DB44T-实验动物 病毒PCR定性分析编制说明

广东省地方标准《实验动物病毒PCR定性分析》（报批稿）编制说明联系人：王静联系电话制单位：广东省实验动物标准化技术委员会时间：2021年6月10日

《实验动物病毒PCR定性分析》（报批稿）编制说明工作概况。包括任务来源（立项文件）、协作单位、分工等。根据广东省市场监督管理局下达的《广东省市场监督管理局关于批准下达省地方标准修订计划项目的通告》（2019年第7号），《实验动物病原微生物PCR检测第1部分：病毒》等9个项目列入广东省地方标准修订计划，起草单位为广东省实验动物监测所，技术归口于广东省实验动物标准化技术委员（GD/TC）。审定会后，相关专家建议变更标准名称，工作组经研讨和征求意见，将标准名称变更为《实验动物病毒PCR定性分析》。广东省实验动物监测所按照地方标准研制要求和编写工作的程序，组成了由单位专家和专业技术人员参加的编制工作组，明确任务分工，经多次讨论和论证，意见征集及修改，完成了标准稿的编写。立项的必要性实验动物作为研究材料或研究条件，其标准化程度至关重要的。标准的研究制定与发布实施是实验动物标准化的技术措施，是开展实验动物标准化管理的重要依据。我国自1994年实验动物国家标准首次发布实施以来到现在，内容不断完善，已颁布实施87项实验动物国家标准，涉及动物质量要求的标准4项，其他为相关支撑条件和检测方法的标准。与国际先进标准相比较，我国实验动物标准还相对滞后，表现在标准的动物种类覆盖范围有限，标准的检测技术落后，不能及时地跟进国际先进标准。近年来，实验动物新的疾病病原不断出现，新的检测技术不断更新，仅靠国家标准的制定和更新已不能满足我国实验动物质量管理的需求。广东省是实验动物生产和使用量较高的地区，实验动物质量管理水平处于全国前列。2010年广东省率先在国内颁布实施《广东省实验动物管理条例》，实现实验动物法制化、标准化管理。条例中明确提出:“实验动物的质量监控，执行国家标准；国家尚未制定标准的，执行行业标准；国家、行业均未制定标准的，执行地方标准。”因此，对需要利用尚无国家标准但有地方标准的实验动物开展相关科学研究、生物技术产品生产、效能性和安全性评价的机构来讲，依据地方标准创建实验动物许可的符合性条件，以获得行政许可十分重要。为弥补国标更新滞后的短板，制定国家标准中没有、应用急需的、与国际先进标准接轨的地区行业标准十分必要。当前，我国实验动物质量检测方法国标主要以针对抗体检测的血清学检测方法为主。但是抗体检测有一定局限性，不能应用于非血清样本的检测，如对免疫缺陷动物、动物接种物、生物制品、病死动物或环境样本的检测。以PCR技术为基础的病原学检测方法，针对特定病原体核酸序列中的保守片段设计特异性引物，检测某一种特定的病毒、细菌或寄生虫，具有特异性强、敏感度高、诊断快速等优点，可应用于实验动物疾病感染的早期诊断，以及非血清样本的检测，更加适用于实验动物进出口需求量较大的沿海发达地区的动物质量评价应用。广东省实验动物监测所在国家科技支撑计划(2009BAK61B04、2013BAK11B01、2015BAI07B01）,广东省科技计划（2007A060305003、2011B040200010）、广州市科技计划（2060503）等多个国家及省级项目的支持下，成功建立了大鼠、小鼠、豚鼠、犬、猴、兔、禽等8种等实验动物病原微生物PCR检测技术体系，通过临床样本试验证明建立的方法敏感高、特异强、重复性好，该系列检测方法获得了2018年实验动物学会科学技术二等奖，得到了国内实验动物同行一致好评。然而，由于行政许可要求，非标检测技术不能用于行政许可监督检测中，严重阻碍了许可监督的时效性，迫切希望能将这一先进技术建立地方标准，引入到我省的实验动物行政许可监督中。标准编制原则，标准框架、主要内容及其确定依据本标准的编制遵循科学性、可操作性和协调性原则。（1）科学性原则。在尊重科学、亲身实践、调查研究的基础上，制定本标准。（2）可操作性原则。本标准以满足实际需要出发，无论从样品采集，处理及实验分析，均具有可操作性和实用性。（3）协调性原则。以切实提高我国实验动物病原微生物检测技术水平为核心，符合我国现行有关法律、法规和相关的标准要求。