禽疫病诊断技术 第2部分：鸡星状病毒-地方标准格式审查稿

ICS65.020.30CCSB4137Diagnostictechniquesforavianinfectiousdiseases—Part2:ChickenastroDB37/TXXXX—2026I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件是DB37/TXXX《禽疫病诊断技术》的第2部分。DB37/TXXX已经发布了以下部分：——第2部分：鸡星状病毒。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：青岛农业大学、青岛市畜牧工作站（青岛市畜牧兽医研究所）、高密市畜牧兽医技术中心。本文件主要起草人：王建琳、郝小静、尹燕博、潘青、王永海、侯冉冉、刘锡武、张灿、衣服德、徐守振、刘爱晶、李方正、张倩、刘开东。DB37/TXXXX—2026动物疫病诊断作为动物疫病防控的重要组成部分，是有效控制疫病发生的先决条件。近年来，国家高度重视动物疫病的预防和控制工作，要求进一步加强疫病监测诊断能力建设。随着新发疫病的不断出现，给养禽业造成了严重的经济损失。山东省是我国的养禽大省，为进一步完善和提升我省家禽主要疫病的诊断方法和监测效率，促进我省家禽养殖业的持续健康发展，起草组围绕目前我省家禽疫病防控的需求，制定了《禽疫病诊断技术》系列标准，拟由以下六个部分组成。——第1部分：家禽圆圈病毒。目的在于开展家禽圆圈病毒的检测，指导家禽圆圈病毒感染的诊——第2部分：鸡星状病毒。目的在于开展鸡星状病毒的检测，指导鸡星状病毒感染的诊断。——第3部分：鸽毛滴虫病。目的在于开展禽毛滴虫的检测，指导鸽子毛滴虫病的诊断。——第4部分：禽波氏杆菌。目的在于开展家禽波氏杆菌的分离、鉴定和检测，指导禽波氏杆菌感染的诊断。——第5部分：鸭乙型肝炎病毒。目的在于开展鸭乙型肝炎病毒的检测，指导鸭乙型肝炎的诊断。——第6部分：水禽呼肠孤病毒。目的在于开展水禽呼肠孤病毒的检测，指导水禽呼肠孤病毒感染的诊断。鸡星状病毒可感染不同年龄的鸡，雏鸡感染后出现生长发育迟滞、白鸡综合征和内脏痛风；种鸡感染后导致鸡胚孵化率降低，给养鸡业造成了严重的经济损失。鸡星状病毒感染在我省鸡群中普遍存在。本文件作为《禽疫病诊断技术》系列标准的一部分，旨在规定鸡星状病毒感染的临床诊断、病毒RT-PCR和病毒多重RT-PCR的技术要求，为鸡星状病毒感染的诊断提供标准，利于临床鸡星状病毒感染诊断工作的开展，促进我省养鸡业的持续健康发展。DB37/TXXXX—20261禽疫病诊断技术第2部分：鸡星状病毒本文件规定了鸡星状病毒感染的临床诊断、实验室诊断和综合判定。本文件适用于鸡星状病毒感染的诊断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4临床诊断4.1流行病学主要通过粪-口途径水平传播感染雏鸡，也可垂直传播。鸡星状病毒主要感染肉鸡，尤其是2周～4周龄肉鸡，在蛋鸡、种鸡群中也可广泛传播。此外，该病毒也可在火鸡、珍珠鸡等其他禽群中传播。4.2临床症状患鸡主要表现羽毛蓬乱、颜色变浅，精神沉郁，站立不稳，排稀便，出现群体生长不均衡或生长发育迟滞综合征。4.3病理变化4.3.1剖检病变主要表现为肠道肿胀，肠黏膜覆盖大量黏液；肝脏局灶性坏死；肾脏肿胀；输尿管增粗，充满白色尿酸盐，严重者心脏、肝脏表面和肾脏有尿酸盐沉积。4.3.2组织学病变肠道绒毛长度明显缩短，隐窝扩张；胆管增生、胆汁淤积、肝细胞坏死；间质性肾炎，伴有广泛的尿酸盐沉积，近曲小管上皮细胞变性、坏死。4.4结果判定DB37/TXXXX—20262符合4.1至4.3特征，可判定为鸡星状病毒感染疑似病例，应进行实验室确诊。5实验室诊断实验室生物安全要求按照GB19489规定执行。5.1RT-PCR5.1.1试剂或材料除非另有规定，所用试剂均为分析纯，所用材料均无RNA酶。5.1.1.1水，GB/T6682，一级。5.1.1.2Trizol裂解液。5.1.1.3三氯甲烷。