CN110832084B 用于制备核酸文库的方法、组合物和试剂盒 （吉复生物科技有限公司）

2019.12.16PCT/GB2018/05100020WO2018/193233EN2018.10.25WO2007062495A1,2007.06.07US2005153333A1,2005.07.14US2016257985A1,2016.09.08物和试剂盒以及用于制备多核苷酸的测序文库剂盒涉及在衔接子模板寡核苷酸上生成经修饰的靶多核苷酸以及标记靶序列的一条链或两条2（iii）使用识别所述核苷酸序列的具有dU-糖基化酶活性的酶消化所述衔接子模板寡2.如权利要求1所述的方法，其中产生所述第一延伸的第一互补序列。4.如权利要求1所述的方法，其中使用DNA连接酶延伸所述第连接到所述第一互补序列。5.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括延伸与所述第一互补序列或经修饰的第8.根据权利要求2所述的方法，其中与所述3’通10.根据权利要求1所述的方法，其中所述通用序列包括能够作为RNA聚合酶启动子的12.根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子模板寡核苷酸包括茎-环结构，所述34[0004]为了克服测序准确性的限制，已经报道了几种方法。双重测序(Schmitt,etal742,606描述了对与简并碱基区附接的多核苷酸进行测序以确定/估计不同起始多核苷酸[0005]靶向下一代测序往往涉及对大的复杂片段的分析，并且通过多重PCR(在单个PCR5核酸可以是单链的或双链的，或者含有双链序列和单链序列二者的一部分。核酸可以是序列指这样的序列的单链DNA或RNA、这样的序列与其互补序列的双链体(双链DNA或RNA)、和/或这样的序列的互补序列。杂交双链体的靶核酸也可以被称为“模板”。模板用作用于合成互补多核苷酸的模型生的)，当该寡核苷酸或多核苷酸被置于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条6机地或通过设计使两个核苷酸序列通过其嘌呤碱基和/或嘧啶碱基的氢键结合而彼此序列特异性地结合来形成双链体核酸复合物的能力。其也可以指核苷酸序列(可以包含经修饰克规则之外的规则彼此序列特异性地结合以形成可替代的核酸双酸序列结合在一起以形成双链体序列或节段(segme段与RNA节段互补结合、或由RNA和DNA的混合物组成的两个节段彼此互补结合形成这样的一个或更多个阻断性寡核苷酸与样品序列的结合而形成苷酸的核酸”指具有与相应的野生型多核苷酸的核苷酸序列不同的核苷酸序列的多核苷[0022]术语“引物延伸产物”指在反应中使用一个或一对引物通过聚合酶延伸的DNA或7过聚合酶延伸添加已知序列来修饰靶标的模板。术语衔接子模板寡核苷酸(ATO)或可去除因此衔接子模板寡核苷酸(ATO)的群体指多个不同的序列。[0033]本公开提供用于延伸多核苷酸的衔接子模板寡核苷酸(ATO)，衔接子模板寡核苷[0038]术语通用序列指ATO从其5’端到随机序列或靶特异性序列的第一个核苷酸的整[0040]本公开提供用于延伸多核苷酸的衔接子模板寡核苷酸(ATO)，衔接子模板寡核苷8[0051]通用序列可以包括RNA聚合酶启动子序列。可以使用任何RNA聚合酶(如T7RNA聚列。列与通用序列的全部或一部分互补或部分互补，这能够形成茎-环结构或断裂的茎-环结[0056]ATO的通用序列可以包括作为附加的唯一标识(UID)序列的一个或多个随机序列[0057]ATO序列可以在任何位置处包括为天然存在核苷酸或人工核苷酸的一个或多个非9[0061]本公开提供延伸靶多核苷酸的方法，方法包括在足以允许用一种或多种ATO作为组合物孵育，其中一种或多种ATO可以与靶多核苷酸的任何位置或特定位置杂交。另一方[0062]第一ATO反应可以是延伸反应，其中靶多核苷酸被延伸为引物，并且一种或多种ATO作为模板。可替代地，第一ATO反应可以是延伸-连接反应(切口填补(nickfiling)反[0063]ATO包括致使ATO可降解的一个或多个部分，其中所述一个或多个部分可被便利建无碱基位点)且随后在高于80℃的温度下孵育(在无碱基位点内引入断裂)，或者通过与酸酶活性的条件下可用核糖核酸酶降解。在相关方面，核糖核酸酶选自由核糖核酸酶H[0068]提供比标准典型碱基配对弱的碱基配对的分子间氢键的修饰可以是任何天然存[0070]通用碱基是类似化合物，其可以以弱碱基对相互作用代替四种DNA碱基中的任何[0072]通用碱基可以与任何其他碱基无差别地配对，但通常大大降族非氢键结合碱基(强堆积效应)。本公开已经探索了该性质以使含有肌苷的ATO具有比正性的部分。ATO可以包括或可以不包括可以在ATO反应之后被消化的其他修饰(如一个或多多核苷酸在第一ATO反应中与ATO的通用序列杂交。ATO可以包括可以在第一反应之后被消在一些特定位置处包括一些特定(非随机)核苷酸，例如3’末端核苷酸可以是特定核苷酸天然存在的或人工的经修饰的核苷酸。这些经修饰的核苷酸可以是如上所述的通用碱基。过使用缺少3’OH的核苷酸(如双脱氧核苷酸)实现阻断。阻断基团可以选自由下列组成的[0091]ATO分子包括选自由下列组成的组的核苷酸：2’-脱氧胸腺嘧啶核苷5’-单磷酸[0092]经修饰的寡核苷酸或经修饰的多核苷酸可以包括寡核苷酸或多核苷酸中的核苷膦酸酯。经修饰的寡核苷酸或经修饰的多核苷酸也可以含有一个或更多个经取代的糖部酸并入ATO中以代替胸腺嘧啶核苷酸。