本标准由范围、规范性引用文件、术语、定义、缩略语、原理、主要设备和材料、试剂、方法、结果、防止交叉污染的措施共十章及附录部分构成。（1）范围：规定了本标准的适用范围。（2）规范性引用文件（3）术语和定义：为方便标准的使用，本标准对标准中所涉及的术语和定义进行了解释和说明。（4）缩略语：对标准中出现的略缩语进行了说明。（5）原理：简要介绍了标准中采用的技术方法原理。（6）主要设备和材料：规定了检测方法所需要的设备和材料。（7）试剂：规定了检测方法所需要的试剂。（8）方法：规定了检测方法的关键步骤和操作要点，包括以下内容：8.1生物安全措施8.2采样及样本处理8.3核酸提取8.4PCR方法8.4.1普通PCR：规定了普通PCR操作规程和反应体系及反应参数。8.4.2普通RT-PCR：规定了逆转录PCR操作规程和反应体系及反应参数。8.4.3巢式PCR：规定了巢式PCR操作规程和反应体系及反应参数。8.4.4规定了PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测和拍照8.5实时荧光PCR8.5.1实时荧光PCR：规定了实时荧光PCR操作规程和反应体系及反应参数。8.5.2实时荧光RT-PCR：规定了实时荧光RT-PCR操作规程和反应体系及反应参数。9.结果：规定了普通PCR和实时荧光PCR结果判定的条件和要求。9.1普通PCR/普通RT-PCR/巢式PCR9.2实时荧光PCR/实时荧光RT-PCR9.3序列测定：必要时，可取待检样本扩增出的阳性PCR产物进行核酸序列测定。10．防止交叉污染的措施附录部分包括：附录A溶液的配制：给出了试剂的配制方法。附录B引物及探针序列：给出了检测病原核酸特异性引物及探针序列及反应参数。（四）与有关的现行法律、法规和强制性标准的关系本标准的编制依据为现行的法律、法规和国家标准，与这些文件中的规定相一致。目前实验动物国家标准没有相应的实验动物病原PCR方法标准，本标准方法是对现有标准的有利补充。（五）标准有何先进性或特色性（与新《标准化法》第十三条相呼应）当前，在实验动物检测方法国家标准中，以针对抗体检测的血清学检测方法为主。但是抗体检测有一定局限性，不能应用于非血清样本的检测，如对免疫缺陷动物、动物接种物、生物制品、病死动物或环境样本的检测。以PCR技术为基础的病原学检测方法，针对特定病原体核酸序列中的保守片段设计特异性引物，检测某一种特定的病毒、细菌或寄生虫，具有特异性强、敏感度高、诊断快速等优点，可应用于实验动物疾病感染的早期诊断，无血清样本的检测。本项目提出的《实验动物病毒PCR定性分析》标准、《实验动物病原菌PCR定性分析》是国内首次系统性提出实验动物病原微生物PCR检测方法。创造性地规定并统一PCR检测方法，有利于标准的实施和应用。广东省实验动物监测所应用项目中方法先后为中山大学、中国科学院广州生物医药与健康研究院、中山大学附属第一医院等多家单位提供病原检测技术服务，检测约1200余份样品，并获得客户认可。此外该方法应用于我省基因工程小鼠的环境样本中MHV病原的监测及净化取得了良好效果，保障了生产单位珍贵动物的健康，为我省科技发展提供良好支撑服务。2017年项目承担单位将系列实验动物病原微生物PCR检测方法申报为实验动物学会团体标准并获得通过，面向全国实验动物行业发布实施。2018年，该系列PCR检测方法团体标准获得了2018年实验动物学会科学技术二等奖，得到了国内实验动物同行一致好评。广东省是实验动物生产和使用量较高的地区，广东省地方标准的提出，是结合广东省本地行业发展的特点及趋势，以及广东省实验动物监测所在实验动物病原微生物检测技术研发的重大成果，将本地区优势技术方法形成的技术标准，运用标准化手段，可以共同提升广东省实验动物质量水平。发挥我省实验动物管理创新，推进我省科技成果转化为先进标准，与国际先进技术接轨，深化标准化工作改革提供试点经验和示范引领，为我省生命科技创新和生物医药产业提供基础支撑作用。符合《中华人民共和国标准化法》第十三条要求。（六）标准调研、研讨、征求意见情况。重大分歧意见的处理和依据。广东省实验动物监测所按照地方标准研制要求和编写工作的程序，组成了由单位专家和专业技术人员参加的标准编制工作组，讨论并确定了标准编制的原则和指导思想，制定了编制大纲和工作计划，并就编写工作进行了任务分工。