5.1.1.4异丙醇。5.1.1.575％乙醇。5.1.1.6RT-PCR一步法试剂盒。5.1.1.7一步法RT-PCR缓冲液。5.1.1.8无RNA酶水。5.1.1.9DNA分子量标准（分子大小范围100bp～2000bp）。5.1.1.10PBS缓冲液：配制方法按照附录A中A.1。5.1.1.11Tris-乙酸电泳缓冲液：配制方法按照A.2。5.1.1.121％琼脂糖凝胶：配制方法按照A.3。5.1.1.13RT-PCR引物：见附录B中B.1。5.1.1.14阳性对照：鸡星状病毒核酸样本。5.1.1.15阴性对照：未感染鸡星状病毒的鸡组织，阴性尿囊液或正常鸡源细胞。5.1.2仪器设备5.1.2.1分析天平：精度为0.01g。5.1.2.2PCR基因扩增仪。5.1.2.3核酸电泳仪。5.1.2.4高速冷冻离心机：离心力≥12000g。5.1.2.5核酸电泳仪。5.1.2.6凝胶成像分析系统。5.1.2.7生物安全柜。5.1.2.8高通量组织研磨仪。5.1.3样品的采集、保存和运输5.1.3.1采集5.1.3.1.1棉拭子将无菌棉签用PBS缓冲液浸湿后，轻轻旋转插入泄殖腔深处1.5cm～2cm，稍作停顿并旋转棉签擦拭3次～5次，取出放入1.5mL离心管，加入PBS缓冲液1mL稀释，震荡混匀后弃去棉签，将稀释后的样品置于带有冰袋的样品运输箱内，送至实验室，6000g离心5min，取上清液待检。DB37/TXXXX—202635.1.3.1.2组织取5cm～10cm肠道组织或2g～5g肝脏，加入5mL～10mLPBS缓冲液，使用高通量组织研磨仪研磨匀浆，制成组织悬液，将组织悬液置于10mL离心管内，封口，置于带有冰袋的样品运输箱内，送至实验室，反复冻融2次～3次，6000g离心5min，取上清液待检。5.1.3.2保存和运输样品保存和运输按照NY/T541执行。5.1.4试验步骤5.1.4.1病毒RNA提取5.1.4.1.1取被检样品上清液200μL至1.5mL的离心管中，再加入700μLTrizol裂解液，混匀静置5min。5.1.4.1.2加入140μL氯仿，混匀静置3min，于4℃以12000g离心15min。5.1.4.1.3吸取5.1.4.1.2中上层水相500μL至1.5mL的离心管中之后加入500μL的异丙醇。轻轻翻转混匀，于-20℃条件下沉淀15min，4℃以12000g离心10min，弃去上清。5.1.4.1.4加入1mL75％的冰乙醇，4℃以7500g离心5min，弃上清后瞬离1min，小心吸去管内液体，将离心管在冰上放置7min，晾干。5.1.4.1.5加入30μL灭菌无RNA酶水，充分溶解RNA。提取的RNA立即用于反转录，否则置于-80℃冰箱冻存。5.1.4.1.6采用RT-PCR一步法试剂盒提取病毒RNA，按说明书操作。5.1.4.1.7同样的方法提取设立的鸡星状病毒阳性和阴性组织样品的RNA。5.1.4.2反应配置RT-PCR一步法反应体系，见附录C中C.1。反应条件50℃30min；95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。5.1.4.3扩增产物电泳按照附录A中A.3配置1％琼脂糖凝胶，将RT-PCR产物按编号加入到对应的孔中，每次电泳同时设DNA分子量标准、阴性对照、阳性对照。电压80V～100V或电流40mA～50mA，电泳30min。结束后，由凝胶成像系统观察并拍照记录。5.1.5结果判定5.1.5.1试验成立条件阳性对照品出现362bp扩增条带，同时阴性对照品无扩增条带，证明试验条件成立，扩增产物对照图见附录D中D.1。5.1.5.2判定标准待检样品扩增产物电泳出现362bp目标条带，判为阳性，表明样品中存在鸡星状病毒核酸；待检样品无扩增条带或扩增条带大小与目标条带不一致，判为阴性，表明样品中无鸡星状病毒核酸。