可以在存在两种或更多种不同非典型核苷酸的情况酸的情况下合成包括非典型核苷酸的ATO时，其中以适用于在ATO反应后降解ATO的比例提嘧啶-N-糖基化酶(UNG)是一种催化从大于6个碱基对的单链DNA和双链DNA释放游离尿嘧啶核糖核苷酸并入ATO中以代替任何核苷酸或全部核苷酸；其中剂是核糖核酸酶，其能够在[0097]在另一个实施方案中，ATO分子可以包括附接在ATO的任何位置中的亲和结合部[0098]虽然RTO的随机序列的一部分用作唯一标识(UID)序列，但RTO可以包括位于通用[0100](i)使用来自样品的靶多核苷酸作为引物并且使用上述RTO中的任何一个的可去除的模板寡核苷酸(RTO)作为模板来生成经修[0102](iii)使用第一引物生成经修饰的靶多核苷酸的第一互补序列(CS)，第一引物包括通用序列，[0105](i)将靶多核苷酸与衔接子模板寡核苷酸(ATO)孵育，衔接子模板寡核苷酸(ATO)[0111]方法还可以包括(iii)生成经修饰的靶多核苷酸的第一互补序列(CS)，其中生成[0113](i)通过将靶多核苷酸与如上所述的组合物孵育来生成经修饰的靶多核苷酸，其双链RNA聚合酶启动子区使用RNA聚合酶进行体外转录，经修饰的靶多核苷酸中的双链RNA聚合酶启动子区通过在含有RNA聚合酶启动子的ATO上延伸而生成。在另一个实施方案中，通过在消化和/或去除ATO之后使核苷酸与经修饰的靶多核苷酸杂交来生成经修饰的靶多[0119]在又一个实施方案中，所述生成第一CS的操作包括使经修饰的靶多核苷酸热变[0121]方法还可以包括在生成经修饰的靶多核苷酸的第一互补序列(CS)的操作之前或者在生成经修饰的靶多核苷酸的第一互补序列(CS)的操[0122]方法还可以包括在生成经修饰的靶多核苷酸的第一互补序列(CS)的操作之前或者在生成经修饰的靶多核苷酸的第一互补序列(CS)的操作之后进[0124]方法还可以包括通过将第一CS与如上所述的组合物孵育来以针对不同靶标靶向正向链或反向链，使得最终的库可以靶向正向链和反向链两者的不同区。其中靶序列的正向链和反向链互补，并且正向靶特异性引物和反向靶特异性引物被分成两个不同的引物库，只要考虑到如果靶向正向链和反向链的两种引物能够一起作为用于的反向链互补的靶特异性第二引物或靶特异性引物库，其中靶序列的正向链和反向链互[0131]当样品中的靶多核苷酸是双链的并且第二引物是靶特异性引物时，ATO反应之后用于靶特异性扩增的反应可以包括将ATO反应产物或线性扩增的第一CS产物分成两个单独[0132]在一方面，所述生成第一CS的操作包括使用第一引物进[0136]方法可以包括在第一ATO反应之前对靶多核苷酸进行片段化或片段化/标记的操[0137]在一个实施方案中，所述对靶多核苷酸进行片段化和/或标记的操作包括使双链转座酶与转座子DNA复合，Tn5转座酶/转座子DNA复合物与沿着双链基因组DNA的靶标位置[0138]在另一个实施方案中，所述对靶多核苷酸进行片段化的操作包括使双链DNA与结辑工具可以包括成簇的规律间隔性短回文重复序列和CRISPR相关蛋白酶9(CRISPR/Cas9)。存在的经片段化的多核苷酸。天然存在的经片段化的多核苷酸可以是血浆的循环游离核酸。所述经片段化的靶多核苷酸可以包括使双链多核苷酸与结合到转座子DNA的转座酶接[0153]通过在ATO模板上延伸单链靶多核苷酸来根据如上所述的ATO和组合物向单链靶多核苷酸添加衔接子序列；以及使用与NGS平台相容的引物对衔接子标记的靶多核苷酸进被用作用于生成RNA分子的启动子序列，其中启动子序列是(例如但不限于)T7启动子序列或SP6启动子序列。[0155](i)通过使用来自样品的靶多核苷酸来生成经修饰的靶多核苷酸，来自样品的靶多核苷酸在酶促第一反应(其将衔接子序列添加到靶多核苷酸的3’端)中与上述ATO(第一[0156](ii)使用包括通用序列的第一引物并且使用经修饰的靶多核苷酸作为模板来生外切酶活性和/或链置换活性。可以用于实施本文公开的方法的聚合酶包含但不限于Deep聚合酶、CrimsonTaqTMDNA聚合酶、具有(无Mg)缓冲液的CrimsonTaqTMDNA聚合酶、全长BstDNA聚合酶、具有ThermoPol缓冲液的大片段TaqDNA聚合酶、9°NTherminatorTMIIDNA聚合酶、TherminatorTMIIIDNA聚合酶、ventR@DNA聚合酶、[0160]可以用于实施本公开的方法的连接酶包含但不限于T4DNA连接酶、T4RNA连接[0162]在一个实施方案中，在步骤(i)中，如果ATO的通用部分包括弱配对核苷酸(如肌要从反应混合物中消化或去除ATO，因为ATO的发夹结构使ATO与经修饰的靶多核苷酸的3’[0168]方法还可以包括通过将双链衔接子连接到步骤(ii)的产物中来生成经修饰的第修饰的靶多核苷酸的第一互补序列(CS)的操作。可以通过引物延伸生成第一互补序列的任何一个的第二衔接子模板寡核苷酸(ATO)作为模板来生成经修饰的第一CS的操作。在引物生成第一CS并且使用第二引物形成第二CS，其中在第一PCR循环之后同时生成第一CS起。使用第一CS的套叠靶特异性第三引物和第二CS的通用引物对(汇集的)经纯化的PCR产第一引物生成第一CS并且使用第二引物形成第二CS，其中在第一PCR循环之后同时生成第反应包括与靶序列的反向链互补的靶特异性第二引物，其中靶序列的正向链和反向链互[0173]在步骤(i)或步骤(ii)中，延伸操作可以包括使用第一引物或第二引物的一次延[0179](ii)对来自(i)的至少两个含有相同UID的序列进行比对和/或对两个反应的相同[0180](iii)基于(ii)确定两个反应的共有序列和/或相同的变体序列，其中共有序列[0181]本公开还提供用于生成多核苷酸文库的试剂盒，试剂盒包括上述ATO中任何一个[0183]用于生成多核苷酸文库的试剂盒包括如上所述的衔接子模板寡核苷酸(ATO)、聚列并且创建用于下一代核酸测序的文库的测DNA或RNA或两者在其被延伸之前被片段化。