编制组在国家科技支撑计划“实验动物质量检测关键技术研究”（项目编号2013BAK11B01）和广东省科技计划项目“广东省实验动物检测技术平台”（项目编号2011B040200010）课题研究基础上，组织编写了《实验动物病毒PCR定性分析》技术资料，于2019年6月完成了标准初稿的编制，2019年6月至2019年12月完成了标准技术的验证总结和材料整理。形成标准征求意见稿，并面向广东省实验动物标准化技术委员会专家发放意见征求。2020年3月~4月收到专家返回意见共38条，编制组对专家意见进行了多次研讨，专家返回意见中较多问题是书写格式不够规范，文字描述不够准确等。针对专家意见，编制组认真梳理了标准稿的格式和文字，对专家提出的问题逐一修改，共计采纳意见32条，进一步修改和完善了标准稿，2020.9月完成标准送审稿。从标准结构框架和制定原则的确定、标准的引用、有关技术指标和参数的试验验证、主要条款的确定直到标准草稿征求专家意见（通过函寄和会议形式多次咨询和研讨），均未出现重大意见分歧的情况。（七）技术指标设置的科学性和可行性，量化指标的确定依据。以小鼠肝炎病毒，小鼠脑脊髓炎病毒、小鼠细小病毒、猴免疫缺陷病毒等病毒为例，详述本标准技术指标设置的科学性和可行性，量化指标的确定依据。（1）小鼠肝炎病毒PCR方法：小鼠肝炎病毒（murinehepatitisvirus，MHV）属于冠状病毒科成员，是一类RNA病毒，最早于1949年发现，此后研究者们先后从小鼠和新生乳鼠中分离到MHV。MHV带毒小鼠分布于全世界，正常情况下呈隐性感染，只在应激因素激发下才成为致死性疾病，表现为肝炎、脑炎和肠炎。MHV是目前我国标准控制病原中发病率最高的病原，不仅严重影响实验小鼠质量，还对科学研究工作造成潜在干扰，影响实验结果的准确性和重复性，是现行国标中SPF级小鼠必须排除的病原，也是实验动物中污染最严重的病原。根据Genbank中收录的MHV-1毒株（GenBank登录号为FJ647223）序列为模板，针对保守的M蛋白基因，设计一套荧光定量PCR引物和探针。建立MHV荧光定量PCR检测方法，优化最佳反应体系和反应条件，构建RNA标准品，进行敏感性、特异性、稳定性试验，以及对临床样本进行临床应用验证和国内其他实验动物检测机构对该方法的验证，完成该标准的制定。MHV荧光定量PCR方法特异性强，与小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）、小鼠诺如病毒（MNV）、仙台病毒（SV）、小鼠肺炎病毒（PVM）、呼肠孤病毒III型（Reo-3）、汉坦病毒（HV）和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）不发生交叉反应。敏感性试验显示该方法可以检测到10copies/μLRNA标准品（图1）。通过对1×105copies/μL~1×102copies/μL4个稀释度RNA进行重复性检测，批内及批间重复性试验的变异系数均小于2%，表明建立荧光定量RT-PCR方法重复性好，方法稳定可靠。图1MHV敏感性试验结果1-9：1×109copies/μL至1×101copies/μL标准品，10：1×100copies/μL标准品和无模板对照应用该方法对MHV人工感染试验小鼠的盲肠内容物、粪便、肝脏以及肺脏进行检测，结果表明肺脏中早先检出MHV，检出时间为感染后第2d，但检出率较低，为1/5；在感染后第4d，盲肠、粪便和肝脏也检出MHV。因此，在首次检出时间上，肺脏作为检测样本不具备明显优势。从样本带毒的持续性来看，肝脏排毒时间稍短，感染后第56d阳性检出率为0/5，但肺脏、盲肠和粪便均可检出MHV。与血清学检测比较，PCR检测可以检测病毒早期感染，而且，在MHV检测中，盲肠内容物/粪便是最佳选择的检测样本（表1）。