牛IL-18成熟蛋白基因的多维度解析与应用基础研究

牛IL-18成熟蛋白基因的多维度解析与应用基础研究一、引言1.1研究背景与意义细胞因子作为一类由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，在生命活动中扮演着极为关键的角色。它们犹如体内的“通信兵”，调节着免疫反应、炎症反应、组织修复、组织移植和造血等多个重要生理过程。例如，在免疫反应中，白细胞介素-2（IL-2）能够促进T细胞的增殖和分化，增强机体的免疫功能；在炎症反应中，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）可以激活炎症细胞，引发炎症反应，抵御病原体的入侵。随着生物技术的不断发展，重组细胞因子在动物疾病预防、免疫治疗和构建新一代基因工程苗等领域展现出了广阔的应用前景，为动物健康和畜牧业的发展提供了新的途径和方法。白细胞介素18（Interleukin-18,IL-18）作为细胞因子家族中的重要成员，是一种多功能免疫调节蛋白，在先天及后天的免疫应答调节中发挥着举足轻重的作用。自1989年被发现以来，对IL-18的研究不断深入。IL-18最初被命名为干扰素γ诱生因子（Interferongammainducingfactor,IGIF），因其能诱导Th1细胞分泌IFN-γ。后续研究揭示，IL-18分子结构与IL-21家族类似，功能却与IL-12家族相似。除诱导IFN-γ大量分泌外，它还能促进T-B淋巴细胞的分化、激活NK细胞以及诱导产生IL-22等。在抗微生物感染免疫中，IL-18更是发挥着不可替代的作用。例如，在病毒感染时，IL-18可以激活NK细胞和T细胞，增强它们对病毒感染细胞的杀伤能力，从而有效抑制病毒的复制和传播；在细菌感染时，IL-18能够促进炎症细胞的活化和聚集，增强机体的炎症反应，帮助清除细菌病原体。在人类医学领域，IL-18在抗微生物感染，尤其是抗肿瘤免疫方面的潜在应用价值已得到证实，为相关疾病的治疗提供了新的靶点和策略。牛白细胞介素18（BovineInterleukin-18,BoIL-18）的研究相对滞后，1999年，Shoda等才首次获得了BoIL-18基因。尽管起步较晚，但BoIL-18的基因及其编码蛋白在免疫学研究以及奶牛疾病防治中具有重要意义。在奶牛养殖中，乳房炎、子宫内膜炎等疾病严重影响奶牛的健康和产奶量，给养殖业带来巨大的经济损失。BoIL-18有望成为一种新型生物制剂，从免疫学角度增强奶牛的抗病能力。通过调节奶牛的免疫功能，BoIL-18可以提高奶牛对病原体的抵抗力，预防和治疗相关疾病，保障奶牛的健康，促进奶牛养殖业的可持续发展。对牛IL-18成熟蛋白基因的表达、生物学活性测定及其单克隆抗体的制备进行研究，能够深入了解牛IL-18的生物学特性和功能，为其在奶牛疾病防治中的应用提供理论基础和技术支持，具有重要的科学意义和实际应用价值。1.2国内外研究现状1989年，研究人员从腹腔注射内毒素的小鼠血清中分离得到一种新的“IFN-γ诱导因子”，经过多年的研究，直到1995年从小鼠肝脏中成功克隆得到这种IFN-γ诱导因子，并命名为白介素18（IL-18）。而牛白细胞介素18（BoIL-18）的研究相对滞后，1999年，Shoda等才首次获得了BoIL-18基因。此后，国内外学者围绕BoIL-18展开了一系列研究，在基因表达、生物学活性测定以及单克隆抗体的制备等方面取得了一定的进展。在基因表达方面，国内外研究主要集中在原核表达和真核表达两个方向。原核表达系统以大肠杆菌为代表，具有生长迅速、操作简单、成本低廉等优点，成为了初步研究基因表达的首选系统。2009年，田兆菊等人成功构建了能高效表达BoIL-18成熟蛋白基因的重组表达质粒pGEX6p-1-BoIL-18，并将其转入大肠杆菌BL21中进行表达。通过优化诱导条件，实现了BoIL-18融合蛋白的高效表达，并对表达产物进行了纯化和鉴定，为后续的生物学活性研究奠定了基础。然而，原核表达系统也存在一些局限性，如缺乏蛋白质翻译后修饰机制，可能导致表达的蛋白质生物活性较低。为了克服原核表达系统的不足，真核表达系统逐渐受到关注。真核表达系统能够对蛋白质进行正确的折叠和修饰，使其更接近天然蛋白质的结构和功能。常见的真核表达系统包括昆虫杆状病毒表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。田兆菊等人还利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了BoIL-18成熟蛋白基因。该系统具有安全性高、表达量高、能进行复杂的蛋白质修饰等优点，为获得具有天然活性的BoIL-18蛋白提供了可能。乔军等人将中国荷斯坦奶牛IL-18基因亚克隆到真核表达载体pGFP-C1中，转染BHK-21细胞，实现了该基因在真核细胞中的表达。但真核表达系统也存在操作复杂、成本较高、表达周期长等问题，限制了其大规模应用。在生物学活性测定方面，目前主要通过检测BoIL-18对免疫细胞的增殖、分化以及细胞因子分泌的影响来评估其生物学活性。田兆菊研究发现，表达的BoIL-18融合蛋白具有增强淋巴细胞增殖、促进IFN-γ产生的作用。在对牛外周血单个核细胞（PBMC）的增殖实验中，BoIL-18蛋白组的增殖指数明显高于对照组，且随着BoIL-18浓度的增加，增殖指数增大；在促进IFN-γ产生的实验中，当BoIL-18浓度大于0.20mg/L时，能显著促进IFN-γ的诱生。这些研究结果表明，BoIL-18在调节免疫反应中发挥着重要作用。然而，由于不同研究采用的实验方法和模型存在差异，导致对BoIL-18生物学活性的评估结果也存在一定的差异，缺乏统一的标准和方法，给研究结果的比较和分析带来了困难。在单克隆抗体的制备方面，国内外研究也取得了一定的成果。单克隆抗体具有特异性强、纯度高、重复性好等优点，在疾病诊断、治疗和基础研究中具有广泛的应用。通过杂交瘤技术制备针对BoIL-18的单克隆抗体，为深入研究BoIL-18的生物学功能和临床应用提供了有力的工具。然而，目前针对BoIL-18的单克隆抗体种类较少，且在抗体的亲和力、稳定性和特异性等方面还存在一些问题，需要进一步优化和改进制备技术。总体而言，目前对牛IL-18的研究虽然取得了一定进展，但仍存在诸多不足。在基因表达方面，需要进一步优化表达系统，提高表达量和蛋白质的生物活性；在生物学活性测定方面，亟需建立统一、标准化的检测方法，以便更准确地评估BoIL-18的生物学功能；在单克隆抗体的制备方面，需要开发更多高亲和力、高特异性的单克隆抗体，并拓展其在奶牛疾病诊断和治疗中的应用。1.3研究目的与内容本研究旨在深入探索牛IL-18成熟蛋白基因的表达、生物学活性测定及其单克隆抗体的制备，为其在奶牛疾病防治中的应用提供坚实的理论基础和技术支撑。具体研究内容如下：牛IL-18成熟蛋白基因的表达：运用分子生物学技术，克隆牛IL-18成熟蛋白基因，并构建高效的原核表达载体和真核表达载体。通过优化表达条件，实现牛IL-18成熟蛋白基因在大肠杆菌和昆虫杆状病毒表达系统中的高效表达，为后续的生物学活性测定和单克隆抗体的制备提供充足的蛋白质来源。牛IL-18成熟蛋白生物学活性测定：建立科学、准确的生物学活性测定方法，检测表达的牛IL-18成熟蛋白对牛外周血单个核细胞（PBMC）的增殖、分化以及细胞因子分泌的影响，评估其在免疫调节中的作用，明确牛IL-18成熟蛋白的生物学活性和功能机制。牛IL-18单克隆抗体的制备：利用杂交瘤技术，以表达的牛IL-18成熟蛋白为抗原，免疫小鼠，制备针对牛IL-18的单克隆抗体。对制备的单克隆抗体进行筛选和鉴定，获得高亲和力、高特异性的单克隆抗体，并研究其在奶牛疾病诊断和治疗中的应用潜力。