基因组DNA/RNA的片段化操作是本领域技术人员已知的一般程序，并且通过例如但不限于下列方式在体外进行：通过剪切(雾化)DNA/靶多核苷酸是在包括随机序列和通用序列的ATO上延伸的靶向反应包括退火成来自一个样品的多个靶CS的第一链的多个靶特异性第二引物的正向组，而反向反应包括退火成来自相同样品的多个靶CS的第二链的多个靶特异性第二引物的反[0192]方法还包括对来源于代表靶序列的两条不同链的正向反应和反向反应的NGS读序相同随机序列标识符(UID)序列的家族；(ii)去除具有一个或更多个核苷酸位置的同一家[0193]方法还包括对来源于代表靶序列的两条不同链的正向反应和反向反应的NGS读序进行分析的操作，分析操作包括通过分组成含有相同随机序列标识符(UID)序列的家族来[0195]UID的目的是双重的。第一是向每个原始DNA模板分子或RNA模板分子分配唯一的索引序列使来自多个不同个体的PCR产物能够在测序仪的同一流动池室[0198]靶多核苷酸序列的特征区(diagnosticregion)中的一个或多个变异核苷酸可以[0200]本公开提供对生物样品中不同靶核酸序列的多个基因座处的突变或多态性的存链中的一条中突变的存在。[0205]已经有大量文献记载，患有各种类型癌症的患者中游离DNA从垂死的肿瘤细胞向许以传统方法的时间和成本的一小部分对数千亿个碱基对进行同时测序，下一代测序方法克服了测序准确性的这些限制。相对过量的背景野生型DNA可以掩盖具有突变的[0207]在测序之后，根据共有相同的UID标签序列来对每个读序家族的成员进行鉴别和[0208]除了其用于稀有DNA变体的高灵敏度检测的应用之外，靶特异性引物中带条形码的随机序列标识符还可以用于单分子计数，以精确确定相对的或绝对的DNA拷贝数和/或分子的测序读序的准确计数为拷贝数变化或者染色体生成经修饰的靶多核苷酸，经修饰的靶多核苷酸包括作为UID的随机序列和作为引发位点NGS平台相容的套叠靶特异性第三引物和通用引物对第二CS进行进一步PCR扩增。可选地，可以使用与NGS平台相容的通用引物对第二CS进行进一步PCR[0220](C)将第一引物退火成靶多核苷酸的添加的衔接子序列，并且进行延伸以生成第[0221](D)对靶多核苷酸进行亚硫酸氢盐处理，其将未甲基化的胞嘧啶(C)转化成尿嘧该引物的3’部分被设计成与修饰物靶多核苷酸的通用序列杂交并且具有含有下一代测序的PCR扩增来对混合物进行扩增。该扩增的产物将是PCR产物(其中的每个都具有原始多核[0225](H)将经修饰的靶多核苷酸与通用引物组合，引物被设计成与修饰物靶多核苷酸产物是具有原始多核苷酸的经扩增的靶标区的PCR产物，并且将包含与下一代测序相容的全部必需序列。[0228](B)除了(A-T)中提到的设计组分的任何组合之外的ATO，其包括发夹结构/茎-环[0229](C)除了(A-T)中提到的设计组分的任何组合之外的ATO，其包括发夹结构/茎-环[0230](D)除了(A-U)中提到的设计组分的任何组合之外的ATO，其包括发夹结构/茎-环够作为唯一标识符的靶特异性序列。[0231](E)除了(A-J)中提到的设计组分的任何组合之外的设计有两条单独链的ATO，其[0232](F)除了(A-U)中提到的设计组分的任何组合之外的ATO，其中通用位点全部地或[0233](G)除了(A-U)中提到的设计组分的任何组合之外的ATO，其中通用位点部分地由被设计成充当RNA聚合酶启动子的序列和被设计成充当引发位点的单独[0234](H)除了(A-U)中提到的设计组分的任何组合之外的ATO，其包括发夹结构/茎-环[0235](I)除了(A-U)中提到的设计组分的任何组合之外的ATO，其包括发夹结构/茎-环[0236](J)除了(A-U)中提到的设计组分的任何组合之外的ATO，其包括被设计成靶特异[0237](K)除了(A-U)中提到的设计组分的任何组合之外的ATO，其中下部链含有通用位点，通用位点部分地由被设计成充当RNA聚合酶启动子的序列和被设计成充当引发位点的单独序列组成，并且上部链是与能够形成双链RNA聚合酶启动子的下部链部分互补或完全[0238](L)除了(A-U)中提到的设计组分的任何组合之外的ATO，其包括发夹结构/茎-环[0239](M)除了(A-U)中提到的设计组分的任何组合之外的ATO，其包括发夹结构/茎-环够作为唯一标识符的靶特异性序列。[0240](N)除了(A-U)中提到的设计组分的任何组合之外的ATO，其包括发夹结构/茎-环序列、或具有核苷酸偏倚的随机序列、以及适合于用作引物以允许延伸ATO的最尽头的3’[0243](Q)除了(A-U)中提到的设计组分的任何组合之外的ATO，其包括发夹结构/茎-环[0244](R)除了(A-U)中提到的设计组分的任何组合之外的ATO，其包括发夹结构/茎-环[0245](S)除了(A-U)中提到的设计组分的任何组合之外的线性ATO，其具有包括连接受[0246](T)除了(A-U)中提到的设计组分的任何组合之外的线性ATO，其具有包括亲和纯[0247](U)除了(A-U)中提到的设计组分的任何组合之外的线性ATO，其仅由具有被阻断[0248]图4描绘了说明性实施方案的示意图。