表1MHV荧光定量RT-PCR和血清学检测结果感染时间（天）荧光定量PCRELISA肺脏肝脏盲肠粪便血清00/50/50/50/50/521/50/50/50/50/545/53/55/55/50/585/51/55/55/55/5143/54/55/55/55/5211/51/53/54/55/5281/51/55/52/55/5351/54/54/51/55/5422/51/54/51/55/5561/50/55/53/55/5840/50/50/50/55/5MHV定性分析PCR方法验证：建立标准方法后，广东省实验动物监测所组织实验室间比对试验，通过提供感染动物的组织，由中国医学科学院医学实验动物研究所、苏州西山生物技术有限公司、上海实验动物研究中心三家实验间检测方法比对验证，结果广东省实验动物监测所采用建立的团体标准方法鉴定的结果与其它三家的结果一致（表2）。表2MHV荧光定量PCR方法三家验证结果参加比对实验单位样本编号样本原始信息检测方法检测结果结果符合性中国医学科学院医学实验动物研究所T20170703-D1MHV阳性PCRMHV阳性一致苏州西山生物技术有限公司T20170703-D2MHV阳性qPCRMHV阳性一致上海实验动物研究中心T20170703-D4MHV阳性PCRMHV阳性一致广东省实验动物监测所T20170703-D7MHV阳性qPCRMHV阳性一致(2)小鼠脑脊髓炎病毒PCR检测方法小鼠脑脊髓炎是由Theiler’s小鼠脑脊髓炎病毒（Theiler’smurineencephalomyelitisvirus，TMEV）引起的主要侵害小鼠中枢神经系统的病毒性疾病，多数呈隐性感染，有时表现脑脊髓炎和后肢麻痹等症状。小鼠脑脊髓炎在我国小鼠群中广泛存在，感染率达8-35%[16]。近年研究发现，大鼠也可以自然感染TMEV病毒，大鼠乳鼠脑内接种TMEV病毒可以导致动物发生后肢瘫痪、被毛蓬乱和体重减轻等症状[17]。TMEV不仅严重影响实验小鼠质量，还对科学研究工作造成潜在干扰，影响实验结果的准确性和重复性，是目前国标中SPF级小鼠需要排除的病原体。本项目根据Genbank中收录的TMEVGDVII毒株（GenBank登录号为X56019）序列为模板，针对保守的UTR片段基因，设计一套荧光定量PCR引物和探针，使用MAGE软件与Genbank中不同毒株的基因序列进行序列比对分析，以保证引物和探针序列的通用型。建立TMEV荧光定量PCR检测方法，优化最佳反应体系和反应条件。构建RNA标准品，进行敏感性、特异性、稳定性试验，以及对临床样本进行应用验证和国内其他实验动物检测机构对该方法验证，完成该标准制定。TMEV荧光定量PCR方法特异性强，与小鼠细小病毒MVM株（MVM）、鼠痘病毒（Ect）、多瘤病毒（Poly）、腺病毒（Mad）、小鼠巨细胞病毒（MCMV）、大鼠冠状病毒（RCV）、大鼠细小病毒KRV株（KRV）、大鼠细小病毒H-1株（H-1）、MHV、MNV、SV、PVM、Reo-3、HV和LCMV不发生交叉反应。敏感性检测显示该方法可以检测到10copies/μLRNA标准品（图2）。通过对1×105copies/μL~1×102copies/μL4个稀释度RNA进行重复性检测，批内及批间重复性试验的变异系数均小于2%，表明建立荧光定量RT-PCR方法重复性好，方法稳定可靠。图2TMEV敏感性试验结果1-8：1×108copies/μL至1×101copies/μL标准品，9：1×100copies/μL标准品和无模板对照采用ELISA和qRT-PCR两种方法对广东省一个实验设施的小鼠进行6年的跟踪检测，该设施TMEV抗体阳性率和核酸阳性率分别为34.33%和35.32%（n=201)，结果见图3。采用配对计数资料McNemar法进行一致性检验，用Kappa值进行评价，统计分析结果表明：以ELISA检测结果为标准，荧光定量PCR结果与其比较，差异无统计学意义（p=0.868），说明两种方法诊断TMEV感染结果一致。两种检测方法吻合系数Kappa=0.605（p=0.000），说明两种检测方法具有较好的一致性（表3）。图32010~2015年某设施TMEV感染情况表13ELISA与qRT-PCR检测小鼠临床样本结果比较ELISAqRT-PCR合计Total+-+521769-19113132合计Total71130201注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。