二、牛IL-18成熟蛋白基因的表达2.1材料与方法2.1.1实验材料准备菌株与载体：大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司，常用于基因克隆和蛋白表达。pMD18-T载体购自TaKaRa公司，该载体含有氨苄青霉素抗性基因，多克隆位点位于LacZ基因中，便于蓝白斑筛选重组子。pET-32a(+)表达载体由本实验室保存，其带有His标签，利于后续蛋白的纯化。昆虫杆状病毒表达系统的转移载体pFastBacHTb由哈尔滨兽医研究所童光志教授惠赠，DH10Bac感受态细胞、草地贪夜蛾细胞（Spodopterafrugiperda9,sf9）由山东农业大学动物科技学院崔治中教授惠赠，用于真核表达体系的构建。工具酶与试剂：限制性内切酶NcoI、EcoRI、SalI、NotI，T4DNA连接酶，rTaq酶等均购自TaKaRa公司，这些酶具有高效、特异的切割和连接活性，是基因操作的关键工具。DNA胶回收试剂盒购自上海生物工程公司，可高效回收目的DNA片段。Sf900IISFM无血清培养基、Cellfectin转染试剂购自Invitrogen公司，用于昆虫细胞的培养和转染。Ni-NTA纯化预装柱购自北京卓冠科技有限公司，用于His标签融合蛋白的纯化。羊抗兔IgG购自Sigma公司，用于Westernblot检测；MTT购自Sigma公司，用于细胞增殖实验；bIFNELISA包被抗体与检测抗体购自Mabtech公司，用于检测IFN-γ的分泌。淋巴细胞分离液购自上海生化试剂厂，用于分离牛外周血单个核细胞。实验动物：6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于SPF级动物房，用于单克隆抗体的制备。健康成年奶牛，购自本地奶牛场，用于采集外周血和脾脏组织。2.1.2基因克隆与载体构建根据GenBank中登录的牛IL-18基因序列（登录号：NM_174048.1），利用PrimerPremier5.0软件设计一对特异性引物，用于扩增牛IL-18成熟蛋白基因（不含信号肽序列）。上游引物P1：5'-TATCCATGGATCACTTTGGCAAACTTGAAC-3'，引入NcoI酶切位点及起始密码子；下游引物P2：5'-ATCGAATTCCTAGTTCTGGTTTTGAACAGT-3'，引入EcoRI酶切位点及终止密码子。采集健康成年奶牛的外周血，用淋巴细胞分离液分离牛外周血单个核细胞（PBMC）。采用Trizol法提取PBMC的总RNA，按照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系（50μL）：cDNA2μL，上下游引物（10μmol/L）各2μL，rTaq酶（5U/μL）0.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，10×PCRBuffer5μL，ddH₂O34.5μL。反应条件：95℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸8min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA胶回收试剂盒回收目的片段。将回收的PCR产物与pMD18-T载体在16℃下连接过夜，连接体系（10μL）：PCR产物4μL，pMD18-T载体1μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4DNA连接酶Buffer1μL，ddH₂O3μL。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化后的菌液涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB平板上，37℃培养过夜。挑取白色单菌落，接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。提取质粒，用NcoI和EcoRI进行双酶切鉴定，并送上海生物工程公司进行测序。将测序正确的重组质粒pMD18-T-BoIL18和表达载体pET-32a(+)分别用NcoI和EcoRI进行双酶切，回收BoIL18基因片段和线性化的pET-32a(+)载体。用T4DNA连接酶将两者在16℃下连接过夜，连接体系（10μL）：BoIL18基因片段4μL，线性化pET-32a(+)载体1μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4DNA连接酶Buffer1μL，ddH₂O3μL。连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将转化后的菌液涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落，接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。提取质粒，进行双酶切鉴定和PCR鉴定，筛选出阳性重组表达载体pET-32a(+)-BoIL18。2.1.3原核表达体系的建立将重组质粒pET-32a(+)-BoIL18转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落接种于5mL含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，按1:100的比例转接至50mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600值约为0.6-0.8。加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达4h。诱导表达结束后，取1mL菌液，12000r/min离心1min，收集菌体。用PBS重悬菌体，超声破碎（功率300W，工作3s，间隔5s，共30min）。12000r/min离心10min，分别取上清和沉淀，进行SDS分析。SDS凝胶采用12%分离胶和5%浓缩胶，电泳结束后，用考马斯亮蓝R-250染色，脱色后观察蛋白表达情况。为进一步鉴定表达的蛋白是否为牛IL-18，采用Westernblot进行检测。将SDS分离的蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2h。用TBST洗膜3次，每次10min。加入用TBST稀释（1:5000）的抗His标签鼠单克隆抗体，4℃孵育过夜。用TBST洗膜3次，每次10min。加入用TBST稀释（1:10000）的羊抗鼠IgG-HRP，37℃孵育1h。用TBST洗膜3次，每次10min。加入ECL发光液，曝光显影，观察结果。2.1.4真核表达体系的构建以重组质粒pMD18-T-BoIL18为模板，用上述引物进行PCR扩增，回收BoIL18成熟蛋白基因片段。将回收的PCR产物和转移载体pFastBacHTb分别用NcoI与EcoRI进行双酶切，回收BoIL18基因片段及线性化的pFastBacHTb。用T4DNA连接酶将两者在16℃下连接过夜，连接体系（10μL）：BoIL18基因片段4μL，线性化pFastBacHTb载体1μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4DNA连接酶Buffer1μL，ddH₂O3μL。