可以通过借助于转座酶的片段化来代替使用核酸酶进行酶促片段化的过程或者通过超声处理进行DNA物理剪切的操作。在步骤(i)有靶特异性序列的ATO分子在一个或更多个位置处与单链靶多核苷酸序列杂交。在步骤链靶多核苷酸在一个或更多个位置处与ATO分子随机杂交之前对靶多核苷酸进行片段化。[0252]图8描绘了说明性实施方案的示意图。(a)靶多核苷酸(任何来源的PCR产物、或中，在单链靶多核苷酸在一个或更多个位置处与ATO分子随机杂交之前对靶多核苷酸进行饰的靶多核苷酸包括作为UID的随机序列和包含RNA聚合酶启动子的3’通用序列。在步骤链靶多核苷酸在一个或更多个位置处与ATO分子随机杂交之前对靶多核苷酸进行片段化。单链靶多核苷酸在一个或更多个位置处与ATO分子随机杂交之前对靶多核苷酸进行片段列的单链DNA寡核苷酸(内部参照(IC))。所使用的靶多核苷酸还是与10％量的已知长度和序列内的引物和存在于被添加到经修饰的靶多核苷酸中的通用序列中的引物(正向引物2和反向引物2)，并且另一个反应具有位于靶多核苷酸序列内的引物和具有尾(其与经修饰的靶多核苷酸不同源)的存在于被添加到经修饰的靶多核苷酸中的通用序列的端处的引物(正向引物3和反向引物3)，全部这些反应都包含位于靶多核苷酸(探针)内的双重标记的单链靶多核苷酸在一个或更多个位置处与ATO分子随机杂交之前对靶多核苷酸进行片段二PCR产物。在步骤(viii)中，使用高灵敏度生物分析仪芯片确定最终测序文库的尺寸分布。然后，使用具有150bp双端测序的MiSeq测序仪对文库进行测序。随后使用bwa比对仪(aligner)和自定义数据过滤python脚本的组合来分析测序数据。数据图(H)表示由通过作为模板进行延伸。延伸生成经修饰的CS，经修饰的CS在每个端处包括作为UID的随机序冲液、酶、dNTP和其他添加物组合，并且用于对经修饰的CS产物进行指数扩增。在步骤[0262](A)将经修饰的靶多核苷酸分成两个大致相等的等份。向这些等份中的每个添加增的产物将是两个单独的PCR产物库(其中的每个都已经对原始多核苷酸的链中的一条或[0263](B)将经修饰的靶多核苷酸分成两个大致相等的等份。向这些等份中的每个添加通用引物，引物被设计成与修饰物靶多核苷酸(具有附加的5’通用序列或不具有附加的5’都已经对原始多核苷酸的链中的一条或另一条进行了扩增)，并且将包含与下一代测序相容的全部必需序列。[0264](C)将经修饰的靶多核苷酸与通用引物组合，引物被设计成与修饰物靶多核苷酸引物库，每个库含有被设计成对靶多核苷酸的正向链或反向链的靶标区进行扩增的引物。物将是两个单独的PCR产物库(其中的每个都已经对原始多核苷酸的链中的一条或另一条[0265](D)将经修饰的靶多核苷酸与通用引物组合，引物被设计成与修饰物靶多核苷酸始多核苷酸的链中的一条或另一条进行了扩增)，并且将包含与下一代测序相容的全部必需序列。[0266](E)将经修饰的靶多核苷酸与通用引物组合，引物被设计成与修饰物靶多核苷酸特异性引物库，一种或多种靶特异性引物被设计成对靶多核苷酸的正向链或反向链(其在套叠引物或靶特异性套叠引物库，引物被设计成对靶多核苷酸的正向链或反向链进行扩用通用引物和一种或多种靶特异性引物两者，用多个循环的PCR扩增来对两个单独的混合多种靶特异性引物被设计成对靶多核苷酸的正向链或反向链(在第一扩增反应中不被靶向PCR扩增来对两种混合物进行扩增。该扩增的产物将是PCR产物库(其中的每个都已经独立被靶向的经片段化的DNA可以被纯化，并且被用于任何后续的下游过程(如第一ATO反应)任何混合物)可以是双链的，仅示出两条链中的一条(正向链)。描绘利用了聚合酶仅使用DNA(而非RNA)作为用于多核苷酸的延伸的引物的能力。第一轮ATO分子在一个或更多个位一旦被延伸将生成第一互补链。具有发夹的双链DNA将起作用以优先允许双链体在第二轮[0273]1.一种用于生成多核苷酸文库的可去苷酸合成过程中将尿嘧啶核苷酸并入RTO中以代替胸腺嘧啶核苷酸；其中剂是尿嘧啶-DNA酸合成过程中将核糖核苷酸并入RTO中以代替任何核苷酸或全部核苷酸；其中剂是核糖核[0283]5.如条款1所述的可去除的模板寡核苷酸，其中[0288](i)使用来自样品的靶多核苷酸作为引物并且使用条款1-8中任一项所述的可去除的模板寡核苷酸(RTO)作为模板来生成经修[0290](iii)使用第一引物生成经修饰的靶多核苷酸的第一互补序列(CS)，第一引物包括通用序列，款1-8中任一项所述的第二可去除的模板寡核苷酸(RTO)作为模板来生成经修饰的第一CS[0295]13.如条款11或12所述的方法，[0296]14.如条款11或12所述的方法，其[0301](ii)对来自(i)的至少两个含有相同UID的序列进行比对和/或对两个反应的相同[0302](iii)基于(ii)确定两个反应的共有序列和/或相同的变体序列，其中共有序列去除的模板寡核苷酸(RTO)和与NGS平台酸合成过程中将尿嘧啶核苷酸并入ATO中以代替胸腺嘧啶核苷酸；其中剂是尿嘧啶-DNA糖合成过程中将核糖核苷酸并入ATO中以代替任何核苷酸或全部核苷酸；其中剂是核糖核酸[0318]9.如条款5所述的衔接子模板寡核苷酸，其中N[0323](i)通过使用来自样品的靶多核苷酸作为引物并且使用条款1-12中任一项所述的[0324](ii)使用包括通用序列的第一引物并且使用经修饰的靶多核苷酸作为模板来生条款1-12中任一项所述的第二衔接子模板寡核苷酸(ATO)作为模板以及在ATO模板上延伸[0331]19.如条款16所述的方法，其中延伸操作[0332]20.