应用qRT-PCR方法对16只自然感染小鼠粪便、盲肠内容物、脑、脾脏、肝脏、心脏、肺脏、肾脏和胃等主要脏器进行检测，查看TMEV病毒在小鼠体内的分布情况。结果发现粪便和盲肠内容物中检出率最高，其次是脑和肝脏，小鼠脾脏、心脏、肺脏、肾脏和胃也可检出TMEV核酸，结果见表4。因此在使用qRT-PCR方法进行TMEV检测时，粪便、盲肠内容物和脑是最佳的待检样本。表4TMEV病毒在自然感染小鼠脏器中的分布器官粪便盲肠内容物脑脾脏肝脏心脏肺脏肾脏胃感染率16/1616/1610/163/168/162/163/162/163/16TMEV定性分析PCR方法验证：建立标准方法后，广东省实验动物监测所组织实验室间比对试验，通过提供TMEV感染的组织样品，由中国医学科学院医学实验动物研究所、苏州西山生物技术有限公司、上海实验动物研究中心三家实验间检测方法比对验证，结果广东省实验动物监测所采用建立的团体标准方法结果与其它三家的结果一致（表5）。表5TMEV荧光定量PCR方法三家验证结果参加比对实验单位样本编号样本原始信检测方法检测结果结果符合性中国医学科学院医学实验动物研究所T20170703-H1TMEV阳性PCRTMEV阳性一致苏州西山生物技术有限公司T20170703-H2TMEV阳性PCRTMEV阳性一致上海实验动物研究中心T20170703-H4TMEV阳性PCRTMEV阳性一致广东省实验动物监测所T20170703-H7TMEV阳性PCRTMEV阳性一致（3）小鼠细小病毒MVM株PCR检测方法小鼠细小病毒MVM株(Minutevirusofmice，MVM)属于细小病毒科细小病毒属，核酸为单股线状DNA，核衣壳为二十面体等轴立体对称，无囊膜。小鼠细小病毒MVM株具有高度传染性，广泛存在实验小鼠和野生小鼠群中。在大多数小鼠群中呈地方性流行。同时也是白血病病毒种毒和连续移植小鼠肿瘤的一种常见的污染物[6]，MVM是国内外实验动物健康监测的一个必检项目。本项目根据Genbank中收录的MVM毒株（GenBank登录号为NC001510）序列为模板，针对VP2蛋白基因，设计一套荧光定量PCR引物和探针，使用MAGE软件与Genbank中不同毒株的基因序列进行序列比对分析，以保证引物和探针序列的通用型。建立MVM荧光定量PCR检测方法，通过优化最佳反应体系和反应条件，构建质粒DNA标准品，进行敏感性、特异性、稳定性试验，以及对临床样本进行临床应用验证和国内其他实验动物检测机构对该方法验证，完成该标准制定。MVM荧光定量PCR方法特异性强，与MPV、KRV、H-1、RPV、RMV、Ect、Poly、Mad、MCMV、MHV、MNV、TMEV和Reo-3不发生交叉反应。敏感性检测显示该方法可以检测到100copies/μL质粒DNA标准品（图4）。通过对1×106copies/μL~1×106copies/μL4个稀释度RNA进行重复性检测，批内及批间重复性试验的变异系数均小于3%，表明建立荧光定量RT-PCR方法重复性好，方法稳定可靠。图4MVM敏感性检测结果1-7：1×108copies/μL至1×102copies/μL质粒标准品，8：1×101copies/μL、1×100copies/μL质粒和无模板对照应用MVM荧光定量PCR方法对176份样本进行检测，同时普通PCR方法进行检测，比较两种方法的阳性检出率（表6）。结果发现荧光定量PCR比普通PCR敏感。表6MVM荧光定量PCR临床样本检测结果临床样品阳性数/样本数（检出率，％）MVM荧光定量检测方法普通PCR检测方法SPF级小鼠0/100（0%）0/100（0%）普通环境下饲养的KM小鼠9/52（17.3%）6/52（11.5%）野鼠2/24（8.3%）0/24（0%）合计11/176（6.3%）6/176（3.4%）MVM定性分析PCR方法验证：建立方法后，广东省实验动物监测所组织实验室间比对试验，通过提供感染组织样品，由中国医学科学院医学实验动物研究所、苏州西山生物技术有限公司、上海实验动物研究中心三家实验间检测方法比对验证，结果广东省实验动物监测所采用团体标准检测的结果与其它三家单位一致（表7）。