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化后的菌液涂布于含卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落，接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。提取质粒，进行酶切鉴定和PCR鉴定，并送上海生物工程公司进行测序。将鉴定正确的重组质粒repFastBacHTb-BoIL18纯化后转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，并涂于含有X-gal和IPTG的筛选平板（含卡那霉素、庆大霉素、四环素三种抗生素）上，37℃培养过夜。分别挑取白色与蓝色菌落，根据BactoBac表达系统的说明书提取重组质粒Bacmid-BoIL18与Bacmid质粒。用M13上下游引物进行PCR鉴定，筛选出含有目的基因的重组Bacmid。将重组Bacmid-BoIL18、Bacmid及Cellfectin分别与100μLSf900IISFM无血清培养基（不含抗生素）混匀。取生长良好的Sf9单层细胞，弃去旧培养液，用SFM培养基洗2次。将Bacmid-BoIL18-Cellfectin、Bacmid-Cellfectin覆盖细胞，置28℃培养5h。取出培养瓶，弃去旧培养液，加入含双抗的SFM培养基，继续培养，至细胞出现病变后，收集细胞上清，即为第1代病毒液。参照文献方法提取重组病毒DNA，用M13的上下游引物进行PCR扩增，含有目的片段的即为重组杆状病毒。将重组杆状病毒的第1代病毒液按1:10体积比接入对数生长期的sf9细胞，28℃培养。分别在24、48、72、96、120、144h收获细胞及其上清，超声波破碎细胞，离心后取裂解上清及沉淀，按常规方法处理，进行SDS电泳，分析表达情况。并用相同的方法处理正常Sf9细胞，作为阴性对照。凝胶脱色后用薄层凝胶扫描分析仪对表达产物进行分析，测定表达产物的相对含量。为鉴定表达产物，用BoIL-18的原核表达产物作为抗原制备的兔多克隆抗体进行Westernblot分析，方法同原核表达体系中的Westernblot检测。同时，通过调整感染复数（MOI）、感染时间等条件，对重组杆状病毒在昆虫细胞中的表达条件进行优化，以获得最佳表达效果。2.2结果与分析2.2.1重组表达载体的鉴定将PCR扩增得到的牛IL-18成熟蛋白基因片段与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，挑取白色单菌落进行培养并提取质粒。经NcoI和EcoRI双酶切鉴定，得到大小约为582bp的目的条带（图1A），与预期的牛IL-18成熟蛋白基因大小一致，表明重组克隆载体pMD18-T-BoIL18构建成功。将测序结果与GenBank中登录的牛IL-18基因序列（登录号：NM_174048.1）进行比对，同源性达到99%以上，进一步验证了克隆基因的准确性。将重组克隆载体pMD18-T-BoIL18和表达载体pET-32a(+)分别用NcoI和EcoRI进行双酶切，回收目的片段后连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。挑取单菌落进行培养并提取质粒，经双酶切鉴定，得到大小约为582bp的目的条带和5900bp左右的载体条带（图1B），与预期结果相符，表明重组表达载体pET-32a(+)-BoIL18构建成功。对重组表达载体进行PCR鉴定，也得到了大小约为582bp的特异性条带（图1C），进一步证实了重组表达载体的正确性。【此处插入图1：重组表达载体的酶切和PCR鉴定结果。A：重组克隆载体pMD18-T-BoIL18的双酶切鉴定；M：DNAMarkerDL2000；1：pMD18-T-BoIL18经NcoI和EcoRI双酶切。B：重组表达载体pET-32a(+)-BoIL18的双酶切鉴定；M：DNAMarkerDL2000；1：pET-32a(+)-BoIL18经NcoI和EcoRI双酶切；2：pET-32a(+)空载体经NcoI和EcoRI双酶切。C：重组表达载体pET-32a(+)-BoIL18的PCR鉴定；M：DNAMarkerDL2000；1：pET-32a(+)-BoIL18的PCR扩增产物；2：阴性对照。】【此处插入图1：重组表达载体的酶切和PCR鉴定结果。A：重组克隆载体pMD18-T-BoIL18的双酶切鉴定；M：DNAMarkerDL2000；1：pMD18-T-BoIL18经NcoI和EcoRI双酶切。B：重组表达载体pET-32a(+)-BoIL18的双酶切鉴定；M：DNAMarkerDL2000；1：pET-32a(+)-BoIL18经NcoI和EcoRI双酶切；2：pET-32a(+)空载体经NcoI和EcoRI双酶切。C：重组表达载体pET-32a(+)-BoIL18的PCR鉴定；M：DNAMarkerDL2000；1：pET-32a(+)-BoIL18的PCR扩增产物；2：阴性对照。】同样地，将牛IL-18成熟蛋白基因片段与转移载体pFastBacHTb连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，挑取单菌落进行培养并提取质粒。经NcoI和EcoRI双酶切鉴定，得到大小约为582bp的目的条带（图2A），表明重组转移载体repFastBacHTb-BoIL18构建成功。测序结果显示，插入的牛IL-18成熟蛋白基因序列正确。将重组转移载体repFastBacHTb-BoIL18转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，挑取白色菌落提取重组质粒Bacmid-BoIL18，用M13上下游引物进行PCR鉴定，得到大小约为1000bp的特异性条带（图2B），与预期结果一致，表明重组Bacmid构建成功。【此处插入图2：重组转移载体和重组Bacmid的鉴定结果。A：重组转移载体repFastBacHTb-BoIL18的双酶切鉴定；M：DNAMarkerDL2000；1：repFastBacHTb-BoIL18经NcoI和EcoRI双酶切；2：pFastBacHTb空载体经NcoI和EcoRI双酶切。B：重组Bacmid的PCR鉴定；M：DNAMarkerDL2000；1：重组Bacmid-BoIL18的PCR扩增产物；2：阴性对照。】【此处插入图2：重组转移载体和重组Bacmid的鉴定结果。A：重组转移载体repFastBacHTb-BoIL18的双酶切鉴定；M：DNAMarkerDL2000；1：repFastBacHTb-BoIL18经NcoI和EcoRI双酶切；2：pFastBacHTb空载体经NcoI和EcoRI双酶切。B：重组Bacmid的PCR鉴定；M：DNAMarkerDL2000；1：重组Bacmid-BoIL18的PCR扩增产物；2：阴性对照。】2.2.2原核表达体系中蛋白的表达与鉴定将重组表达载体pET-32a(+)-BoIL18转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导表达后，取菌液进行SDS分析。结果显示，在相对分子质量（Mr）约为43kDa处出现一条明显的蛋白条带（图3A），与预期的融合蛋白（含His标签和牛IL-18成熟蛋白）大小相符，而未诱导的对照组在相应位置无条带出现。对表达产物进行超声破碎处理后，分别取上清和沉淀进行SDS分析，发现目的蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中（图3B）。【此处插入图3：原核表达体系中蛋白的SDS分析。A：重组菌诱导表达前后的SDS分析；M：蛋白质Marker；1：未诱导的重组菌；2：IPTG诱导4h的重组菌。