜绿假单胞菌是否为同株细菌有待进一步考量。根据绘制出的抑菌曲线可以看出，如图3-6，在不同感染复数（MOI）梯度下，Pa都能够有效地抑制铜绿假单胞菌的增殖。由此可见，Pa对于治疗铜绿假单胞菌的感染有可应用性。细胞毒性测定也就是测定一种药物对细胞的杀伤作用[37]，由图3-7所示，可看出随着药物浓度的增加，细胞活性逐渐减少，也就是说噬菌体Pa对细菌有着显著杀伤性。

第4章结论通过研究，本论文从医院废水站中筛选得到具有铜绿假单胞菌裂解效果的噬菌体Pa，并对其生物学特性进行了研究，得到以下结论：（1）从医院废水里分离出一株能杀死铜绿假单胞菌的噬菌体，我们叫它Pa。（2）Pa噬菌体最佳感染比例是0.01，它的一步生长曲线显示：病毒潜伏10min左右开始爆发，爆发期持续约100min，爆发量65PFU/cell。（3）Pa的温度和pH稳定性测定实验表明，其在20-50℃、3-11pH条件下性质稳定。（4）Pa的抑菌谱测定实验表明，该噬菌体对于铜绿假单胞菌具有极高的裂解性，与此同时对于K88也存在裂解性。（5）通过体外抑菌实验观察到，Pa噬菌体对铜绿假单胞菌展现出明显的增殖抑制效果。（6）细胞毒性测定实验表明，Pa噬菌体对细菌的杀伤作用显著。

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