表7MVM荧光定量PCR方法三家验证结果参加比对实验单位样本编号样本原始信检测方法检测结果结果符合性中国医学科学院医学实验动物研究所T20170703-G1MVM阳性PCRMVM阳性一致苏州西山生物技术有限公司T20170703-G2MVM阳性PCRMVM阳性一致上海实验动物研究中心T20170703-G4MVM阳性PCRMVM阳性一致广东省实验动物监测所T20170703-G7MVM阳性PCRMVM阳性一致（4）猴免疫缺陷病毒PCR方法的建立猴免疫缺陷病毒（SIV）属于逆转录病毒科，正逆转录病毒亚科，慢病毒属。病毒基因组的复制和转录都需要经过DNA中间体，这种DNA中间体称为前病毒。在临床检测中可通过检测样本中的SIVRNA或前病毒DNA进行诊断。本项目根据猴免疫缺陷病毒保守序列病毒核酸保守序列gag基因列设计巢式PCR引物Gag-outF/R和Gag-inF/R，并设计一对荧光PCR引物及探针；通过巢式PCR或实时荧光PCR对cDNA进行扩增，也可以直接提取样本DNA，对SIV前病毒DNA进行PCR扩增，根据PCR或实时荧光PCR检测结果判定该样品中是否含有病毒核酸成分。建立SIV巢式PCR方法和荧光定量PCR检测方法，通过优化最佳反应体系和反应条件，构建质粒DNA标准品，进行敏感性、特异性、稳定性试验，以及对临床样本进行临床应用验证和国内其他实验动物检测机构对该方法验证，完成该标准制定。使用荧光PCR法对SIV、SRV-1、SRV-2、SRV-3、SRV-4、SRV-5、STLV前DNA进行检测，结果除SIV为阳性外，其他病毒均为阴性，用空白Cem174细胞DNA和水空白对照也均未出现扩增，表明建立的方法具有良好的特异性（图5，图6）。通过敏感性检测，巢式SIVPCR方法检测敏感度为2.3×103copies/μL（图7），SIVqPCR方法检测的灵敏度为200个拷贝（图8）。通过对2×107至2×102copies/μL6个稀释度样本进行重复性检测，重复性试验的变异系数均小于1%(表8)，表明建立实时荧光RT-PCR方法重复性好，方法稳定可靠。图5SIV巢式PCR特异性试验结果M:DNAMarkerDL2000；1~5泳道:SRV-1、SRV-2、SRV-3、SRV-4、SRV-5，6泳道：STLV；7泳道：SIV；8泳道：阴性对照。图6SIV实时荧光RT-PCR特异性检测结果图7SIV巢式PCR检测方法敏感性试验结果M.为DNAMarkerDL2000；泳道1~9.依次为1×109~1×100copies/μLSIV质粒DNA图8SRV实时荧光RT-PCR敏感性检测表8SIV荧光定量检测方法的重复性实验模板（Copies/well）Ct1Ct2Ct3Ct4Ct5Ct平均值标准差SD变异系数CV%2X10717.2617.3517.2617.2117.2917.270.0510.30%2X10620.220.620.3720.3820.7120.450.2020.99%2X10523.923.423.4623.5623.4823.560.1980.84%2X10427.127.0927.0327.5327.1127.170.2030.75%2X10330.1330.4130.7830.4830.0130.360.3041.00%2X10233.4233.633.7633.833.1533.550.2670.80%SIV实时荧光RT-PCR检测方法在SIV实验感染猴阳性样品中的检测应用:应用SIV实时荧光RT-PCR检测方对SIV实验感染猴感染急性期（1-56day）、无症状潜伏期和ARC期（56-690day）血浆中SIVRNA载量进行了连续采样测定。结果显示所建立的SIVRNA实时荧光RT-PCR检测系统最低检测限度为5000DNA拷贝每反应，Ct值和DNA拷贝数呈线性关系(R2＞0.990图9)。图9SIV感染猴病毒载量的变化SIV实时荧光RT-PCR检测方法在临床样品中的检测应用:对送检的40份猴血样品提取PBMCDNA,进行SIVQPCR检测SIV前DNA，结果如下，阴性、阳性对照成立，而检测样本均未出现阳性扩增，Ct值均大于35，可判定为SIV阴性（图10）。