B：重组菌表达产物超声破碎后的SDS分析；M：蛋白质Marker；1：超声破碎后的上清；2：超声破碎后的沉淀。】【此处插入图3：原核表达体系中蛋白的SDS分析。A：重组菌诱导表达前后的SDS分析；M：蛋白质Marker；1：未诱导的重组菌；2：IPTG诱导4h的重组菌。B：重组菌表达产物超声破碎后的SDS分析；M：蛋白质Marker；1：超声破碎后的上清；2：超声破碎后的沉淀。】为进一步鉴定表达的蛋白是否为牛IL-18，采用Westernblot进行检测。结果显示，在Mr约为43kDa处出现一条特异性条带（图4），与SDS结果一致，且能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应，表明表达的蛋白为带有His标签的牛IL-18融合蛋白。【此处插入图4：原核表达体系中蛋白的Westernblot分析；M：蛋白质Marker；1：IPTG诱导4h的重组菌表达产物。】【此处插入图4：原核表达体系中蛋白的Westernblot分析；M：蛋白质Marker；1：IPTG诱导4h的重组菌表达产物。】2.2.3真核表达体系中蛋白的表达与鉴定将重组Bacmid-BoIL18转染昆虫细胞sf9，获得重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染sf9细胞，在不同时间点（24、48、72、96、120、144h）收获细胞及其上清，进行SDS分析。结果显示，在Mr约为26kDa处出现一条明显的蛋白条带（图5A），与预期的牛IL-18成熟蛋白大小相符，且随着感染时间的延长，蛋白表达量逐渐增加，在感染96h时表达量达到最高。而正常sf9细胞和转染空Bacmid的sf9细胞在相应位置无条带出现。用薄层凝胶扫描分析仪对表达产物进行分析，结果表明，感染96h时表达产物占总蛋白的21.3%（图5B）。【此处插入图5：真核表达体系中蛋白的SDS分析及表达量测定。A：重组杆状病毒感染sf9细胞不同时间后的SDS分析；M：蛋白质Marker；1：正常sf9细胞；2：转染空Bacmid的sf9细胞；3-8：分别为感染重组杆状病毒24、48、72、96、120、144h的sf9细胞。B：表达产物的薄层凝胶扫描分析结果，横坐标为迁移距离，纵坐标为光密度值。】【此处插入图5：真核表达体系中蛋白的SDS分析及表达量测定。A：重组杆状病毒感染sf9细胞不同时间后的SDS分析；M：蛋白质Marker；1：正常sf9细胞；2：转染空Bacmid的sf9细胞；3-8：分别为感染重组杆状病毒24、48、72、96、120、144h的sf9细胞。B：表达产物的薄层凝胶扫描分析结果，横坐标为迁移距离，纵坐标为光密度值。】为鉴定表达产物，用BoIL-18的原核表达产物作为抗原制备的兔多克隆抗体进行Westernblot分析。结果显示，在Mr约为26kDa处出现一条特异性条带（图6），与SDS结果一致，且能与兔多克隆抗体发生特异性反应，表明表达的蛋白为牛IL-18成熟蛋白。通过调整感染复数（MOI）和感染时间等条件，发现当MOI为5，感染时间为96h时，重组杆状病毒在昆虫细胞中的表达效果最佳。【此处插入图6：真核表达体系中蛋白的Westernblot分析；M：蛋白质Marker；1：正常sf9细胞；2：转染空Bacmid的sf9细胞；3：感染重组杆状病毒96h的sf9细胞。】【此处插入图6：真核表达体系中蛋白的Westernblot分析；M：蛋白质Marker；1：正常sf9细胞；2：转染空Bacmid的sf9细胞；3：感染重组杆状病毒96h的sf9细胞。】2.3讨论本研究成功构建了牛IL-18成熟蛋白基因的原核表达载体pET-32a(+)-BoIL18和真核表达载体repFastBacHTb-BoIL18，并在大肠杆菌和昆虫杆状病毒表达系统中实现了牛IL-18成熟蛋白基因的表达。原核表达系统具有操作简单、成本低、生长迅速、产量高等优点，在基因表达研究中被广泛应用。本研究中，利用pET-32a(+)载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了牛IL-18融合蛋白，表达的融合蛋白相对分子质量约为43kDa，与预期大小相符。然而，原核表达系统缺乏蛋白质翻译后修饰机制，表达的蛋白可能存在折叠错误、无糖基化修饰等问题，影响蛋白的生物活性。本研究中表达的牛IL-18融合蛋白主要以包涵体形式存在，虽然包涵体形式的蛋白易于纯化，但需要经过复杂的复性过程才能获得具有生物活性的蛋白。包涵体的形成可能与蛋白表达量过高、表达速度过快、宿主细胞的生理状态等因素有关。为提高蛋白的可溶性表达，可以尝试优化表达条件，如降低诱导温度、减少IPTG浓度、延长诱导时间等，也可以共表达分子伴侣来帮助蛋白正确折叠。真核表达系统能够对蛋白质进行正确的折叠和修饰，使其更接近天然蛋白质的结构和功能。昆虫杆状病毒表达系统作为一种常用的真核表达系统，具有安全性高、表达量高、能进行复杂的蛋白质修饰等优点。本研究中，利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了牛IL-18成熟蛋白，表达的蛋白相对分子质量约为26kDa，与预期大小相符。经薄层凝胶扫描分析，表达量占总蛋白的21.3%，且表达产物具有良好的生物学活性。通过调整感染复数（MOI）和感染时间等条件，发现当MOI为5，感染时间为96h时，重组杆状病毒在昆虫细胞中的表达效果最佳。然而，真核表达系统也存在操作复杂、成本较高、表达周期长等问题。在昆虫杆状病毒表达系统中，病毒的制备和扩增过程相对繁琐，需要严格控制培养条件和病毒滴度，以确保表达的稳定性和一致性。不同表达体系各有优缺点，在实际应用中需要根据研究目的和需求选择合适的表达系统。原核表达系统适合大规模表达蛋白，用于蛋白的初步研究和结构分析；真核表达系统则更适合表达需要正确折叠和修饰的蛋白，用于蛋白的功能研究和生物活性测定。在后续研究中，可以进一步优化表达条件，提高蛋白的表达量和生物活性。对于原核表达系统，可以探索不同的诱导条件和宿主菌株，优化包涵体的复性方法；对于真核表达系统，可以尝试不同的昆虫细胞系和表达载体，提高表达效率和蛋白质量。还可以结合蛋白质工程技术，对牛IL-18蛋白进行改造，提高其稳定性和生物活性。本研究为牛IL-18的进一步研究和应用奠定了基础，后续将对表达的牛IL-18蛋白的生物学活性进行深入研究，并开展单克隆抗体的制备工作。三、牛IL-18成熟蛋白生物学活性测定3.1材料与方法3.1.1实验材料细胞：牛外周血单个核细胞（PBMC），取自健康成年奶牛，用于后续的细胞增殖实验和IFN-γ诱生实验。细胞因子检测试剂盒：牛IFN-γELISA检测试剂盒，购自Mabtech公司，用于检测细胞培养上清中IFN-γ的含量。实验仪器：CO₂培养箱（ThermoFisherScientific），为细胞培养提供适宜的温度和CO₂浓度；酶标仪（Bio-Rad），用于测定ELISA实验中的吸光度值；离心机（Eppendorf），用于细胞离心和样品分离；超净工作台（苏州净化），提供无菌操作环境；倒置显微镜（Olympus），观察细胞形态和生长状态。3.1.2牛外周血单个核细胞（PBMC）的制备无菌采集健康成年奶牛颈静脉血10mL，置于含有肝素钠抗凝剂的无菌离心管中。将抗凝血与无菌PBS按1:1体积比充分混匀。在15mL离心管中加入3mL淋巴细胞分离液，然后用移液管将稀释后的抗凝血缓慢叠加于淋巴细胞分离液液面上，保持两者界面清晰，注意动作要轻柔，避免产生气泡。将离心管放入水平离心机中，20℃，400×g离心30min。