5.2多重RT-PCRDB37/TXXXX—202645.2.1试剂或材料5.2.1.1多重RT-PCR引物：鸡星状病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽肾炎病毒RT-PCR检测引物，见5.2.1.2阳性对照：鸡星状病毒、禽肾炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒核酸样本。5.2.1.3阴性对照：未感染鸡星状病毒、禽肾炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒的鸡组织，阴性尿囊液或正常鸡源细胞。其余同5.1.1。5.2.2仪器设备同5.1.2。5.2.3样品的采集、保存和运输同5.1.3。5.2.4试验步骤5.2.4.1病毒RNA提取同5.1.4.1。5.2.4.2反应配置RT-PCR一步法反应体系，其中上游、下游引物分别为三种病毒混合的上游引物、下游引物，见附录C中C.1。反应条件42℃30min；95℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃1min30s，30个循环，5.2.4.3扩增产物电泳同5.1.4.3。5.2.5结果判定5.2.5.1试验成立条件阳性对照品分别出现1577bp（鸡传染性支气管炎病毒）、796bp（禽肾炎病毒）和362bp（鸡星状病毒）扩增条带，同时阴性对照品无扩增条带，证明试验条件成立，扩增产物对照图见附录D中D.2。5.2.5.2判定标准待检样品扩增产物电泳出现362bp、1577bp、796bp目标条带，判为阳性，表明样品中分别存在鸡星状病毒、鸡传染性支气管炎病毒和禽肾炎病毒核酸；待检样品中如出现两条或一条相应大小目标条带，判断为相应病毒核酸存在；待检样品无扩增条带或扩增条带大小与目标条带不一致，判为阴性，表明样品中无鸡星状病毒、鸡传染性支气管炎病毒和禽肾炎病毒核酸。6综合判定6.1鸡群临床症状与第4章中所描述相符，且第5章中鸡星状病毒结果呈阳性，则可判定为鸡星状病毒感染。DB37/TXXXX—202656.2病鸡剖检变化与4.3.1中所描述相符，应通过多重RT-PCR与鸡传染性支气管炎和禽肾炎病毒感染进行鉴别诊断，且第5章中鸡星状病毒阳性，则可判定为鸡星状病毒感染。6.3鸡群未出现第4章中所描述特征，而第5章中鸡星状病毒结果呈阳性，则可判定为鸡星状病毒无症状感染。DB37/TXXXX—20266（规范性）溶液的配制A.1PBS缓冲液（磷酸盐缓冲溶液）称取NaCl8.0g、KCl0.2g、KH2PO40.2g、Na2HPO4•12H2O2.83g，加水定容至1000mL，经（121±2）℃高压蒸汽灭菌15min，4℃冰箱保存备用。A.2Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）（pH8.0）100.0mL，加水至1000mL。临用现配至1×工作浓度。A.31％琼脂糖凝胶称取1g琼脂糖置于锥形瓶中，加入100mL1×TAE缓冲液。加热煮沸至琼脂糖全部融化，冷至50℃~60℃,加入5mg/mL～10mg/mL的溴化乙锭（EB）贮存液或其他商品化可用于琼脂糖凝胶电泳的DNA染料，混匀，倒入插好梳子的电泳板上，凝固后取下梳子，备用。DB37/TXXXX—20267（资料性）引物的设计B.1鸡星状病毒特异性检测引物序列使用时用无RNA酶水稀释至10μM。B.2鸡星状病毒、禽肾炎病毒和鸡传染性支气管炎病毒三重RT-PCR检测用引物序列B.2.1鸡星状病毒使用时用无RNA酶水稀释至10μM。B.2.2禽肾炎病毒上游引物5’-AACCTCTTGACCTGAGAATAAC-3；下游引物5’-CCATACCTCTTTCGTGAACGCC-3’；目的片段796bp。使用时用无RNA酶水稀释至10μM。B.2.3鸡传染性支气管炎病毒上游引物5’-AAGCAGAGCCTTGTCCCG-3’；下游引物5’-CATTTCCCTGGCGATAGAG-3；目的片段1577bp。使用时用无RNA酶水稀释至10μM。DB37/TXXXX—20268（资料性）RT-PC