图10临床猴血PBMC样品qPCR检测结果SIV定性分析PCR方法验证：建立方法后，广东省实验动物监测所组织实验室间比对试验，通过提供感染组织样品，由中国医学科学院医学实验动物研究所、苏州西山生物技术有限公司、昆明动物所三家实验间检测方法比对验证，结果广东省实验动物监测所采用团体标准检测的结果与其它三家单位一致。SRVPCR检测方法验证：建立方法后，广东省实验动物监测所组织实验室间比对试验，通过提供感染组织样品，由中国医学科学院医学实验动物研究所、苏州西山生物技术有限公司、昆明动物所三家实验间检测方法比对验证，结果广东省实验动物监测所采用团体标准检测的结果与其它三家单位一致（表9）。表9SIVPCR方法三家验证结果序号委托样本编号检测结果检测方法样本原始信息结果符合性中国医学科学院医学生物学研究所苏州西山生物技术有限公司昆明动物所广东省实验动物监测所1SIV-1阴性样本PCR/qPCRSIV阳性一致一致一致一致2SIV-2阳性样本PCR/qPCRSIV阴性一致一致一致一致5.猴D型逆转录病毒（SRV）巢式PCR检测方法的建立猴D型逆转录病毒属于逆转录病毒科，肿瘤病毒亚科，D型肿瘤病毒属，具有多种血清型SRV-D1，2，3，4，5型。亚洲的猕猴属是SRV的主要宿主，有地方性感染的特征，疾病表现为一系列的亚临床症状及机会感染和肿瘤形成，最终导致免疫抑制，类似AIDS疾病。SRV病毒基因组的复制和转录都需要经过DNA中间体，这种DNA中间体称为前病毒。在临床检测中可通过检测样本中的SRVRNA或前病毒DNA进行诊断。本项目根据GeneBank数据库中登记的SRV基因序列（登录号M11841、M16605、M12349、AF033815），针对SRV-D病毒核酸保守序列gag基因设计2对巢式PCR引物，env基因设计荧光PCR引物和探针序列，通过巢式PCR或实时荧光PCR对cDNA进行扩增，也可以直接提取样本DNA，对SRV-D前病毒DNA进行PCR扩增，根据PCR或实时荧光PCR检测结果判定该样品中是否含有病毒核酸成分。建立SRV荧光定量PCR检测方法，通过优化最佳反应体系和反应条件，构建质粒DNA标准品，进行敏感性、特异性、稳定性试验，以及对临床样本进行临床应用验证和国内其他实验动物检测机构对该方法验证，完成该标准制定。采用建立的SRV巢式PCR方法对SRV-1、SRV-2、SRV-3、SRV-4、SRV-5、SIV、STLV-1前DNA作为模板进行检测，结果显示SRV-1、SRV-2、SRV-3、SRV-4有目的条带，SRV-5和其他病原核酸无目的条带，因此该方法可以检测SRV1-4四种血清型，但会对SRV-5造成漏检（图11）。敏感性检测显示该方法可以检测到100copies/μL质粒DNA标准品（图12）。图11SRV巢式PCR特异性试验结果图M:DNAMarkerDL2000；1~5泳道分别为：SRV-1、SRV-2、SRV-3、SRV-4、SRV-5，6泳道：SRV1-5Mix；7泳道：SIV；8泳道：STLV；9和10泳道：阴性对照。图12SRV巢式PCR检测方法敏感性试验结果M为100bpDNAmark，10-0泳道依次为：1×1010~1×100copies/μL，N泳道为阴性对照。利用建立的SRV巢式PCR检测方法对SRV抗体阳性猴样本进行检测，结果24份样本均为阳性（图13）。图13SRV实验感染猴阳性样品中的检测SRV定性分析PCR方法验证：建立方法后，广东省实验动物监测所组织实验室间比对试验，通过提供感染组织样品，由中国医学科学院医学实验动物研究所、苏州西山生物技术有限公司、昆明动物所三家实验间检测方法比对验证，结果广东省实验动物监测所采用团体标准检测的结果与其它三家单位一致（表10）。表10SRVPCR方法三家验证结果序号委托样本编号检测结果检测方法样本原始信息结果符合性中国医学科学院医学生物学研究所苏州西山生物技术有限公司昆明动物所广东省实验动物监测所1SRV-1阴性样本PCR/qPCRSRV阳性一致一致一致一致2SRV-2阳性样本PCR/qPCRSRV阴性一致一致一致一致（八）采用国际标准和国外先进标准的程度，以及与国际、国外同类标准水平的对比情况，或与测试的国外样品、样机的有关数据对比情况；本标准为国内原创标准，国际上无类似标准。