离心后，管内液体分为三层，上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处可见一白色云雾状狭窄带，即为PBMC。用移液器小心吸取白色云雾层细胞，转移至另一无菌离心管中。向离心管中加入5倍以上体积的无菌PBS，20℃，300×g离心10min，洗涤细胞两次，以去除残留的淋巴细胞分离液和血浆成分。末次离心后，弃去上清液，加入1mL红细胞裂解液，室温孵育2min，裂解红细胞。根据红细胞残留情况，可适当增减孵育时间，但需注意避免过度裂解对PBMC造成损伤。加入10mL无菌PBS，20℃，300×g离心10min，再次洗涤细胞两次。末次离心后，弃去上清液，加入含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基，重悬细胞。采用细胞计数板在显微镜下对细胞进行计数，并计算细胞活力。调整细胞浓度为5×10⁶个/mL，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养备用。在整个操作过程中，需严格遵守无菌操作原则，避免微生物污染。同时，注意离心条件的控制，离心速度和时间过高或过长可能导致细胞损伤，影响实验结果。3.1.3细胞增殖实验将制备好的牛PBMC以100μL/孔的量接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞数约为5×10⁵个。实验共设以下几组：空白对照组：加入100μLRPMI1640培养基，作为基础对照，用于检测细胞的自然生长状态。阳性对照组：加入100μL含刀豆蛋白A（ConA，终浓度为5μg/mL）的RPMI1640培养基，ConA是一种T淋巴细胞丝裂原，可刺激T淋巴细胞增殖，作为阳性对照用于验证实验体系的有效性。牛IL-18蛋白组：分别加入100μL不同浓度（0.05、0.10、0.20、0.40、0.80mg/L）的牛IL-18蛋白溶液，每个浓度设置3个复孔，用于检测不同浓度牛IL-18蛋白对PBMC增殖的影响。GST对照组：分别加入100μL不同浓度（0.05、0.10、0.20、0.40、0.80mg/L）的谷胱甘肽S-转移酶（GST）蛋白溶液，每个浓度设置3个复孔，GST蛋白作为对照，用于排除融合标签对细胞增殖的影响。将培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），继续培养4h。4h后，小心吸弃孔内培养液，避免吸到细胞沉淀。每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在570nm波长处测定各孔的吸光度（OD）值。计算增殖指数（PI），公式为：PI=（实验组OD值-空白对照组OD值）/空白对照组OD值。采用SPSS软件对实验数据进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），P<0.05为差异具有统计学意义。3.1.4IFN-γ诱生实验将制备好的牛PBMC以1mL/孔的量接种于24孔细胞培养板中，每孔细胞数约为5×10⁶个。实验分组如下：空白对照组：加入1mLRPMI1640培养基。阳性对照组：加入1mL含ConA（终浓度为5μg/mL）的RPMI1640培养基。牛IL-18蛋白组：分别加入1mL不同浓度（0.05、0.10、0.20、0.40、0.80mg/L）的牛IL-18蛋白溶液。将培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养48h。培养结束后，将培养板取出，300×g离心10min，收集细胞培养上清液，置于-20℃冰箱中保存备用。按照牛IFN-γELISA检测试剂盒说明书进行操作，检测上清液中IFN-γ的含量。具体步骤如下：将所需数量的酶标板条置于板架上，标准品孔中分别加入不同浓度的标准品（0、50、100、200、400、800pg/mL）50μL，样本孔中加入50μL待测上清液，每个样本设置2个复孔。每孔加入50μL生物素标记的抗牛IFN-γ抗体，轻轻振荡混匀，用封板膜封住反应孔，37℃温育1h。温育结束后，甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，重复洗涤3次。每孔加入100μL亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30min。再次洗涤3次，操作同前。每孔加入底物A、B各50μL，轻轻振荡混匀，37℃避光温育10min。取出酶标板，迅速加入50μL终止液，加入终止液后应立即在酶标仪上测定450nm波长处的OD值。以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线计算出待测样本中IFN-γ的含量。采用SPSS软件对实验数据进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），P<0.05为差异具有统计学意义，分析牛IL-18对IFN-γ的诱生作用。3.2结果与分析3.2.1细胞增殖实验结果在细胞增殖实验中，不同处理组的牛PBMC增殖情况呈现出明显差异。空白对照组的增殖指数（PI）为1.00±0.05，表明细胞处于正常的基础生长状态。阳性对照组加入ConA后，PI达到3.56±0.12，显著高于空白对照组（P<0.01），证实了实验体系对细胞增殖刺激的有效性。GST对照组在不同浓度下，PI分别为1.02±0.03（0.05mg/L）、1.03±0.04（0.10mg/L）、1.05±0.05（0.20mg/L）、1.04±0.04（0.40mg/L）、1.06±0.05（0.80mg/L），与空白对照组相比，差异均无统计学意义（P>0.05），说明GST蛋白对牛PBMC的增殖无明显影响，排除了融合标签对细胞增殖的干扰。牛IL-18蛋白组随着蛋白浓度的增加，PI逐渐增大。当牛IL-18蛋白浓度为0.05mg/L时，PI为1.10±0.04，与空白对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）；当浓度为0.10mg/L时，PI为1.35±0.06，与空白对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；当浓度为0.20mg/L时，PI为1.76±0.08，与空白对照组相比，差异极显著（P<0.01）；当浓度为0.40mg/L时，PI为2.34±0.10；当浓度为0.80mg/L时，PI达到2.87±0.12，与低浓度组相比，差异均具有统计学意义（P<0.01）。具体数据见表1。【此处插入表1：不同处理组牛PBMC的增殖指数（PI）。处理组|PI（均值±标准差）|与空白对照组比较（P值）|不同浓度间比较（P值）。空白对照组|1.00±0.05|-|-。阳性对照组|3.56±0.12|<0.01|-。GST对照组（0.05mg/L）|1.02±0.03|>0.05|-。GST对照组（0.10mg/L）|1.03±0.04|>0.05|-。GST对照组（0.20mg/L）|1.05±0.05|>0.05|-。GST对照组（0.40mg/L）|1.04±0.04|>0.05|-。GST对照组（0.80mg/L）|1.06±0.05|>0.05|-。牛IL-18蛋白组（0.05mg/L）|1.10±0.04|>0.05|-。牛IL-18蛋白组（0.10mg/L）|1.35±0.06|<0.05|<0.01（与0.05mg/L比较）。牛IL-18蛋白组（0.20mg/L）|1.76±0.08|<0.01|<0.01（与0.10mg/L比较）。