如条款13-19中任一项所述的方法，其中第一引物[0336](ii)对来自(i)的至少两个含有相同UID的序列进行比对和/或对两个反应的相同[0337](iii)基于(ii)确定两个反应的共有序列和/或相同的变体序列，其中共有序列[0338]23.一种用于生成多核苷酸文库的试剂衔接子模板寡核苷酸(ATO)和与NGS平台相[0345]其中将ATO用作模板以指导第一反应，并且全部ATO或部分ATO不并入第一反应产酸合成过程中将尿嘧啶核苷酸并入ATO中以代替胸腺嘧啶核苷酸；其中剂是尿嘧啶-DNA糖合成过程中将核糖核苷酸并入ATO中以代替任何核苷酸或全部核苷酸；其中剂是核糖核酸[0353]9.如条款5所述的衔接子模板寡核苷酸，其中N[0356]12.如条款1所述的衔接子模板寡核苷酸，[0358]14.如条款13所述的衔接子模板[0361]17.如条款1所述的衔接子模板寡核苷[0362]18.如条款17所述的衔接子模板寡核苷酸，[0366](i)通过使用来自样品的靶多核苷酸来生成经修饰的靶多核苷酸，来自样品的靶多核苷酸在酶促第一反应中与条款1-20中任一项所述的衔接子模板寡核苷酸(ATO)(第一[0367](ii)使用包括通用序列的第一引物并且使用经修饰的靶多核苷酸作为模板来生[0373]27.如条款21所述的方法，方法还包[0374]28.如条款21所述的方法，方法还包括通过将[0376]30.如条款29所述的方法，其中特异性引物时，延伸与第一CS杂交的第二引物的操作包括将第一CS分成两个单独的反应，[0383](i)对条款21-35中任一项所述的经扩增的第一CS或经扩增的第二CS中的至少一[0384](ii)对来自(i)的至少两个含有相同UID的序列进行比对和/或对两个反应的相同[0385](iii)基于(ii)确定两个反应的共有序列和/或相同的变体序列，其中共有序列[0386]37.一种用于生成多核苷酸文库的试衔接子模板寡核苷酸(ATO)和与NGS平台相[0394]3.如条款2所述的衔接子合成过程中将核糖核苷酸并入ATO中以代替任何核苷酸或全部核苷酸；其中剂是核糖核酸[0413]22.如条款13所述的衔接子模板寡核[0414]23.如条款13所述的衔接子模板寡[0420]29.如前述条款中任一项所述酸外切酶活性耐受的一个或多个经修饰的核苷酸[0430]39.如条款1所述的衔接子模板寡核苷酸，[0431]40.一种组合物，组合物包括至少一个[0437](i)通过将靶多核苷酸与前述条款中任一项所述的组合物孵育来生成经修饰的靶多核苷酸，其中在酶促第一ATO反应中，靶多核苷酸的3’端与衔接子模板寡核苷酸(第一[0438]46.如条款45所述的方法，方法还包括([0439]47.如条款46所述的方法，靶多核苷酸中的双链启动子区的体外转录，经修饰的靶多核苷酸通过在含有RNA聚合酶启[0441]49.如条款46所述的方法，其中生[0442]50.如条款46所述的方法，其中第一互补序列(CS)之前或者在生成经修饰的靶多核苷酸的第一互补序列(CS)之后消化ATO第一互补序列(CS)之前或者在生成经修饰的靶多核苷酸的第一互补序列(CS)之后进行亲接子模板寡核苷酸(第二ATO)的3’随机序列杂交，其中使用ATO作为模板延伸第一CS的3’[0447]55.如条款46所述的方法，方法还包括[0449]57.如条款56所述的方法，其特异性引物时，延伸与第一CS杂交的第二引物的操作包括将第一CS分成两个单独的反应，[0450]58.如条款47所述的方法，其中生成第一CS[0456]64.如条款63所述的方法，其中对所述[0457]65.如条款63所述的方法，其中所述[0458]66.如条款65所述的方法，其中所述[0461]69.如条款63所述的方法，其中所[0475]76.如条款75所述的方法，其中天然[0476]77.如条款74所述的方法，其中对所[0478]通过在ATO上延伸单链靶多核苷酸来将衔接子序列添加到条款45-69中任一项所[0481]80.一种用于生成多核苷酸文库的试剂盒[0483]使用脱氧核糖核酸(DNA)作为靶多核苷酸，用于使用(例如但不限于)一种或多种一种或多种ATO之间的退火的适合的温度或时间进[0503]通过将靶多核苷酸用作引物并且将一种或多种衔接子模板寡核苷酸用作模板的[0504]将适量的与一种或多种适合的缓冲液和适合的dNTP混合的一种或多种DNA聚合酶酶缓冲液和10纳摩尔的每种dNTP(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)与DNA-ATO混合物组合至20μl的在其他能够促进核酸与一种或多种ATO之间的退火的适合的温度或时间进行孵育。在本实修饰的靶多核苷酸反应混合物中)，然后是37℃持续30分钟并且然后25℃持续15分钟的顺单位的PhusionDNA聚合酶、10μl的5×PhusionDNA[0510]将第一CS产物与适量的一种或多种第二衔接子模板寡核苷酸(例如但不限于，形钟至4℃,或者将核酸与一种或多种ATO的混合物在其他能够促进核酸与一种或多种ATO之[0511]通过将第一互补链用作引物并且将一种或多种第二衔接子模板寡核苷酸用作模[0512]将适量的与一种或多种适合的缓冲液和适合的dNTP混合的一种或多种DNA聚合酶(有校对活性或无校对活性、具有链置换活性或不具有链置换活性)(例如但不限于，Taq本实施例中的混合物在低于25℃孵育30分钟，或者在其他能够促进核酸与一种或多种ATO[0516]将经修饰的第一CS产物(纯化的或未纯化的)与下列组合：两种引物(一种引物与由一种或多种第一ATO形成的延伸序列具