在实验动物质量监测方面，国外一般不制定统一的国家标准，而是由国际组织（如AAALAC、ICLAS、FELASA）推荐各自的实验动物质量控制标准，包括对重要的人兽共患性疾病、动物烈性传染病和对实验结果有严重干扰的病原控制。国外的实验动物生产机构，由于实验动物生产和供应方面产业化程度较高，为了保证实验动物的质量，在竞争激烈的市场上处于有利位置，在遵守国家管理法规的基础上，各个企业参考国际组织的推荐标准来制定自己的标准，具有一定的领先性和权威性。比如世界上最大的实验大、小鼠商品化生产、销售公司-CharlesRiver，它有自己的质量标准，它所制定的标准在全球实验动物领域内得到基本认同，具有一定的代表性。标准编制单位在国家科技支撑计划(2009BAK61B04、2013BAK11B01、2015BAI07B01）,广东省科技计划（2007A060305003、2011B040200010）、广州市科技计划（2060503）等多个国家及省级项目的支持下，成功建立了大鼠、小鼠、豚鼠、犬、猴、兔、禽等8种等实验动物病原微生物PCR检测技术体系，通过临床样本试验证明建立的方法敏感高、特异强、重复性好。标准编制单位以项目中所述方法参加2011、2013、2016年国际实验动物协会（ICLAS）组织的国际实验动物诊断实验室能力评价项目（PEP），所获结果均为满意。该系列检测方法获得了2018年实验动物学会科学技术二等奖，得到了国内实验动物同行一致好评。本项目紧跟国际实验动物质量检测的发展趋势，采用国内外先进的技术方法，重点针对实验动物病原核酸的定性分析在国内首次制定地方标准。标准编制单位以项目中所述方法多次技术能力得到国际同行认可，标准水平不低于国外先进标准，达到国内领先水平，（九）涉及专利的有关说明。本标准内容不涉及专利。（十）专家审定后情况2020年10月22日由广东省科学技术厅组织第二届广东省实验动物标准化技术委员会，对送审稿进行技术审查。经参会委员认真讨论，认为制定的《实验动物病毒PCR定性分析》标准：送审稿、编制说明以及意见汇总处理表等材料完整、详实，符合审查要求，达到报批要求，专家建议在标准规范化描述方面需进一步完善。编制组根据专家建议多次讨论商议，对标准稿进一步修订，并通过多次邮件或电话与专家交流，对标准的名字进行了更改，使得其与标准内容更贴合，并对标准文字进行了进一步规范。2020年10月~2021年5月，专家审定会及审定会后陆续收到专家返回意见71条，采纳65条，部分采纳1条，不采纳5条，2021年5月形成了最终的报批稿。（十一）其他应予说明的事项。什么是PCR假阳性，产生假阳性的原因是什么？假阳性是指对实验材料中阴性目的物检测反而得到阳性结果的现象。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。假阳性主要来源于样本采集、处理、PCR过程中的污染，造成假阳性的原因主要有：（1）样品间交叉污染：非一次性采样器具由于之前采样的痕量残留物含有本次检测的目的核酸而污染本次样品，造成假阳性。盛放样品器具密封不严造成样品间的污染样本污染。样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染。有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。

（2）PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

（3）PCR扩增产物污染：由于PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性，这是PCR反应中最常见的污染问题。还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染，空气与液体面摩擦时可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。气溶胶造成的污染是造成假阳性的主要原因。（4）克隆质粒的污染：常见于用克隆质粒做阳性对照的实验室。由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。如何控制PCR假阳性？（1）在P