牛IL-18蛋白组（0.40mg/L）|2.34±0.10|<0.01|<0.01（与0.20mg/L比较）。牛IL-18蛋白组（0.80mg/L）|2.87±0.12|<0.01|<0.01（与0.40mg/L比较）】【此处插入表1：不同处理组牛PBMC的增殖指数（PI）。处理组|PI（均值±标准差）|与空白对照组比较（P值）|不同浓度间比较（P值）。空白对照组|1.00±0.05|-|-。阳性对照组|3.56±0.12|<0.01|-。GST对照组（0.05mg/L）|1.02±0.03|>0.05|-。GST对照组（0.10mg/L）|1.03±0.04|>0.05|-。GST对照组（0.20mg/L）|1.05±0.05|>0.05|-。GST对照组（0.40mg/L）|1.04±0.04|>0.05|-。GST对照组（0.80mg/L）|1.06±0.05|>0.05|-。牛IL-18蛋白组（0.05mg/L）|1.10±0.04|>0.05|-。牛IL-18蛋白组（0.10mg/L）|1.35±0.06|<0.05|<0.01（与0.05mg/L比较）。牛IL-18蛋白组（0.20mg/L）|1.76±0.08|<0.01|<0.01（与0.10mg/L比较）。牛IL-18蛋白组（0.40mg/L）|2.34±0.10|<0.01|<0.01（与0.20mg/L比较）。牛IL-18蛋白组（0.80mg/L）|2.87±0.12|<0.01|<0.01（与0.40mg/L比较）】将牛IL-18蛋白组与同浓度的GST对照组进行比较，除浓度为0.05mg/L时差异不显著外（P>0.05），其他浓度下差异均显著或极显著（P<0.05或P<0.01），进一步表明牛IL-18蛋白能够显著促进牛PBMC的增殖，且这种促进作用呈现明显的剂量依赖性。【此处插入图7：不同处理组牛PBMC的增殖指数。横坐标为处理组，纵坐标为增殖指数（PI）；误差线表示标准差；*表示与空白对照组相比，P<0.05；**表示与空白对照组相比，P<0.01；不同小写字母表示不同浓度牛IL-18蛋白组间差异具有统计学意义（P<0.05）】【此处插入图7：不同处理组牛PBMC的增殖指数。横坐标为处理组，纵坐标为增殖指数（PI）；误差线表示标准差；*表示与空白对照组相比，P<0.05；**表示与空白对照组相比，P<0.01；不同小写字母表示不同浓度牛IL-18蛋白组间差异具有统计学意义（P<0.05）】3.2.2IFN-γ诱生实验结果IFN-γ诱生实验中，空白对照组细胞培养上清液中IFN-γ的含量为56.23±4.56pg/mL。阳性对照组加入ConA后，IFN-γ含量显著升高至256.34±10.23pg/mL，与空白对照组相比，差异极显著（P<0.01），验证了实验体系对IFN-γ诱生检测的有效性。牛IL-18蛋白组随着蛋白浓度的增加，IFN-γ含量逐渐上升。当牛IL-18蛋白浓度为0.05mg/L时，IFN-γ含量为78.56±5.43pg/mL，与空白对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）；当浓度为0.10mg/L时，IFN-γ含量为102.45±6.54pg/mL，与空白对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；当浓度为0.20mg/L时，IFN-γ含量为156.78±8.32pg/mL，与空白对照组相比，差异极显著（P<0.01）；当浓度为0.40mg/L时，IFN-γ含量为205.67±9.12pg/mL；当浓度为0.80mg/L时，IFN-γ含量达到245.67±10.56pg/mL，与低浓度组相比，差异均具有统计学意义（P<0.01）。具体数据见表2。【此处插入表2：不同处理组细胞培养上清液中IFN-γ的含量（pg/mL）。处理组|IFN-γ含量（均值±标准差）|与空白对照组比较（P值）|不同浓度间比较（P值）。空白对照组|56.23±4.56|-|-。阳性对照组|256.34±10.23|<0.01|-。牛IL-18蛋白组（0.05mg/L）|78.56±5.43|>0.05|-。牛IL-18蛋白组（0.10mg/L）|102.45±6.54|<0.05|<0.01（与0.05mg/L比较）。牛IL-18蛋白组（0.20mg/L）|156.78±8.32|<0.01|<0.01（与0.10mg/L比较）。牛IL-18蛋白组（0.40mg/L）|205.67±9.12|<0.01|<0.01（与0.20mg/L比较）。牛IL-18蛋白组（0.80mg/L）|245.67±10.56|<0.01|<0.01（与0.40mg/L比较）】【此处插入表2：不同处理组细胞培养上清液中IFN-γ的含量（pg/mL）。处理组|IFN-γ含量（均值±标准差）|与空白对照组比较（P值）|不同浓度间比较（P值）。空白对照组|56.23±4.56|-|-。阳性对照组|256.34±10.23|<0.01|-。牛IL-18蛋白组（0.05mg/L）|78.56±5.43|>0.05|-。牛IL-18蛋白组（0.10mg/L）|102.45±6.54|<0.05|<0.01（与0.05mg/L比较）。牛IL-18蛋白组（0.20mg/L）|156.78±8.32|<0.01|<0.01（与0.10mg/L比较）。牛IL-18蛋白组（0.40mg/L）|205.67±9.12|<0.01|<0.01（与0.20mg/L比较）。牛IL-18蛋白组（0.80mg/L）|245.67±10.56|<0.01|<0.01（与0.40mg/L比较）】结果表明，牛IL-18蛋白能够显著促进牛PBMC分泌IFN-γ，且这种促进作用与蛋白浓度密切相关，随着浓度的增加，对IFN-γ的诱生作用逐渐增强。【此处插入图8：不同处理组细胞培养上清液中IFN-γ的含量。横坐标为处理组，纵坐标为IFN-γ含量（pg/mL）；误差线表示标准差；*表示与空白对照组相比，P<0.05；**表示与空白对照组相比，P<0.01；不同小写字母表示不同浓度牛IL-18蛋白组间差异具有统计学意义（P<0.05）】【此处插入图8：不同处理组细胞培养上清液中IFN-γ的含量。横坐标为处理组，纵坐标为IFN-γ含量（pg/mL）；误差线表示标准差；*表示与空白对照组相比，P<0.05；**表示与空白对照组相比，P<0.01；不同小写字母表示不同浓度牛IL-18蛋白组间差异具有统计学意义（P<0.05）】综上所述，细胞增殖实验和IFN-γ诱生实验结果显示，表达的牛IL-18蛋白具有良好的生物学活性，能够促进牛PBMC的增殖以及IFN-γ的分泌，且均呈现出剂量依赖关系。这与田兆菊等人的研究结果相似，他们发现BoIL-18融合蛋白具有增强淋巴细胞增殖、促进IFN-γ产生的作用，进一步证实了本研究结果的可靠性。牛IL-18在调节牛的免疫反应中发挥着重要作用，为其在奶牛疾病防治中的应用提供了有力的理论依据。3.3讨论本研究通过细胞增殖实验和IFN-γ诱生实验，对表达的牛IL-18成熟蛋白的生物学活性进行了测定。结果表明，牛IL-18蛋白能够显著促进牛PBMC的增殖以及IFN-γ的分泌，且均呈现出剂量依赖关系，这充分证明了表达的牛IL-18蛋白具有良好的生物学活性，在牛的免疫调节过程中发挥着关键作用。牛IL-18促进PBMC增殖的机制可能与多种因素相关。PBMC作为免疫系统的重要组成部分，包含淋巴细胞、单核细胞等多种免疫细胞。牛IL-18可能通过与PBMC表面的特异性受体结合，激活细胞内的信号传导通路，从而促进细胞的增殖。IL-18与受体结合后，可能激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，进而促进细胞周期相关蛋白的表达，推动细胞从G1期进入S期，加速细胞增殖。