有序列相似性，并且被设计成与由一种或多种第一ATO形成的延伸序列结合，并且将含有与使用下一代测序技术进行测序相容且对于使用下一代测序技术进行测序所必需的序列(例如但不限于，与Illumina下一代测序仪相容的P5衔接子序列或P7衔接子序列、患者/样品索引序列、Illumina或自定义读序1或读序2序成与由一种或更多种第二ATO形成的延伸序列结合，并且还含有与使用下一代测序技术进行测序相容且对于使用下一代测序技术进行测序所必需的序列(例如但不限于，与Illumina下一代测序仪相容的P5衔接子序列或P7衔接子序列、患者/样品索引序列、的两种引物(2-002和2-003)中的每种、2单位的PhusionDNA聚合酶、10μl的5×PhusionDNA聚合酶缓冲液、10纳摩尔的每种dNTP(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)和1微摩尔的硫酸铵组合[0518]使用Agilent生物分析仪高灵敏度试剂盒评估最终完整测序文库，我们能够证明[0520]通过结合使用经片段化的gDNA的第一ATO反应、生成多个第一互补链的线性扩增成功验证了该技术方法用于在测序文库的生成中[0522]使用脱氧核糖核酸(DNA)作为靶多核苷酸，用于使用(例如但不限于)一种或更多种具有发夹的衔接子模板寡核苷酸来产生靶向扩增子下一代测序文库(例如但不限于，与1-006(总计100皮摩尔的ATO)至7.5μl的最终体积。如图13的(A)部分和(B)部分中所描绘[0542]通过将靶脱氧核糖核酸用作引物并且将一种或多种衔接子模板寡核苷酸用作模TAQDNA聚合酶缓冲液和5纳摩尔的每种dNTP(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)与DNA-ATO混合物组[0547]将经修饰的靶多核苷酸(纯化的或未纯化的)与下列组合：与最初在一种或多种或多个DNA融合)的DNA的区的靶特异性引物库、适量的一种或多种DNA聚合酶(有校对活性12纳摩尔的每种dNTP(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)、2单位的PhusionDNA聚合酶、10μl的5×[0549]将纯化的第一指数扩增产物与下列组合：第二套叠通用引物(其与第一通用引物将含有与使用下一代测序技术进行测序相容且对于使用下一代测序技术进行测序所必需含有与下一代测序技术相容且对于与下一代测序技术相容所必需的序列(例如但不限于，与Illumina下一代测序仪相容的P5衔接子序列或P7衔接子序列、患者/样品索引序列、Illumina或自定义读序1或读序2测序引物位点))、校对聚合酶(例如但不限于，Phusion12.5皮摩尔的2-005、50皮摩尔的靶特异性引物套叠库、5纳摩尔的每种dNTP(dATP/dTTP/[0551]第一指数扩增和第二指数扩增的组合能够成功扩增经修饰的靶多核苷酸的靶标区并且产生靶向扩增子文库。在第二指数扩增反应中包含SYBRgreen允许监测最终文库产的产物。使用Agilent生物分析仪高灵敏度试剂盒(产品ID5067-4626)评估最终完整测序配对端读序的插入片段尺寸的操作揭示了从26bp(滤除25bp或以下的插入片段)直至差不[0553]通过结合使用经片段化的gDNA的第一ATO反应、使用靶特异性引物库和第二靶特据的操作揭示了多于200个不同的具有相似水平的全部引物富集的靶标区的成功复合扩[0569]通过将靶脱氧核糖核酸用作引物并且将衔接子模板寡核苷酸用作模板的靶脱氧[0572]将纯化的或未纯化的靶脱氧核糖核酸延伸(经修饰的多核苷酸)产物与适合的缓于，T7RNA聚合酶(如果已经使用T7RNA聚合酶启动子的话))在适合的时间和温度组合以[0574]在用于产生经修饰的靶多核苷酸的第一ATO反应中使用含有被设计成当为双链时充当RNA聚合酶的启动子的序列的ATO。由于该第一反应的产物被用于生成总计2μgRNA的RNA-Seq和cDNA合成)中任何一用(例如但不限于)一种或多种衔接子模板寡核苷酸和与ATO互补的第二寡核苷酸来将DNA扩增成RNA，一种或多种衔接子模板寡核苷酸含有与RNA聚合酶启动子相容并且能够用作RNA聚合酶启动子的序列以及由核苷酸序[0593]通过将靶脱氧核糖核酸用作引物并且将一种或多种衔接子模板寡核苷酸用作模[0598]将纯化的或未纯化的靶脱氧核糖核酸延伸产物和与最初在一种或多种ATO上并且温度(在本实施例中，95℃)加热便利双链核酸变性成单链所必需的适合的时间(在本实施[0602]在用于产生经修饰的靶多核苷酸的第一ATO反应中使用含有被设计成当为双链时充当RNA聚合酶的启动子的序列的ATO。由于该第一反应的产物被用于生成RNA的体外转录[0606]使用脱氧核糖核酸(DNA)作为靶多核苷酸，用于并入RNA聚合酶的启动子以使用(例如但不限于)一种或多种具有发夹(茎-环)结构的衔接子模板寡核苷酸来产生DNA至RNA[0624]通过将靶脱氧核糖核酸用作引物并且将一种或多种衔接子模板寡核苷酸用作模[0627]将经修饰的靶多核苷酸反应混合物和与一种或多种适合的缓冲液和适合的dNTP苷酸反应、2单位的PhusionDNA聚合酶、6μl的5×Phusion缓冲液、5纳摩尔的每种dNT(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)。