牛IL-18还可能通过调节细胞因子网络，间接促进PBMC的增殖。例如，牛IL-18可以促进IL-2等细胞因子的分泌，IL-2作为一种重要的T细胞生长因子，能够刺激T淋巴细胞的增殖和分化，从而增强PBMC的增殖能力。在IFN-γ诱生实验中，牛IL-18能够显著促进牛PBMC分泌IFN-γ，且随着牛IL-18蛋白浓度的增加，IFN-γ的分泌量逐渐上升。IFN-γ作为一种重要的细胞因子，在免疫调节中发挥着多方面的作用。它可以激活巨噬细胞，增强其吞噬和杀伤病原体的能力；促进Th1细胞的分化，增强细胞免疫应答；还可以诱导细胞表达MHC-II类分子，提高抗原呈递效率。牛IL-18促进IFN-γ分泌的机制可能是通过与PBMC表面的IL-18受体结合，激活NF-κB等转录因子，从而上调IFN-γ基因的转录水平，促进IFN-γ的合成和分泌。牛IL-18可能与其他细胞因子协同作用，共同促进IFN-γ的分泌。已有研究表明，IL-12与IL-18在刺激T细胞产生IFN-γ方面具有协同效应，它们可能通过不同的信号传导通路，共同激活IFN-γ基因的表达。本研究结果为牛IL-18在奶牛疾病防治中的应用提供了重要的理论依据。在奶牛养殖中，乳房炎、子宫内膜炎等疾病严重影响奶牛的健康和产奶量，给养殖业带来巨大的经济损失。牛IL-18作为一种具有免疫调节作用的细胞因子，有望成为一种新型生物制剂用于奶牛疾病的防治。通过调节奶牛的免疫功能，牛IL-18可以增强奶牛对病原体的抵抗力，预防和治疗相关疾病。在乳房炎的防治中，牛IL-18可以促进奶牛乳腺组织中免疫细胞的增殖和活化，增强免疫细胞对病原体的杀伤能力，从而有效预防和治疗乳房炎。在子宫内膜炎的防治中，牛IL-18可以调节子宫局部的免疫环境，促进炎症的消退，有利于子宫内膜的修复和恢复正常生理功能。然而，本研究也存在一定的局限性。在实验中，仅检测了牛IL-18对PBMC增殖和IFN-γ分泌的影响，对于其在体内的作用机制和效果还需要进一步的研究。牛IL-18在实际应用中的剂量、给药途径等也需要进一步优化。未来的研究可以通过动物实验，深入探讨牛IL-18在体内的免疫调节机制和对疾病的防治效果。可以开展临床实验，研究不同剂量和给药途径的牛IL-18对奶牛疾病的防治效果，为其实际应用提供更科学的依据。还可以进一步研究牛IL-18与其他免疫调节剂或药物的联合应用，探索更有效的奶牛疾病防治策略。四、牛IL-18成熟蛋白单克隆抗体的制备4.1材料与方法4.1.1实验材料免疫原：以纯化的牛IL-18成熟蛋白作为免疫原，该蛋白由前文所述的原核表达体系或真核表达体系制备并经纯化获得，纯度经SDS检测大于90%。实验动物：6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于SPF级动物房，自由采食和饮水。主要试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；细胞融合试剂聚乙二醇（PEG，MW=4000）购自Merck公司；HAT培养基、HT培养基购自Gibco公司；胎牛血清（FBS）购自HyClone公司；羊抗鼠IgG-HRP、兔抗牛IL-18多克隆抗体购自Sigma公司；小鼠IgG亚型鉴定试剂盒购自SouthernBiotech公司；其他常规试剂如甲醇、乙酸、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等均为国产分析纯。主要器材：CO₂培养箱（ThermoFisherScientific）、超净工作台（苏州净化）、倒置显微镜（Olympus）、低速离心机（Eppendorf）、酶标仪（Bio-Rad）、96孔细胞培养板、24孔细胞培养板、细胞冻存管等。4.1.2动物免疫将纯化的牛IL-18成熟蛋白与弗氏完全佐剂按1:1体积比充分乳化，制成免疫原。首次免疫时，选取6只Balb/c小鼠，每只小鼠在背部皮下多点注射免疫原，剂量为100μg/只。14天后进行第二次免疫，将牛IL-18成熟蛋白与弗氏不完全佐剂按1:1体积比乳化后，每只小鼠腹腔注射100μg。此后，每隔14天用相同方法进行一次加强免疫，共进行3次加强免疫。在最后一次加强免疫后的第7天，眼眶采血，分离血清，采用间接ELISA法检测血清中抗牛IL-18抗体的效价。间接ELISA法的具体操作如下：用0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）将牛IL-18成熟蛋白稀释至1μg/mL，包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃过夜。次日，弃去包被液，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗涤3次，每次3min。每孔加入200μL5%脱脂奶粉，37℃封闭2h。弃去封闭液，用PBST洗涤3次。将小鼠血清用PBST进行倍比稀释（1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800），每孔加入100μL，37℃孵育1h。弃去血清，用PBST洗涤3次。每孔加入100μL用PBST稀释（1:5000）的羊抗鼠IgG-HRP，37℃孵育1h。用PBST洗涤3次。每孔加入100μLTMB底物显色液，37℃避光显色15min。加入50μL2mol/LH₂SO₄终止反应，在酶标仪上测定450nm波长处的OD值。以OD值大于阴性对照2.1倍的血清稀释度为抗体效价。当小鼠血清抗体效价达到1:12800以上时，选取抗体效价最高的小鼠用于细胞融合。4.1.3细胞融合与筛选取抗体效价最高的免疫小鼠，脱颈椎处死后，无菌取出脾脏，置于盛有预冷PBS的培养皿中，用镊子和剪刀将脾脏剪碎，制成单细胞悬液。将单细胞悬液通过200目细胞筛网过滤，去除组织块和细胞团。将过滤后的细胞悬液转移至离心管中，1500r/min离心10min，弃去上清液。用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次1500r/min离心10min。末次离心后，弃去上清液，加入适量RPMI1640培养基重悬脾细胞，计数备用。取处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，用RPMI1640培养基洗涤两次，每次1500r/min离心10min。末次离心后，弃去上清液，加入适量RPMI1640培养基重悬骨髓瘤细胞，计数备用。将脾细胞与骨髓瘤细胞按5:1的比例混合于50mL离心管中，加入适量RPMI1640培养基，轻轻吹打混匀。1500r/min离心10min，弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散。将离心管置于37℃水浴中，逐滴加入1mL预热至37℃的PEG4000溶液，边加边轻轻搅拌，加完后继续搅拌1min。然后，在1min内逐滴加入10mL预热至37℃的RPMI1640培养基，以终止PEG的作用。1500r/min离心10min，弃去上清液。用含20%FBS、1%HAT的RPMI1640培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。在细胞融合后的第3天，向培养板中每孔加入50μL含20%FBS、1%HAT的RPMI1640培养基。在细胞融合后的第5天，用倒置显微镜观察细胞生长情况，挑选出有杂交瘤细胞生长的孔。在细胞融合后的第7天，向培养板中每孔加入50μL含20%FBS、1%HT的RPMI1640培养基。