将混合物在适合的温度(在本实施例中，95℃)加热适合的时间互补的区(例如但不限于，由于包含两个部分互补或完全互补的区而形成发夹的核苷酸序[0633]在用于产生经修饰的靶多核苷酸的第一ATO反应中使用含有被设计成当为双链时[0635]可以将被设计成充当RNA聚合酶启动子的核苷酸序列与内部发夹和延伸序列组合度上将少量DNA扩增成RNA，RNA然后可以被用作用于许多下游应用(包含RNA-Seq和cDNA合[0637]使用脱氧核糖核酸(DNA)作为靶多核苷酸，用于使用(例如但不限于)一种或多种具有发夹的衔接子模板寡核苷酸来产生下一代测序文库(例如但不限于，与Illumina下一定设计的序列或特定选择的序列分开的两个部分互[0655]通过将靶脱氧核糖核酸用作引物并且将一种或多种衔接子模板寡核苷酸用作模且在70℃孵育10分钟或者在造成S1核酸酶失活的相似温度和时间进行孵育来使定设计的序列或特定选择的序列分开的两个部分互[0665]通过将第一CS用作引物并且将第二衔接子模板寡核苷酸用作模板的第一CS延伸[0676]通过结合使用经片段化的gDNA的第一ATO反应、生成双链DNA的自退火和延伸过二ATO反应并随后进行全局性扩增，我们已经成功验证了该技术方法用于在测序文库的生[0678]使用脱氧核糖核酸(DNA)作为靶多核苷酸，用于使用(例如但不限于)一种或多种具有发夹的衔接子模板寡核苷酸和双链或部分双链的普通衔接子来产生下一代测序文库定设计的序列或特定选择的序列分开的两个部分互补或完全互补的短区产生(1-022)。通过将靶多核苷酸用作引物并且将衔接子模板寡核苷酸用作模板双链第一CS的操作和将衔接子连接到可用端的操作成功产生了用于最终指数扩增的模板，成功验证了该技术方法用于在测序文库的生成中[0708]使用脱氧核糖核酸(DNA)作为靶多核苷酸以使用(例如但不限于)一种或多种具有[0725]通过将靶多核苷酸用作引物并且将一种或多种衔接子模板寡核苷酸用作模板的[0738]使用脱氧核糖核酸(DNA)作为靶多核苷酸，用于使用(例如但不限于)一种或多种板寡核苷酸和双链或部分双链的普通衔接子来产生无PCR下一代测序文库(例如但不限于，[0756]通过将靶多核苷酸用作引物并且将衔接子模板寡核苷酸用作模板的靶多核苷酸[0761]将纯化的靶核酸延伸产物与下列组合：与现在存在于经修饰的靶标DNA分子的3’[0769]使用脱氧核糖核酸(DNA)作为靶多核苷酸，用于使用(例如但不限于)一种或多种单链衔接子模板寡核苷酸来产生下一代测序文库(例如但不限于，与Illumina下一代测序[0786]通过将靶多核苷酸用作引物并且将一种或多种衔接子模板寡核苷酸用作模板的[0794]通过将第一互补链用作引物并且将第二衔接子模板寡核苷酸用作模板的第一互[0801]使用单链ATO，我们可以表明基因组下一代测序文库的成功完成(类似于实施例1[0803]通过结合使用经片段化的gDNA的第一ATO反应、生成多个第一互补链的线性扩增成功验证了该技术方法用于在测序文库的生成中[0805]使用脱氧核糖核酸(DNA)作为靶多核苷酸，用于使用(例如但不限于)一种或多种被分成两条互补链的衔接子模板寡核苷酸来产生下一代测序文库(例如但不限于，与[0823]通过将靶脱氧核糖核酸用作引物并且将一种或多种衔接子模板寡核苷酸用作模[0831]通过将第一互补链用作引物并且将第二衔接子模板寡核苷酸用作模板的可选的[0838]使用被分成两条互补链的ATO，我们可以表明基因组下一代测序文库的成功完成[0840]通过结合使用经片段化的gDNA的第一ATO反应、生成多个第一互补链的线性扩增成功验证了该技术方法用于在测序文库的生成中[0842]使用脱氧核糖核酸(DNA)作为靶多核苷酸，用于使用(例如但不限于)一种或多种具有发夹(茎-环)的靶特异性衔接子模板寡核苷酸(ATO)来产生靶向扩增子下一代测序文RNA聚合酶启动子序列。[0860]通过将靶脱氧核糖核酸用作引物并且将一种或多种衔接子模板寡核苷酸用作模[0871]通过结合使用经片段化的gDNA和ATO库的第一ATO反应、两轮靶特异性扩增的过[0873]在单轮PCR中，使用脱氧核糖核酸(DNA)作为靶多核苷酸，用于使用(例如但不限于)一种或多种具有发夹(茎-环)的靶特异性衔接子模板寡核苷酸(ATO)来产生靶向扩增子[0889]具有下列5’尾AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT的靶[0893]通过将靶多核苷酸用作引物并且将一种或多种衔接子模板寡核苷酸用作模板的的一个或多个保守序列具有序列相似性，并且被设计成与通过一种或多种ATO引入的一个或多个保守序列结合，其含有与下一代测序技术相容且下一代测序技术所必需的序列(例引序列、Illumina或自定义读序1或读序2序列))、被设计成靶向接近于ATO寡核苷酸库的DNA的区的引物库(其也靶向含有感兴趣突变的DNA的区，并且也含有与下一代测序技术相容且对于与下一代测序技术相容所必需的序列(例如但不限于，与Illumina下一代测序仪[0900]使用单轮指数扩增(而非如实施例2中所示的两轮)，我们能够生成靶标扩增子下[0902]通过结合使用经片段化的gDNA的第一ATO反应、使用靶特异性引物库和通用引物[0904]使用核糖核酸(RNA)作为靶多核苷酸，用于使用(例如但不限于)一种或多种具有发夹的衔接子模板寡核苷酸来产生下一代测序文库(例如但不限于，与Illumina下一代测[0921]通过将靶核糖核酸用作引物并且将一种或多种衔接子模板寡核苷酸用作模板的[0929]通过将第一互补链用作引物并且将第二衔接子模板寡核苷酸用作模板的第一互补链的线性扩增的过程、使用第一互补链作为靶多核苷酸的第二ATO反应并随后进行全局[0940]使用脱氧核糖核酸(DNA)作为靶多核苷酸，用于使用(例如但不限于)一种或多种[0956]通过将靶脱氧核糖核酸用作引物并且将一种或多种RNA衔接子模板寡核苷酸用作[0964]通过将第一互补链用作引物并且将第二衔接子模板寡核苷酸用作模板的第一互[0975]使用核糖核酸(RNA)作为靶多核苷酸，用于使用(例如但不限于)一种或多种具有[0990]将适量的任何长度的经片段化或未经片段化的核糖核酸(RNA)在适合的缓冲液中10纳摩尔的每种dNTP(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)组合在20μl的最终体积中。将混合物在适合却(在本实施例中，冷却5分钟至25℃,或者其他能够促进核酸与一种或多种基因特异性引[0993]通过将cDNA用作引物并且将一种或多种衔接子模板寡核苷酸用作模板的cDNA延伸[0998]将经修饰的cDNA与下列组合：与通过一种或多种ATO引入的保守序列互补的通用合酶、10μl的5×phusionDNA聚合酶缓冲液和10纳摩尔的每种dNT(dATP/dTTP/dCTP/品索引序列、Illumina或自定义读序1或读序2序列)。扩增产物可以通过任何适合的方法量基因特异性引物的多重扩增以鉴别大量转录[1006]使用脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的混合物作为靶多核苷酸，用于使用生)的衔接子模板寡核苷酸来产生组合的DNA和RNA下一代测序文库(例如但不限于，与[1025]通过将靶核酸用作引物并且将一种或多种衔接子模板寡核苷酸用作模板的靶核[1033]通过将第一互补链用作引物并且将第二衔接子模板寡核苷酸用作模板的第一互[1040]使用与实施例1中的方法类似的方法，我们能够将RNA和DNA两者组合以产生下一[1042]能够将DNA和RNA组合以生成混合测序文库的操作允许许多潜在的应用(尤其是考[1044]使用脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的混合物作为靶多核苷酸，用于使用(例如但不限于)具有发夹的多种衔接子模板寡核苷酸来产生组合的DNA和RNA下一代测序[1063]通过将靶脱氧核糖核酸(而非核糖核酸)用作引物并且将衔接子模板寡核苷酸用[1064]将与一种或多种适合的缓冲液和适合的dNTP混合的适量的一种或多种DNA聚合酶(能够使用DNA引物(而非RNA引物)、有校对活性或无校对活性)(例如但不限于，DeepVentRTMDNA聚合酶、LongAmp8热启动TaqDNA聚合酶、或oneTaq热启动DNA聚合酶)与×DeepVentRDNA聚合酶缓冲液和10纳摩尔的每种dNTP(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)与DNA-种或多种缓冲液的情况下进一步促进靶核酸和一种或多种ATO退火，将混合物在低于25℃孵育30分钟，或者将混合物在其他能够促进核酸与一种或多种ATO之间的退火的适合的温将孵育温度增加到37℃持续30分钟，或者将孵育温度增加到其他能够促进DNA聚合酶活性[1071]通过将靶核糖核酸用作引物并且将衔接子模板寡核苷酸用作模板的靶核糖核酸[1072]将与一种或多种适合的缓冲液和适合的dNTP混合的适量的一种或多种DNA聚合酶l的10×Klenow缓冲液和10纳摩尔的每种dNTP(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)与DNA-ATO混合物组者将混合物在其他能够促进核酸与一种或多种ATO之间的退火的适合的温度或时间进行孵[1079]第三衔接子模板寡核苷酸退火成一种或多种延伸产物或一种或多种线性扩增产物[1081]通过将线性延伸产物用作引物并且将一种或多种第三衔接子模板寡核苷酸用作模板的线性延伸产物延伸以形成第二衔接子模板[1088]使用与实施例1中的方法类似的方法，我们能够将RNA和DNA两者组合以产生下一分离来源于DNA靶多核苷酸的读序和来源于RNA靶多核苷酸的读序的能力允许许多潜在的得可以对其进行不同扩增以增加最终测序文库中的DN互补的短区产生)的衔接子模板寡核苷酸和与发夹连接的双链衔接子来产生适用于滚环扩[1109]通过将靶脱氧核糖核酸用作引物并且将一种或多种衔接子模板寡核苷酸用作模[1118]使用可以形成发夹的ATO与具有发夹的衔接子的组合，我们已经成功产生了环状[1137]通过将靶脱氧核糖核酸用作引物并且将一种或多种衔接子模板寡核苷酸用作模[1145]通过将第一互补链用作引物并且将一种或多种第二衔接子模板寡核苷酸用作模单链的温度或时间进行加热。随后将延伸产物冷却(在本实施例中冷却2分钟至25℃,或者可以将环状DNA分子用作用于环状DNA的滚[1172]通过将靶PCR产物用作引物并且将一种或多种衔接子模板寡核苷酸用作模板的靶有与下一代测序技术相容且下一代测序技术所必需的序列(例如但不限于，与Illumina下环境样品(其中使用大量高度相似的扩增子)具有应[1183]使用脱氧核糖核酸(DNA)作为靶多核苷酸，用于产生两种靶向扩增子下一代测序[1201]通过将靶脱氧核糖核酸用作引物并且将一种或多种衔接子模板寡核苷酸用作模计成靶向含有感兴趣变化的DNA的靶标区的一条DNA链，而库2被设计成靶向靶标区的互补[1208]如实施例2中，除了使用两个单独的套叠引物库，相对于第一引物库(库1a或库的DNA的区并且也含有与下一代测序技术相容且对于与下一代测序技术相容所必需