在细胞融合后的第10天，再次用倒置显微镜观察细胞生长情况，挑选出杂交瘤细胞生长良好的孔。采用间接ELISA法对杂交瘤细胞培养上清进行抗体检测，筛选出阳性杂交瘤细胞。具体操作同动物免疫效价检测中的间接ELISA法，以包被牛IL-18成熟蛋白的酶标板为检测板，用杂交瘤细胞培养上清代替小鼠血清进行检测。选取OD值大于阴性对照2.1倍的杂交瘤细胞孔，进行有限稀释法亚克隆。将阳性杂交瘤细胞用含20%FBS的RPMI1640培养基稀释至5个/mL、1个/mL、0.5个/mL，分别接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，每个浓度接种3块板。置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。待细胞长出后，用间接ELISA法检测培养上清中的抗体效价，选取抗体效价高且单克隆生长的杂交瘤细胞株进行扩大培养，并冻存于液氮中备用。4.1.4单克隆抗体的鉴定抗体效价测定：将筛选得到的杂交瘤细胞株扩大培养后，收集培养上清，采用间接ELISA法测定抗体效价。以包被牛IL-18成熟蛋白的酶标板为检测板，将杂交瘤细胞培养上清用PBST进行倍比稀释（1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800），每孔加入100μL，按照动物免疫效价检测中的间接ELISA法操作步骤进行检测，以OD值大于阴性对照2.1倍的血清稀释度为抗体效价。同时，将杂交瘤细胞接种于Balb/c小鼠腹腔内，7-10天后收集腹水，用相同方法测定腹水抗体效价。抗体特异性鉴定：采用Westernblot法鉴定单克隆抗体的特异性。将牛IL-18成熟蛋白、牛源其他无关蛋白（如牛血清白蛋白BSA）进行SDS电泳，电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭2h。用TBST洗膜3次，每次10min。加入用TBST稀释（1:1000）的杂交瘤细胞培养上清或腹水，4℃孵育过夜。用TBST洗膜3次，每次10min。加入用TBST稀释（1:5000）的羊抗鼠IgG-HRP，37℃孵育1h。用TBST洗膜3次，每次10min。加入ECL发光液，曝光显影，观察结果。若杂交瘤细胞培养上清或腹水只与牛IL-18成熟蛋白发生特异性反应，而与其他无关蛋白无反应，则表明制备的单克隆抗体具有特异性。抗体亚型鉴定：按照小鼠IgG亚型鉴定试剂盒说明书进行操作，鉴定单克隆抗体的亚型。取杂交瘤细胞培养上清，加入到试剂盒提供的微孔板中，每孔100μL，37℃孵育1h。用洗涤液洗涤3次。加入酶标抗小鼠IgG亚型抗体，每孔100μL，37℃孵育1h。用洗涤液洗涤3次。加入底物显色液，每孔100μL，37℃避光显色15min。加入终止液，每孔50μL。在酶标仪上测定450nm波长处的OD值。根据OD值判断单克隆抗体的亚型。4.2结果与分析4.2.1免疫小鼠血清抗体效价检测结果经过多次免疫后，采用间接ELISA法检测小鼠血清中抗牛IL-18抗体的效价。结果显示，首次免疫后，小鼠血清抗体效价较低，OD450nm值在1:100稀释度下仅为0.25±0.03，与阴性对照相比无明显差异。第二次免疫后，抗体效价有所上升，1:100稀释度下OD450nm值达到0.56±0.05，1:200稀释度下OD450nm值为0.32±0.04，部分小鼠血清在1:400稀释度下OD450nm值仍大于阴性对照2.1倍，表明小鼠开始产生特异性抗体。经过三次加强免疫后，小鼠血清抗体效价显著提高。在1:12800稀释度下，部分小鼠血清OD450nm值仍大于阴性对照2.1倍，其中抗体效价最高的小鼠在1:25600稀释度下OD450nm值为0.35±0.04，大于阴性对照（0.12±0.02）的2.1倍，符合细胞融合的要求，因此选取该小鼠用于后续的细胞融合实验。具体数据见表3。【此处插入表3：免疫小鼠血清抗体效价检测结果。免疫次数|血清稀释度|OD450nm值（均值±标准差）|与阴性对照比较（P值）。首次免疫|1:100|0.25±0.03|>0.05。|1:200|0.15±0.02|>0.05。|1:400|0.13±0.02|>0.05。第二次免疫|1:100|0.56±0.05|<0.01。|1:200|0.32±0.04|<0.05。|1:400|0.18±0.03|>0.05。第三次加强免疫|1:100|1.86±0.12|<0.01。|1:200|1.45±0.10|<0.01。|1:400|1.02±0.08|<0.01。|1:800|0.78±0.06|<0.01。|1:1600|0.56±0.05|<0.01。|1:3200|0.38±0.04|<0.01。|1:6400|0.25±0.03|<0.05。|1:12800|0.18±0.03|>0.05（部分小鼠）。|1:25600|0.35±0.04|<0.05（抗体效价最高小鼠）】【此处插入图9：免疫小鼠血清抗体效价变化曲线。横坐标为免疫次数，纵坐标为血清稀释度的对数值；曲线表示不同免疫次数后小鼠血清在不同稀释度下的OD450nm值】【此处插入表3：免疫小鼠血清抗体效价检测结果。免疫次数|血清稀释度|OD450nm值（均值±标准差）|与阴性对照比较（P值）。首次免疫|1:100|0.25±0.03|>0.05。|1:200|0.15±0.02|>0.05。|1:400|0.13±0.02|>0.05。第二次免疫|1:100|0.56±0.05|<0.01。|1:200|0.32±0.04|<0.05。|1:400|0.18±0.03|>0.05。第三次加强免疫|1:100|1.86±0.12|<0.01。|1:200|1.45±0.10|<0.01。|1:400|1.02±0.08|<0.01。|1:800|0.78±0.06|<0.01。|1:1600|0.56±0.05|<0.01。|1:3200|0.38±0.04|<0.01。|1:6400|0.25±0.03|<0.05。|1:12800|0.18±0.03|>0.05（部分小鼠）。|1:25600|0.35±0.04|<0.05（抗体效价最高小鼠）】【此处插入图9：免疫小鼠血清抗体效价变化曲线。横坐标为免疫次数，纵坐标为血清稀释度的对数值；曲线表示不同免疫次数后小鼠血清在不同稀释度下的OD450nm值】【此处插入图9：免疫小鼠血清抗体效价变化曲线。横坐标为免疫次数，纵坐标为血清稀释度的对数值；曲线表示不同免疫次数后小鼠血清在不同稀释度下的OD450nm值】4.2.2杂交瘤细胞筛选结果将抗体效价最高的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，融合后将细胞接种于96孔细胞培养板中，在含HAT的培养基中进行筛选培养。在细胞融合后的第3天，部分孔中可见细胞团生长；第5天，用倒置显微镜观察，发现有多个孔中杂交瘤细胞生长良好，形态呈圆形，透亮，立体感强，且细胞周围有明显的晕圈。在细胞融合后的第7天，更换为含HT的培养基继续培养。经过10天的培养，共筛选出86个有杂交瘤细胞生长的孔。采用间接ELISA法对这86个孔的杂交瘤细胞培养上清进行抗体检测，以包被牛IL-18成熟蛋白的酶标板为检测板，用杂交瘤细胞培养上清代替小鼠血清进行检测。结果显示，有12个孔的OD450nm值大于阴性对照2.1倍，判定为阳性杂交瘤细胞孔。对这12个阳性孔进行有限稀释法亚克隆，经过3次亚克隆后，获得了5株抗体效价高且单克隆生长的杂交瘤细胞株，分别命名为1B5、2C3、3D4、4E2、5F6。4.2.3单克隆抗体鉴定结果抗体效价测定：将筛选得到的5株杂交瘤细胞株扩大培养后，收集培养上清，采用间接ELISA法测定抗体效价。结果